Đề tài Enzyme trong công nghệ thực phẩm

O4 NaNO3 NH4NO3 Pepton Dịch thuỷ phân casein 1,200 0,890 0,850 1,500 1,550 1820,7 880,6 810,9 1620,0 1350,0 0,491 0,197 0,163 0,418 0,340 0,560 0,310 0,278 0,410 0,450 0,885 0,560 9,560 0,750 0,800 Saccharose 2% + pectin 2% 1,150 0,920 0,890 1,300 1,450 820,2 590,4 94,8 750,7 7,003 0,163 0,083 Vết 0,160 0,120 0,420 0,280 0,060 0,340 0,370 0,580 0,520 0,320 0,500 0,530 Bảng 3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ 2.1.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác Ngoài nguồn C, N, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo thành phức hệ enzyme này. Trong số đó P là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường. Hàm lượng P trong môi trường phải là 8-10%. Khi sử dụng nguồn N của phốtphát diamon thì nhu cầu về P của nấm mốc hoàn toàn được thỏa mãn. Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến sự tạo ra enzyme pectinase. 2.1.3 Môi trường lên men giống Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek. Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60oC cho đến khi độ ẩm cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng) Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: Cám gạo 65,5% Trấu 21,5% Bột cà rốt 11% (NH4)2SO4 2% Độ ẩm 55%. 2.2 Sơ đồ công nghệ Nguyên liệu Trộn Làm ẩm Thanh trùng bằng nhiệt Làm nguội, làm tơi Gieo giống vi sinh vật Nuôi cấy giống Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy Thu nhận phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem đi sử dụng Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Lọc Bã Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy kết tủa Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Enzyme kết tinh Thuyết minh quy trình : + Nguyên liệu được trộn với nhau. + Làm ẩm : có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của môi trường cám là 58-60%. Khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi làm ẩm 65-68%. Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm thì sẽ bị dính bết ( khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy ), dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp ( bị lên men rượu, lên men giấm…) Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng ( nước ngưng tụ, nước đun sôi để nguội ) để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu. Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn. + Thanh trùng bằng hơi nhiệt : Làm cho môi trường được tinh khiết hơn về phương diện vi sinh vật và làm cho chín ( biến hình ) môi trường ( tinh bột, protein ). Thông thường người ta thanh trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120-1300C trong 2-3 giờ. + Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống : Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết. Vì vậy phải làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy. Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài. Nhiệt độ yêu cầu đạt được để gieo giống là 35-390C. + Nuôi cấy nấm mốc : Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy. Quy trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải thực hiện các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắt khe hơn như : nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp đôi ) để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều. + Tiến hành quá trình nuôi cấy Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi ( mành hay khay đục lỗ ) rồi chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí () cũng như mức độ thông khí. Quá trình nuôi cấy nấm mốc kéo dài 33-48 giờ/mẻ được trải qua 3 giai đoạn : - Giai đoạn 1 : Từ khi nôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ 10-12. Xảy ra sự trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm. Để đảm bảo sự nảy mầm nhanh và hạn chế nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu 55-60%, = 96-100%, T= 30-320C. - Giai đoạn 2 : Kéo dài trong 10-18 giờ. Nấm mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt và trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ chất) dẫn đến hiện tượng kết bánh. Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, nhiệt độ phòng nuôi tăng lên 38-400C. Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-300C cần thông gió ( quạt ) và bão hòa ẩm không khí phòng nuôi. - Giai đoạn 3 : Kéo dài trong 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra enzyme nhiều nhất. Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo. Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khi mấm mốc đạt độ già chín sinh lý và bắt đầu tạo thành bào tử. + Thu nhận chế phẩm enzyme thô Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme pectinase, chế phẩm này được gọi là enzyme thô ( vì ngoài thành phần enzyme ra còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo chế phẩm enzyme pectinase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta cần phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau: - Toàn bộ khối lượng enzyme thô pectinase được đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát ra khỏi tế bào. Phần lớn enzyme pectinase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi thành phần này dễ dàng hơn. - Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thuỷ tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật - Trích ly: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme pectinase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan.Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc(chú ý cần loại bỏ các thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn ). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó chứa nước và các chất hòa tan khác từ khối lượng môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này - Quá trình kết tủa enzyme pectinase : * Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây kết tủa khác. * Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. * Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzyme thô người ta cho 2 đến 2.5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là 4-7oC) theo thời gian các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa dạng paste ( độ ẩm lớn hơn 70%W), ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme pectinase cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt W = 5-8%. Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme pectinase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzyme ta quan tâm. 2.3 Quy trình tách chiết và làm sạch 2.3.1 Giới thiệu chung : Các dạng chế phẩm enzyme: + Chế phẩm thô - Chế phẩm thô từ canh trường lỏng. - Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt + Chế phẩm kỹ thuật Là chế phẩm được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa một vài enzyme chủ yếu. + Chế phẩm tinh khiết Là chế phẩm trong đó chỉ chứa một loại enzyme nhất định với hàm lượng cao Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô. Chế phẩm thô thường chứa những thành phần cơ bản sau: Nước chiếm khối lượng lớn nhất. Protein không có hoạt tính sinh học. Các tạp chất từ tế bào ( nếu là nguồn động vật, thực vật ), từ môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn VSV) Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học cao). Quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu, chỉ nhận sản phẩm cuối là enzyme mong muốn (trong đó phần lớn enzyme tạp đã được loại bỏ). Việc loại ba thành phần đầu không thể cùng thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme mong muốn ra khỏi hỗn hợp, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo. ­ Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme Các kỹ thuật tinh sạch thường đưa lại những kết quả quan trọng sau: + Khối lượng chế phẩm enzyme được giảm dần qua từng bước tinh sạch + Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sử dụng sau này. + Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm. + Tạo những chế phẩm tinh khiết nhằm mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong y học… Tóm tắt các giai đoạn tinh sạch : Các giai đoạn Phương pháp sử dụng Phá vỡ tế bào Cơ học, vật lý, hóa học, sinh học Chiết tách enzyme Nước, acid, kiềm loãng, dung dịch đệm, dung mô hữu cơ Tách các phần tử không hòa tan Ly tâm, lọc Loại các thành phần không phải protein: Chất có phân tử lượng thấp Nucleic acid Lipid Thẩm tích, lọc gel, siêu lọc Sử dụng nuclease, protease Dung môi hữu cơ Tách phân đọan protein và enzyme: Kết tủa Phân tích trong hệ dung dịch hai pha. Gây biến tính hỗn hợp protein Sắc ký Ly tâm Điện di Kết tủa bằng điện Kết tinh Muối dung môi hữu cơ, các hợp chất sinh học đặc hiệu. Sử dụng các dung dịch polimer tan trong nước Sử dụng acid, kiềm, nhiệt độ. Hấp thụ, trao đổi ion, ái lực, lọc gel. Trong gradient nồng độ gel polyacrylamide Trên cột hoặc gel bản mỏng. Bằng