Đề tài Giám sát sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên đàn gia cầm tại các chợ của 3 tỉnh Bắc Trung Bộ thuộc dự án VAHIP bằng phương pháp PCR (Real time RT – PCR)

ếp sau 40h, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường. Tia tử ngoại bất hoạt được virus mà không phá hủy được kháng nguyên virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và 60oC/30 phút. Trong phân gia cầm ở nhiệt độ thấp tồn tại ít nhất 3 tháng, trong phủ tạng có thể tồn tại 24 – 39 ngày, nếu bảo quản ở nhiệt độ - 70oC thì có thể tồn tại hàng năm. 2.4. TRUYỀN NHIỄM HỌC 2.4.1. Động vật cảm nhiễm Tất cả các loại chim thuần dưỡng (gia cầm) hoặc hoang dã (đặc biệt là loại thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus cúm type A. Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút). Phần lớn các loại gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A. Ngoài ra, virus cúm type A có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú như lợn, ngựa, thú hoang dã và cả con người. Mỗi một loại kí chủ có vai trò khác nhau trong việc lưu trữ, phân tán và lây bệnh. Có 3 loại kí chủ: - Kí chủ lưu trữ hay mang mầm bệnh: đây là kí chủ thường nhiễm virus nhưng không phát bệnh hoặc phát bệnh rất nhẹ hoặc con non mắc bệnh còn con trưởng thành có thể tạo miễn dịch. Trong trường hợp này, các loại thủy cầm được coi là kí chủ mắc bệnh tuy nhiên còn phụ thuộc vào độc lực của virus. - Kí chủ hứng chịu: đây là loại kí chủ mẫn cảm với virus cúm và đào thải virus ra môi trường ngoài. Loại kí chủ này khi bị nhiễm thường phát bệnh rất nặng và các loại gà (gà, gà tây, gà lôi, đà điểu...) thường được coi là kí chủ hứng chịu. - Ký chủ lệch: là loại động vật hiếm khi bị nhiễm virus. Khi bị nhiễm bệnh nặng thì không hoặc bài thải rất ít virus ra môi trường bên ngoài. 2.4.2. Sự truyền lây bệnh Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hóa. Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo hai phương thức trực tiếp và gián tiếp. - Lây trực tiếp do vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn, nước uống bị nhiễm. - Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những công cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển. Có thể nói đây là phương thức lây truyền chủ yếu. Như vậy virus cúm dễ lây truyền tới những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi... Đối với các virus gây bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự lây truyền chủ yếu qua phân, đường miệng. 2.5. TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH 2.5.1. Triệu chứng Thời gian nung bệnh từ vài giờ đến 3 ngày tùy thuộc vào số lượng, độc lực của virus, đường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm virus gây bệnh. Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn đến 7 ngày và lâu nhất là 14 ngày. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus, số lượng virus, loài nhiễm, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, thành phần không khí...) chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của VSV khác như: E.Coli, virus Newcastle, virus gumboro... Nhìn chung, khi mắc bệnh đàn gia cầm sẽ có triệu chứng: Toàn đàn suy sụp, ũ rủ, lông xù, xơ xác. Nếu nhiễm virus độc lực cao thì gà chết đột ngột không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ tử vong cao có khi đạt đến 100% trong vài ngày. Có các biểu hiện về đường hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và khá điển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, chảy nhiều nước mũi, nước mắt. Mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng và có chiều hướng lan xuống cổ và ức do vậy gà bệnh có động tác vươn cổ ra để thở. Mào dày lên do thủy thũng, tím tía, có nhiều điểm xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thường thâm xám, dưới da vùng