muối hoặc bằng dung môi hữu cơ Cô đặc Siêu lọc, đông khô, cô chân không -Siêu lọc -Thẩm tích -Siêu ly tâm Sắc ký trao đổi ion -Sắc ký lọc gel Sắc ký đẳng điện Điện di trên “gel” polyacrylamit Khối lượng phân tử Điện tích ENZYME Vị trí liên kết đặc hiệu Tính hòa tan Tính ổn định Tác động của acid Tác động của nhiệt hoặc kiềm -Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính Sắc ký ái lực Phân ly thể lỏng-lỏng -Kết tủa bằng dung môi hữu cơ -Kết tủa đẳng điện Hình3: Các kỹ thuật tách và tinh chế enzyme theo các đặc tính của chúng 2.3.2 Phưong pháp kết tủa: 2.3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp: Phương pháp kết tủa chỉ hiệu quả khi hàm lượng protein trong dung dịch lớn hơn 100mg/mL. Thông thường đây chỉ là giai đoạn đầu của quá trình tinh sạch: Kết tủa đẳng điện Một protein hay một protein enzyme thường hòa tan ít nhất ở điểm đẳng điện (pI) vì ở pI các phân tử protein enzyme có tổng điện tích bằng 0, tức là không có lực đẩy tỉnh điện, nên các phân tử protein enzyme sẽ kết hợp với nhau tạo ra kết tủa. Vì vậy ta có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm cũng như các enzyme, protein tạp khác. Sau đó lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ kết tủa. Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (phương pháp diêm tích). Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Trong công nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối amonium sulfate. Các thiết bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối này thường được chế tạo bằng thép không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ cũng có nhiều loại, nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi amonium sulfate. Vì vậy sau này thay amonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai dung dịch lại với nhau. Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%. Mỗi loại protein enzyme sẽ có một khoảng nồng độ muối mà protein enzyme đó kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng độ muối tích. Khoảng nồng độ muối tích của các protein enzyme thường không giống nhau. Chúng ta có thể tinh chế enzyme nhờ kết tủa phân đoạn muối trung tính. Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ. Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý tới nhiệt độ nên bắt buộc ta khi tiến hành phải làm lạnh dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme, mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ, thường tiến hành ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Tỉ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác đình bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch. Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzyme bao gồm: ethanol, isopropanol, aceton. Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Khi đó lực hút và lực đẩy tỷ lệ nghịch với hằng số điện môi. Do đó trong dung dịch toàn bộ các protein enzyme và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử lớn khác đều bị kết tủa. Do sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và sẽ lắng xuống. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm: nồng độ dung môi, nhiệt độ, phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzyme. Thay đổi thành phần hóa học của môi trường để làm sạch enzyme. Khi thêm vào môi trường các chất đặc hiệu, người ta thu được kết tủa của một số phân tử VD: sử dụng một số muối kim loại (Mn2+) tác dụng với acid Nucleic sẽ làm dễ dàng cho việc tách các enzyme nội bào. Sử dụng chất trợ kết tủa enzyme. Đối với các enzyme ngoại bào, ở quy mô công nghiệp người ta có thể thêm vào các chất như kisegua, tinh bột, lactose, dextran sulfat.. để làm kết tủa ở dạng hạt, thường dùng các chất này khi có mặt rượu, natri sulffat, acid tanic. Kết tủa bằng các polyme co khối lượng phân tử cao. Các polyme như dextran, polyetylenglycol (PEG) được dùng với nhiều mục đích: chất làm bền, làm đặc, hoặc là chất kết tủa. các phân tử này rất háo nước nên sẽ làm mất nước của các phân tử sinh học dẫn tới làm thay đổi hằng số điện môi của môi trường xung quanh do đó mà ảnh hưởng tới các tương tác không gian của các nhóm háo nước của các phân tử protein dẫn tới việc kết tủa protein việc kết tủa protein phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, pH, lực ion, nồng độ protein và khối lượng phân tử của chúng. 2.3.2.2 Kết tủa đối với pectinase: a) Từ canh trường bề mặt. VSV : Botryti8 cinerea, Penicillium expanrum, và Aspergilus aureus. - 30g mẫu của môi trường được tách với 300 ml nước cất, - Dùng HCl chỉnh pH 5-6. Enzyme được kết tủa bằng hai cách: Cách 1: thêm vào 5 lần thể tích dung dịch ethanol 95%. Cách 2: 70g (NH4)2SO4 /100 ml dịch chiết. VSV: Aspergilus awamori - Sử dụng rượu ethanol (72.5-75%) hoặc isopropanol (55-57%). Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, - Sử dụng muối ammonium sunfat sử dụng có độ bão hòa 0.79.Khi kết tủa bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. - Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-5oC, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó ly tâm để tách kết tủa ra khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản. b) Từ canh trường bề sâu. - Thu dịch lọc canh trường - Phối trộn canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1.3:1, hoặc với ammonium sunfat (50-80% trong muối kết). - Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. - Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0.5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0.25% trọng lượng khô), nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0.11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao. 2.3.3 Phương pháp thẩm tích: a) Nguyên lý Trong quá trình tinh sạch các enzyme, để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như là amoni sulfat sau kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh trong sắc ký ái lực,… người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm (thường bằng solephan). Túi thẩm tích có chứa dịch chiết enzyme, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều Gradient nồng độ. ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch dệm sẽ cân bằng nhau do đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thỉnh thoảng phải thay dung dịch mới. b) Ứng dụng của phương pháp thẩm tích trong tinh sạch pectinase. Chế phẩm pectinase sau khi được kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 được cho vào túi thẩm tích; rồi đặt túi đó vào dung dịch có chứa polymer cacboxyl methyl cellulose, polyetylenglycol (PEG) là những polymer có tính háo nước à cô đặc dung dịch enzyme. 2.3.4 Kết tủa ái lực: Kết tủa ái lực là phương pháp phân tách dựa trên sự tạo phức giữa một phối tử ái lực với protein cần tách nằm trong dịch enzyme thô, sau đó phức này sẽ được kết tủa bằng cách thêm vào một tác nhân hợp lý. Alginate là copolymer của acid guluronic và acid mannuronic, tạo kết tủa với ion Ca2+, đuợc dùng để liên kết với pectinase trong quá trình tinh sạch (đi từ A.niger). Nếu xử lý alginate bằng vi sóng ở nhiệt độ 75oC sẽ làm tăng khả năng chọn lọc, chế phẩm enzyme thu được có tỷ lệ tinh sạch 20 lần và giữ được 83% hoạt tính. Chuẩn bị dung dịch alginate: Alginate được hòa tan vào đệm acetate 0.05M, pH 5.0 với tỉ lệ 2% (w/v). Dung dịch này được đem bảo quản ở 4oC và có thể được pha loãng khi sử dụng Kết tủa ái lực pectinase hai pha bằng alginate - Cho pectinase vào 0.4 ml dung dịch alginate, định mức thành 4ml bằng đệm acetate 0.05%, pH = 5.0. pH của hỗn hợp được chỉnh về 3.8 bằng acid acetic 3M vì đây là pH tối ưu để enzyme kết hợp với alginate. Ủ hỗn hợp ở 25oC trong 1h. Thêm vào 0.4 ml dung dịch CaCl2 1M tạo kết tủaà tách kết tủa bằng máy ly tâm (tốc độ 10000 vòng/phút, trong 10 phút), rửa 3 lần bằng 4ml đệm acetate 0.05M, pH 5.0 có chứa CaCl2 0.1M. - Phức pectinase-alginate thu được đem hòa tan vào 6ml đệm acetate 0.05M, pH 5.0 có chứa NaCl 1M, đem ủ ở 4oC trong 18h. Sau đó, alginate sẽ bị kết tủa và được lấy ra khỏi hỗn hợp. Các muối (NaCl và CaCl2) sẽ đuợc tách bằng cách cho qua cột Sephadex Kết tủa ái lực pectinase ba pha bằng alginate Hòa tan dung dịch enzyme thô với alginate, 1% w/v (alginate đóng vai trò là phối tử liên kết ái lực). Sau khi hòa tan, alginate sẽ liên kết đặc hiệu với pectinase trong dung dịch. Tiếp theo, ta cho vào dung dịch t-butanol (tỉ lệ 1:2, v/v) và cho vào (NH4)2SO4 với tỉ lệ 30% (w/v). Khuấy trộn đều, các pha sẽ được tách ra, khi đó ta sẽ tách pha trung gian là pha có hòa tan phức alginate và pectinase. Rồi đem phức đó đi tách rửa với dung dịch NaCl 1M ở nhiệt độ 40C trong vòng 18 giờ ta sẽ thu được pectinase tinh khiết. Trong phương pháp này, khi sử dụng alginate được ester hóa làm phối tử ái lực có thể đạt được hiệu suất thu hồi 100% với tỷ lệ tinh sạch 4 lần. Nếu kết