chân có điểm xuất huyết. Bên cạnh các triệu chứng về đường hô hấp, gia cầm bị bệnh còn có triệu chứng thần kinh: đi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi, nằm lì bì tụ đống với nhau. Ngoài ra, gia cầm bị bệnh thường tiêu chảy mạnh, phân loãng trắng xanh, sản lượng trứng giảm. 2.5.2. Bệnh tích Bệnh tích bệnh cúm rất đa dạng. Nhìn chung sẽ có các bệnh tích đặc trưng: Mào, yếm sưng to, tím sẫm, phù mí mắt. Phù keo nhầy và xuất huyết cơ đùi (phần giáp đầu gối). Da chân xung huyết, đỏ sẫm. Dạ dày cơ xuất huyết, đôi khi xuất huyết dạ dày tuyến như ở Newcastle Niêm mạc khí quản, niêm mạc đường tiêu hóa viêm cata và viêm tơ huyết. Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy. Dịch nhầy có thể đông đặc như phomat. Các cơ quan nội tạng như màng bao tim, màng gan, màng ruột... viêm tơ huyết. Ruột viêm cata và xuất huyết. Hạch ruột sưng. Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử màu vàng, màu xám. Mỡ vành tim xuất huyết. Với gà trống xuất huyết bên trong dịch hoàn. Gà mái đẻ viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non. Tuyến tụy xuất huyết và hoại tử. Tuyến tụy chuyển sang màu vàng có vết sẫm. 2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN Việc chẩn đoán cúm gia cầm do nhiễm virus cúm type A chủ yếu phải phân lập và định danh virus kết hợp với chẩn đoán dựa trên triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, dịch tễ học và một số phản ứng huyết thanh. 2.6.1.Dựa vào dịch tễ. Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền nhanh và mạnh. Loài mắc bệnh thường là gia cầm và chim. Chim hoang dã là nguồn truyền lây bệnh. Một số động vật có vú cũng có thể mắc bệnh: người, lợn, ngựa... 2.6.2. Dựa vào triệu chứng, bệnh tích 2.6.2.1. Dựa vào triệu chứng Gia cầm bị bệnh thường bị xù lông, ũ rũ, bỏ ăn, giảm đẻ. Đầu, mặt sưng, phù quanh mắt. Mào yếm sưng, xuất huyết. Mắt bị viêm kết mạc và có thể bị xuất huyết. Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết. Có các triệu chứng ở đường hô hấp. Nếu virus có độc lực cao thì gà có thể chết nhanh, gà thường chết trong vòng 24h – 48h sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên. 2.6.2.2. Bệnh tích Xuất huyết lan tràn ở các cơ quan nội tạng. Dưới da vùng đầu, cổ, ngực bị phù thũng. Miệng chứa nhiều dịch. Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhầy. Đường tiêu hóa xuất huyết. Gà đẻ buồng trứng xuất huyết hoặc bị viêm, có nhiều trứng non vỡ. 2.6.3. Phân lập và định danh virus Đây là phương pháp chẩn đoán cơ bản có ý nghĩa quyết định. Để phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não, lách. Sau khi xử lí bệnh phẩm ta tiêm vào phôi gà 9 – 11 ngày tuổi, ấp 37oC trong 7 ngày thì thu hoạch trứng. (Virus cũng có thể phân lập trên môi trường tế bào). Sau khi phân lập được virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng thì có thể giám định virus bằng các HI test để giám định subtyp H và N. Gần đây, phương pháp real – time PCR (RT – PCR ) trực tiếp sử dụng nguồn gen của virus cúm A và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm cũng được đưa vào ứng dụng cho phép chẩn đoán chính xác, tin cậy cao và phân biệt sự hiện diện của các chủng virus cúm A gây bệnh chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm. Ngoài ra còn có các phương pháp chẩn đoán khác như: kỹ thuật ELISA, kỹ thuật khuếch tán trên thạch, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI).... 2.7. PHÒNG BỆNH 2.7.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh 2.7.1.1. Các biện pháp vệ sinh tổng hợp Do đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như đặc tính biến đổi kháng nguyên bề mặt của virus khá phức tạp. Do vậy, để phòng bệnh và ngăn chặn bệnh xảy ra thì các biện pháp vệ sinh thú y tổng hợp như: vệ sinh chuồng trại, khu vực chăn nuôi, thiết bị cho ăn uống....phải được áp dụng định kỳ ở những vùng chưa có dịch. Đối với những vùng nguy cơ có dịch, vùng có dịch thì phải được áp dụng một cách thường xuyên và nghiêm ngặt. 2.7.1.2. Phòng bệnh đối với những địa phương chưa có dịch xảy ra hoặc nguy cơ có dịch. Trong thời gian xảy ra dịch ở các địa phương khác thì các trại chăn nuôi gia cầm giống áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nhằm ngăn cản mầm bệnh đưa vào. Dụng cụ chăn nuôi, xe chuyên chở, dụng cụ bảo hộ lao động và con người ra vào trại phải được vệ sinh, khử trùng. Thức ăn, nước uống, chất độn chuồng phải đảm bảo không chứa mầm bệnh. Trên các trục đường giao thông chính thành lập các chốt kiểm dịch tạm thời nhằm ngăn chặn việc dịch chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm từ các địa phương có dịch vào. Các phương tiện giao thông ra vào phải được tiêu độc. Tăng cường kiểm tra, giám sát phát hiện bệnh và tiêu hủy tất cả gia cầm, sản phẩm gia cầm có nguồn gốc từ các địa phương đang có dịch. Đồng thời tiến hành tổ chức dập dịch nhanh chóng khi còn ở diện hẹp. 2.7.1.3. Khống chế dịch ở các địa phương đang có dịch xảy ra. Là bệnh có tính lây lan nhanh, do vậy chúng ta cần tiến hành chẩn đoán phát hiện bệnh một cách nhanh chóng và chính xác dựa trên triệu chứng, bệnh tích điển hình. Đồng thời tiến hành lấy mẫu xét nghiệm. Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm, do vậy sự bùng phát của bệnh vẫn tuân theo những quy luật chung của quá trình sinh dịch. Do vậy khống chế bệnh chính là tác động vào các khâu của quá trình sinh dịch nhằm phá vỡ vòng truyền lây tác nhân gây bệnh, đó là 3 yếu tố: nguồn bệnh, động vật cảm thụ, yếu tố truyền lây bệnh truyền nhiễm nói chung. Theo khuyến cáo của OIE thì đó là các hoạt động: Loại trừ tác nhân gây bệnh: tiêu hủy gia cầm, sản phẩm gia cầm nhiễm bệnh và tiến hành sát trùng, tiêu độc. Giảm tiếp xúc giữa tác nhân và vật chủ: sử dụng vacxin phòng bệnh, tăng cường chăm sóc nuôi dưỡng nhằm nâng cao sức đề kháng. Thay đổi môi trường sống: thực hiện các biện pháp an toàn sinh học, ngăn chặn tác nhân gây bệnh xâm nhập vào môi trường bằng cách cách ly triệt để toàn bộ khu vực có dịch. Song song với những việc làm đó tiến hành tuyên truyền cho tất cả các chủ vật nuôi gia cầm biết cách phát hiện và phòng bệnh cúm gia cầm. 2.7.2. Phòng bệnh bằng vacxin. 2.7.2.1. Các loại vacxin cúm đang được sử dụng. Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau năm 1996, qua thời gian tiến hóa có xu hướng biến đổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh và thay đổi thành phần nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng vacxin được tạo ra. Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trong chiến lược chế tạo vacxin. Đối với bệnh truyền nhiễm, vacxin được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vacxin không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người. Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vacxin, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Các vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vacxin truyền thống và vacxin thế hệ mới. Vacxin truyền thống. Bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng. Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại vacxin được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vacxin sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng. Vacxin thế hệ mới hay vacxin công nghệ gen: là loại vacxin được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm: Vacxin tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1. Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vacxin. Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vacxin phòng chống virus cúm A/H5N1. Vacxin DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen. Vacxin nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen. Có 3 loại vacxin đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vacxin trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). 2.7.2.2. Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo OIE Các nhà khoa học của tổ chức OIE, WHO... đã khuyến cáo các nước có cúm gia cầm như sau: - Sử dụng vacxin vào mục đích khống chế dịch bệnh cúm gia cầm chỉ là một giải pháp hỗ trợ để dập dịch, khoanh vùng dịch và khống chế dịch và vacxin chỉ hạn chế bài xuất virus cường độc ra ngoài môi trường chứ không loại bỏ được tận gốc bệnh cúm. - Chỉ tiêm phòng vacxin khi thật khẩn cấp. - Để có quyết định tiêm phòng phải dựa vào năng lực và điều kiện sau: Phải có hệ thống chẩn đoán đủ năng lực xác định được cúm gia cầm có độc lực cao (HPAI) hay có độc lực thấp (LPAI). Phải có ngân hàng vacxin đủ các chủng loại kháng nguyên H và N nhằm hạn chế tối đa hậu quả biến chủng virus cúm sau khi tiêm phòng. Phải có hệ thống kiểm soát thú y chặt chẽ từ trung ương đến địa phương nhằm kiểm soát những đàn đã sử dụng vacxin với những đàn chưa sử dụng vacxin. Với những điều kiện trên thì nước ta còn gặp nhiều khó khăn, do vậy việc tiêm phòng, quản lí tiêm phòng chưa được triệt để. Tuy nhiên với những nổ lực của ngành trong năm 2004, 2005 đã có nhiều đề tài, dự án, thử nghiệm và khảo nghiệm vacxin cúm đã được triển khai và thu được kết quả khả quan. Phần IIIĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNGPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG - Gà, vịt bán tại một số chợ của 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên – Huế. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tiến hành thu nhận mẫu. - Xử lí mẫu. - Tiến hành chiết tách RNA. - Tiến hành template mẫu. - Tiến hành làm phản ứng Real time RT – PCR. - Đọc kết quả. - Xử lí số liệu và phân tích kết quả. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nguyên liệu 3.3.1.1. Mẫu thí nghiệm Mẫu swabs được lấy theo công văn hướng dẫn chương trình giám sát cúm gia cầm năm 2010 của dự án VAHIP. 3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu Mẫu được gửi theo quy định của dự án VAHIP. Thường mẫu được gửi đến là mẫu Swab. Phương pháp lấy mẫu Swab: Ngoáy ổ nhớp: cho que ngoáy vào sâu trong hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành hậu môn rồi rút ra cho vào ống chứa dung dịch bảo quản, đậy nắp kín. Ngoáy họng, khí quản: đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu dịch nhầy, sau đó từ từ rút ra rồi đưa và ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. 3.3.1.3. Phương pháp bảo quản mẫu. Sau khi ngoáy ở các lỗ tự nhiên, que ngoáy được bảo quản trong dung dịch BHI ( Brain Heart Influsion). 3.3.1.4. Phương pháp xử lí mẫu Mẫu Swab gộp gửi đến được bảo quản trong dung dịch chứa trong các lọ penicyclin hoặc lọ chuyên đựng mẫu swab. Vortex các lọ trên, sau đó trộn lẫn 2 lọ vào một rồi tiếp tục vortex. Sau đó chia dung dịch trong lọ penicycline đó vào các ống Eppendorf. Tùy vào lượng dung dịch mà chia thành 1 hoặc 2 ống eppendorf. Quá trình trộn lẫn giữa các mẫu chỉ được tiến hành trong 1 lô mẫu. Sau khi xử lí mẫu các ống eppendorf được bảo quản ở nhiệt độ bình thường nếu tiến hành tách RNA ngay sau đó. Nếu mẫu không được tách RNA ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C và trước khi tách mẫu được mang ra rải đông. 3.3.1.5 Dụng cụ, máy móc, hóa chất. - Bộ Micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau. - Bộ kít RNeasy Mini kit Qiagen, hệ thống chiết tách bằng chân không dùng trong chiết tách RNA. - Kít RT – PCR Qiagen one step dùng trong Master mix tạo hỗn hợp cho quá trình nhân gen (nếu có). - Máy Real time RT – PCR Bio – rad hoặc smart cycler và các tube phù hợp với từng máy. 3.3.2. Phương pháp tiến hành phản ứng Real time RT – PCR 3.3.2.1. Nguyên lí phản ứng Real time PCR (RT – PCR). - Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy BIO – RAD, máy có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng. Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT – PCR - Nguyên lí hoạt động của Probe. Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real time RT – PCR là Taqman Probe. Hình 3.1. Cơ chế hoạt động của Taqman probe Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer. Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu. 3.3.2.2. Các bước tiến hành phản ứng Real time RT – PCR. Các bước tiến hành phản ứng được thực hiện theo quy trình chung “hướng dẫn của cục thú y” trong phòng thí nghiệm . Bao gồm các bước: Chiết tách RNA. Chuẩn bị Master mix. Template mẫu. Chạy PCR trên máy Bio – Rad hoặc Smart Cycle. Đọc kết quả 3.3.2.2.1. Quy trình chiết tách RNA Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch đệm RLT bổ sung 2-mecraptoethanol tỷ lệ 1:100 và RPE bổ sung 4 lần thể tích ethanol. Mẫu sau khi được xử lí sẽ tiến hành chiết tách RNA theo các bước sau [9]: Cho 600µl đệm RLT đã được bổ sung 2-mecraptoethanol vào ống eependorf 1,5ml. Chuyển 200µl mẫu vào ống eependorf. Vortex trong 15s sau đó spin ở 5000vòng/phút trong 5s cho lắng xuống. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Cho thêm 480µl ethanol 96 – 100% và 120µl nước Nuclease free water. Vortex 10s rồi ly tâm 9000 vòng/phút trong 5 phút. Lắp khóa van vào hệ thống và gắn cột lọc vào van. Bật máy hút chân không, điều chỉnh khóa van để P = 600. Cho hết toàn bộ mẫu trên vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. Cho 700µl RW1 vào cột lọc, rút hết dung dịch rửa trong cột lọc. Cho 500µl RPE vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. Lặp lại bước 7. Lấy cột lọc ra cho vào ống lọc, li tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút Lấy cột lọc đặt vào ống eppendorf, cho vào cột lọc 50µl đệm DW. Sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 1100 vòng/phút trong 3 phút. Bỏ cột lọc, thu lấy RNA. Sơ đồ chiết tách RNA 600µl đệm RLT 200µl mẫu. Vortex 15s, spin 5000vòng/phút trong 5 phút 480 µl ethanol 96÷100% + 120µl nước free RNase. Vortex 15s ly tâm 9000vòng/phút trong 5 phút Gắn cột lọc và điều chỉnh hệ thống máy hút chân không. Cho toàn bộ mẫu vào cột lọc 700µl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc 700µl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm 1400vòng/phút trong 3 phút Lấy cột lọc cho vào ống eppendorf Ly tâm 1100vòng/phút trong 3 phút. Thu lấy RNA trong ống eependorf 3.3.2.2.2.Master mix Hiện nay Cơ quan thú y vùng III đang sử dụng bộ kít trong phản ứng Realtime RT – PCR là Quiagen one step. Master mix là bước nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất đệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương đồng giữa primer và bộ gen đã chiết tách. Quá trình Master mix được tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau: Chuẩn bị ống Eppendorf , vortex rồi spin các ống nguyên liệu rồi lần lượt cho các chất vào ống eppendorf như sau: Reagent Lượng (µl) DW 10.5 5x Reaction Mix 5 MgCl2 25mM 1.2 d NTP 0.8 P.P.P 1.5 Enzyme mix 1 Tổng 20 Sau khi cho các chất trên vào ống Eppendorf ta tiến hành Vortex và spin trong thời gian 10 – 15giây. 3.3.2.2.3. Template mẫu Template là quá trình chuẩn bị các tube mẫu trước khi chạy trên máy RT – PCR. Trước khi template mẫu, ta chuẩn bị số tube 0,2ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành theo các bước sau: - Cho 20µl hỗn hợp Master mix vào các tube 0,2ml. - Cho 50µl nước Free RNase vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng âm (Negative). - Cho 50µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp Master mix của các tube mẫu. - Cho 50µl mẫu đối chứng (+) vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng dương (Postive). 3.3.2.2.4. Chạy trên máy RT – PCR Trước khi cài đặt, vận hành máy ta đặt các tube vào well (giếng) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích các biểu tượng Bio – rad hoặc smart cycler tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu và cài đặt màu cho probe, chu trình nhiệt... Sau khi khai báo xong thì ta bắt đầu chạy máy. Bộ kit One-step RT-PCR của hãng Qiagen thực hiện phản ứng RT-PCR chạy trên chu trình nhiệt như sau: RT(bước phiên mã ngược) PCR 500C-30phút 40chu kỳ x (95C-10giây+58C-50giây) 95C-15phút 3.3.2.2.5. Đọc kết quả Theo công văn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2010) về việc hướng dẫn chương trình giám sát cúm gia cầm năm 2010 của dự án VAHIP, đối với mẫu giám sát cúm gia cầm là mẫu swab gộp thì được tiến hành như sau: Các mẫu swab gộp sẽ được xét nghiệm để xác định type A (M gene). Nếu dương tính với virus cúm A sẽ tiếp tục xét nghiệm để xác định kháng nguyên H5. Nếu âm tính với H5 thì có thể xác định một số H khác (nếu được sự đồng ý của Dự án). Tất cả các mẫu swab dương tính với kháng nguyên H5 sẽ tiếp tục xét nghiệm tìm kháng nguyên N1; nếu dương tính với kháng nguyên H5 mà âm tính với kháng nguyên N1 thì có thể sẽ xác định N khác (nếu được sự đồng ý của Dự án). Tất cả các mẫu swab dương tính với virus cúm gia cầm H5N1 hoặc dương tính với kháng nguyên N sẽ được gửi tới phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y trung ương để phân lập virus hoặc gửỉ đi nước ngoài để phân tích gene nhằm xác định sự biến chủng của virus. Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 35 Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct > 35 Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dựa trên công văn và hướng dẫn chương trình giám sát Cúm gia cầm của dự án VAHIP năm 2010 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Trung tâm thú y vùng III đã tiến hành cho lấy mẫu swab trên 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên - Huế tại các chợ buôn bán gia cầm khác nhau như sau: Tỉnh Thanh Hóa lấy mẫu ở 5 chợ: Chợ Bản, Chợ Tây Thành, Chợ Đông Thành, Chợ Kim Tân, Chợ Lưu Vệ. Tỉnh Hà Tĩnh lấy mẫu trên 4 chợ: Chợ Nghèn Can Lộc, Chợ Thành phố Hà Tĩnh, Chợ Hội Cẩm Xuyên, Chợ Thị xã Hồng Lĩnh. Tỉnh Thừa Thiên - Huế lấy mẫu trên 5 chợ: Chợ An Lỗ, Chợ Thủy Phương, Chợ Phú Dương, Chợ Hương Chữ, Chợ Xuân Phú. Mẫu sau khi lấy được bảo quản và gửi về phòng chẩn đoán trung tâm thú y vùng III để tiến hành chẩn đoán. Sau khi thu mẫu, tiến hành kiểm tra mẫu thì hầu hết các mẫu đều đạt yêu cầu và chúng tôi tiến hành xét nghiệm theo các bước của phương pháp Real time RT – PCR đã trình bày như trên. Kết quả xét nghiệm được xử lí bằng phần mềm ứng dụng Excel theo công thức: Số mẫu dương tính Tỷ lệ nhiễm(%) = x 100 Tổng số mẫu xét nghiệm 4.1. TỔNG HỢP KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MẪU SWAB 4 THÁNG ĐẦU NĂM 2010 CỦA 3 TỈNH THANH HÓA, HÀ TĨNH VÀ THỪA THIÊN – HUẾ. Trong năm 2010 các tỉnh thuộc dự án VAHIP trong đó có tỉnh Thanh Hóa, tỉnh Hà Tĩnh, tỉnh Thừa Thiên – Huế tiếp tục thực hiện việc giám sát lưu hành virus và mẫu được lấy tại các chợ khác nhau. Bằng phương pháp xét nghiệm là realtime RT – PCR, kết quả xét nghiệm mẫu swab 4 tháng đầu năm 2010 của 3 tỉnh Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Thừa Thiên – Huế được thể hiện ở bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả xét nghiệm mẫu 4 tháng đầu năm 2010 của 3 tỉnh Tỉnh Kết quả xét nghiệm Số mẫu xét nghiệm Loại gia cầm M H5 N1 Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Tỉnh Thanh Hóa Tháng 1 60 Vịt 15 25,00 2 3,33 0 0 Tháng 2 60 Vịt 0 0 0 0 0 0 Tháng 3 60 Vịt 8 13,33 5 8,33 5 8,33 Tháng 4 60 Vịt 2 3,33 1 1,67 1 1,67 Tổng 240 Vịt 25 10,42 8 3,33 6 2,50 Tỉnh Hà Tĩnh Tháng 1 48 Gà 0 0 0 0 0