tủa ái lực bằng alginate 1% cho hiệu suất 52% và tỷ lệ tinh sạch là 10 lần. Mặt khác, sử dụng 0.5% alginate ester hóa cho tỷ lệ tinh sạch chỉ là 7 lần nhưng có thể thu hồi 75% hoạt tính. 2.3.5 Phương pháp sắc ký. 2.3.5.1 Giới thiệu chung Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp chất khác nhau của một hổn hợp. Phép phân tích sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đẵ được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học. Dựa vào các kiểu liên kết người ta chia ra thành các kiểu sắc ký sau Sắc ký lọc gel: (sắc ký loại trừ phân tử) phân đoạn protein theo klg. Sắc ký trao đổi ion:liên kết ion. Sắc ký ái lực: liên kết kỵ nước Sắc ký hấp phụ: liên kết yếu như lk kỵ nước, lk Van der Waals 2.3.5.2 Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay phương pháp loại trừ phân tử) cho phép phân đoạn một số hổn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng. Thực tế ngoài kích thước ra, hình dạng của phân tử cũng có ảnh hưởng. Tuy nhiên thông số này có thể bỏ qua nếu protein trong hổn hợp là hình cầu. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dạng của chúng Pha tĩnh: các hạt gel xốp chứa đầy trong cột Khi cho dung dịch các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn nhất của hổn hợp có đường kính lớn hơn lổ của pha tĩnh, không thể khuếch tán vào bên trong hạt nên bị loại trừ và chúng sẽ đi ra khỏi cột cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel.(V0) Các phân tử bé, ngược lại, sẽ khuếch tán tối đa vào trong hạt gel và thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột.(V1) Còn các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào hạt, thể tích dịch rửa của chúng càng lớn khi quảng đường đi (của chúng) vào bên trong hạt càng dài thì kích thước của chúng càng nhỏ. Hãng và tên thương mại Loại gel Khoảng phân đoạn (mr) Biogel (Bio-Rad) Uetrogele (IBF, Serva) Fractogel (Merk) Sephadex (Pharmacia) Sephacryl (Pharmacia) Sepharose (Pharmacia) Glycophase (Plerce) Polycrylamide (P-type) Agarose (A-type) Agarose/polycrylamide Agarose Vinyl polymer (nhiều loại khác nhau) Dextran Sephacryl/bisacrylamide Agarose Agarose liên kết chéo 1,2 dihydroxypropyl-substituted 100-400000 1000-150 x 106 60000-1.3 x 10625000-20 x 106 100-5 x 106 50-60000 5000-10610000-40 x 106 10000-106 1000-350000 Phương pháp lọc gel thường được ứng dụng để tách các phân tử nhỏ như muối vô cơ và các phân tử nước thông qua cấu trúc mạng lưới của sephadex. Thường phương pháp này chỉ làm tăng độ cô đặc nhưng giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm do các phân tử protein bị kẹt lại giữa các hạt gel. - 300 ml dịch thô enzyme thu được từ canh trường Penicillium viridicatum được gạn vào hai lần thể tích ethanol lạnh đông và bảo quản ở -20oC trong hai giờ. Kết tủa thu được bằng cách ly tâm (20000g/20 phút) hòa tan vào một lượng nhỏ thể tích tris-HCl (50nM, pH = 7.4) rồi cho đi qua cột sephadex G50 (3x100cm) với dung dịch đệm là 50mM HCl pH = 7.4. 2.3.5.3 Sắc ký trao đổi ion. a/ Nguyên tắc Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của các phân tử protein. Phương pháp trao đổi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme trong quy mô công nghiệp Tính chất tích điện của phân tử protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị PH, từ đó người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation. Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein enzyme vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của protein, cũng như trạng thái ion hóa của nhựa trao đổi, PH, lực ion và nhiệt độ. Các nhóm trao đổi ion : Hãng và tên thương mại Loại chất Nhóm trao đổi Anion Cation Cellex (Bio-Rad) Bio-Gel (Bio-Rad) Trisacryl (IBE-Serva) Fractogel (Merk) Sephadex (Pharmacia) Sepharose (Pharmacia) Sephacel (Pharmacia) Cellulose Agarose Polymer tổng hợp Polymer vinyl Dextran Agarose Cellulose DEAE; ECTEOLA; QAE; TEAE; DEAE DEAE DEAE DEAE QAE DEAE DEAE CM phosphoryl CM CM CM; SP CM SP CM Quá trình phân tách trên bao gồm hai giai đoạn: Ø Hấp thụ thuận nghịch protein-enzyme cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống nhau) vào nhựa trao đổi ion. Ø Khử hấp phụ các ion đã được hấp thụ Æ Bằng cách thay đổi PH của dịch rửa sẽ dẫn tới sự thay độ ion hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein Æ Hoặc bằng cách tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh.