Đề tài Góp phần khảo sát thành phần hóa học của trái mướp đắng

22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' 1" 2"3" 4" 5" 6" ™ Momordicoside D − Là 3-O-β-gentiobioside của cucurbita-5,24-dien-3 β,22,23-triol. − Công thức chung: C42H70O13; M = 782 đvC; mp = 199 – 203oC; [α]20D = -126o. − Công thức cấu tạo: O O O O H OH OH OH OH OH OH HOHO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' 1" 2"3" 4" 5" 6" OH 2.2.2.2. Các triterpene glycoside được cô lập từ trái mướp đắng [25, 26, 27,28,31,33] ™ Momordicoside F1 − Là 3-O-β-D-glucopyranoside của 5,19–epoxy-25-methoxy-5β-cucurbita-6,23- dien-3β-ol. − Công thức chung: C37H60O8; M = 632 đvC; kết tinh trong MeOH–H2O (1:1) cho tinh thể hình kim, không màu; mp = 198 – 203oC; [α]20D = -11o. 20 − Công thức cấu tạo: O O HO OMe OH OH HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O ™ Momordicoside F2 − Là 3-O-β-D-allopyranoside của 5,19-epoxy-5β-cucurbita-6,23-dien-3β,25-diol. − Công thức chung: C35H58O8; M = 618 đvC; kết tinh trong acetone-nước cho tinh thể hình vảy, không màu; mp = 155 – 158oC. − Công thức cấu tạo: O O HO OH OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O OH HO ™ Momordicoside G − Là 3-O-β-D-allopyranoside của 5,19 –epoxy-25-methoxy-5β-cucurbita-6,23- dien-3β-ol. − Công thức chung: C37H60O8; M = 632 đvC; kết tinh trong CH3CN-H2O cho tinh thể hình kim, không màu; mp = 183 – 187oC; [α]20D = -107.3o. 21 − Công thức cấu tạo: O O HO OMe OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O OH HO ™ Momordicoside I − Là 3-O-β-D-glucopyranoside của 5,19 –epoxy-25-methoxy-5β-cucurbita-6,23- dien-3β,25-diol. − Công thức chung: C36H58O8; M = 618 đvC; kết tinh trong MeOH 50% cho chất bột màu trắng; mp = 210 – 216oC; [α]20D = -110o (C=1.00; MeOH). − Công thức cấu tạo: O O HO OH OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O OH HO ™ Momordicoside K − Là 3-O-β-D-glucopyranoside của 3β, 7β-dihydroxy -25-methoxy cucurbita-5,23- dien-19-al. − Công thức chung: C37H60O9; M = 648 đvC; kết tinh trong MeOH cho tinh thể hình kim, không màu, vị đắng; mp = 236 – 237oC; [α]20D = 63.3o. 22 − Công thức cấu tạo: HO OMe 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O 1' 2'3' 4' 5' 6' OHC O HO OH OH HO ™ Momordicoside L − Còn có tên là 7-O-β-D-glucopyranoside của 3β,7β,25-trihydroxy-cucurbita-5,23- dien-19-al. − Công thức chung: C36H58O9; M = 634 đvC; kết tinh trong CHCl3-MeOH cho tinh thể hình kim, không màu, vị đắng; mp = 227 – 232oC; [α]20D = +57.3o. − Công thức cấu tạo: HO OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O 1' 2'3' 4' 5' 6' OHC O HO OH OH HO 2.2.2.3. Các triterpene glycoside được cô lập từ lá và dây mướp đắng ™ Cucurbitan triterpenoid I 23 − Là 3β,7 β,23-trihydroxycucurbita-5,24-dien-7-O- β-D-glucoside. − Công thức chung: C36H60O8; M = 620 đvC; dạng bột vô định hình, [α]20D = +89o (C=0.43; MeOH). − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O O OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' HO OH OH ™ Cucurbitan triterpenoid II − Là 3β,7 β,23-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien–19-al. − Công thức chung:C30H48O4; M = 472 đvC; dạng bột vô định hình, [α]26D = +58.0o (C=0.48; MeOH). − Công thức cấu tạo sau: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH CHO OH ™ Cucurbitan triterpenoid III 24 − Là 3β,7 β-dihydroxy-25-methoxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al. − Công thức chung: C31H50O4; M = 486 đvC; dạng bột vô định hình; [α]26D = +48.9o (C=0.45; MeOH). − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH CHO OMe ™ Momordicine I − Là 3β,7 β,23ξ-trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al. − Công thức chung: C30H48O4; M = 472 đvC; mp = 125 – 128oC ; [α]20D = +81.3o. − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH OHC OH ™ Momordicine II − Là 23-O-β-glucopyranoside của 3β,7β,23ξ-trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al. − Công thức chung: C36H58O9; M = 634 đvC; kết tinh trong CHCl3 cho tinh thể dạng bột không màu. 25 − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH OHC O O OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' HO OH ™ Momordicine III − Là 23-O- β-glucopyranoside của 3β,7β,23ξ-trihydroxy-24-oxo-cucurbita-5,25- dien-19-al. − Công thức chung: C36H56O10; M = 648 đvC. − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH OHC O O OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' HO OH O 2.2.3. Tác dụng dược lý Theo y học hiện đại, mướp đắng có tác dụng: − Diệt vi khuẩn và virus, chống lại các tế bào ung thư, hỗ trợ đắc lực cho bệnh nhân ung thư đang chữa bằng tia xạ. 26 − Chống các gốc tự do – là nguyên nhân gây lão hóa và phát sinh các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tổn thương thần kinh, viêm đường tiết niệu, đái tháo đường. − Tăng oxy hóa glucose, ngăn chặn sự hấp thu glucose vào tế bào. Ức chế hoạt tính các men tổng hợp glucose. − Có tác dụng sinh học giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin. − Có tác dụng tốt với người mắc bệnh đái tháo đường type 2. Hỗ trợ tăng tác dụng, giảm liều và giảm tác dụng phụ của các loại sulfamid trị đái tháo đường type 2. Dịch chiết trái mướp đắng có khả năng ức chế khối u hỗ trợ men gan, chữa được nhiều bệnh như đái tháo đường, lách, gan, khớp, gout ….[14, 30] Theo tài liệu , cao MeOH 50% từ trái mướp đắng cho tác dụng hạ đường huyết 25% (liều dùng 30mg/kg), cao butanol cho kết quả là 34% với liều dùng như trên. Các tác giả này cho rằng các hợp chất phân cực, tan nhiều trong butanol có khả năng làm giảm đường huyết. Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết insulin từ tuyến tụy. Nghiên cứu in vivo trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan cho thấy, khi dùng nước ép trái mướp đắng với liều dùng 6ml/kg B.W cho kết quả tối ưu, làm giảm lượng đường máu ở thỏ bình thường sau 2 giờ và tăng trở lại sau 3 giờ. Tuy nhiên ở thỏ mắc bệnh, lượng đường máu tiếp tục giảm tới 4 giờ sau khi cho uống rồi mới bắt đầu tăng trở lại .[33] Theo báo cáo của Đại học Y khoa Calcuta (Ấn Độ), đã thử nghiệm cho 6 bệnh nhân đái tháo đường type 2 uống mỗi ngày một lần 100ml nước sắc mướp đắng tươi. Sau 3 tuần lễ uống thuốc liên tục, đo lượng đường trong máu (khi đói) đã giảm được 54% so với ban đầu. Sau 7 tuần dùng thuốc, cả 6 bệnh nhân đều không thấy đường trong nước tiểu, lượng đường trong máu như người bình thường. ™ Tác dụng dược lý của charantin Giới thiệu[32] 27 Charantin là một hỗn hợp 2 steroid glycoside được công bố là một trong những hoạt chất có hoạt tính kháng đái tháo đường type 2, được chiết tách và cô lập từ trái mướp đắng. Năm 1962, Lotlikar và Rao lần đầu tiên cô lập được charantin với hàm lượng khoảng 0.01%. Đến năm 1965, Sucrow đã xác định được đây là một hỗn hợp 2 steroid glycosides (tỉ lệ 1:1) gồm 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene và β- sitosterol-3-O-β-glucoside , với công thức lần lượt như sau: O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O CTPT: C35H58O6 (M = 574) O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O CTPT: C35H60O6 (M = 576) Năm 1966, Lotlikar và Rao đã đưa ra qui trình chiết xuất charantin với hàm lượng cao hơn, đồng thời công bố về hoạt tính kháng đái tháo đường của hoạt chất này, được phân lập từ dịch chiết EtOH của trái mướp đắng khô . 28 Sau đó đến năm 1979, Pugazhenthi và Suryanarayana Murthy đã khẳng định một lần nữa charantin là hỗn hợp 2 chất và hoạt tính sinh học của nó vẫn có thể mất đi trong quá trình chiết xuất kéo dài [32]. Hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan: − Chọn thỏ ở cả con đực và con cái với trọng lượng cơ thể vào khoảng 1.5 – 3kg, được gây đái tháo đường bằng cách tiêm Alloxan qua tĩnh mạch với liều lượng 200mg/kg. Chỉ có 4 trong 20 con còn sống sau 5 ngày được tiếp tục đem đi khảo sát. − Charantin hòa tan trong Tween 80 với nồng độ 0.3%. Xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch 5ml dung dịch này. Mức đường huyết giảm dần từ giờ thứ nhất đến giờ thứ tư sau khi xử lý, nhưng sau đó sẽ từ từ lấy lại mức ban đầu. − Hoạt tính của charantin có hiệu lực hơn 5 giờ, cao nhất ở giờ thứ tư, được ghi nhận là có tác động như nhau ngay cả khi xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch. Với liều 50mg/kg cho uống làm giảm 42% lượng đường huyết ở giờ thứ tư và giảm còn 28% ở giờ thứ năm sau xử lý. Tuy nhiên khi sử dụng với liều lượng 25mg/kg cho uống sẽ cho kết quả giảm đường huyết tương tự chỉ với liều dùng 15mg/kg tiêm qua tĩnh mạch. [32] Charantin cho hoạt tính giảm đường huyết cao hơn Tolbutamide, một loại thuốc thông thường để chữa đái tháo đường, với cùng liều dùng. Mặc dù cách thức thay đổi glucose huyết khi xử lý ở cả 2 trường hợp đều giống nhau. Tuy nhiên việc charantin có phải là chất duy nhất trong trái có hoạt tính giảm đường huyết hay không vẫn còn là vấn đề đang được đặt ra. Vì giả sử để có được 50mg charantin cần tới hơn 1.5kg trái tươi. Trong khi theo các nghiên cứu, chỉ với liều dùng 50 – 60ml nướp ép trái hàng ngày đã cho kết quả lâm sàng tốt, chứng tỏ không phụ thuộc hoàn toàn vào rất ít khối lượng của charantin có trong đó. MAP, một protein kháng siêu vi khuẩn, có ức chế nhiễm virus HIV-1 ở tế bào lympho T và bạch cầu đơn nhân to, nó không độc với tế bào bình thường không bị nhiễm. Hạt và vỏ trái chứa một chất nhựa, một saponin glycoside, và những alkaloid gây nôn và tiêu chảy. Nhiều protein có hoạt tính dược lý được phân lập từ hạt , như các protein α–momorcharin và β–momorcharin có tác dụng độc hại gan trên tế bào gan chuột cô lập. Ở Trung Quốc, người ta đã phân tách được hai hoạt chất hạn chế sinh sản là α– protein và β–protein từ hạt. Các thí nghiệm nuôi cấy, ghép phôi in vitro cho thấy 2 hoạt 29 chất này có tác dụng ức chế quá trình làm dày đặc nguyên bào phôi trước khi làm tổ và hình thành phôi ở thai kỳ đầu, từ đó phôi ngừng phát triển, thoái hóa phân hủy dẫn đến sẩy thai [13]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy α–protein và β–protein cũng có ảnh hưởng đến sự sinh sản của phôi chuột nhắt trắng và ảnh hưởng đến việc tổng hợp phân tử lớn tế bào nội mô tử cung; chúng cũng có khả năng ức chế tổng hợp ADN, ARN và protein, làm cho sự phát triển của nội mạc tử cung bị ức chế [13]. 30 THỰC NGHIỆM 1. NGUYÊN LIỆU Mướp đắng do Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Dược liệu miền Trung cung cấp, là loại mướp đắng còn non, hạt chưa phát triển. Trái được cắt thành lát mỏng, sấy ở nhiệt độ dưới 60oC trên hệ thống sấy nguyên liệu đến khối lượng không đổi. Tiếp đó, nguyên liệu được xay nhuyễn để quá trình tách chiết được triệt để hơn. Hình 2.1: Quá trình sấy nguyên liệu 2. NHẬN DANH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG Để giúp cho việc nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất hoạt chất từ cây thuốc, trước hết cần phải tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để chúng ta có khái niệm sơ bộ về mặt định tính, từ đó có thể định hướng cho việc chiết xuất cũng như việc xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trong cây thuốc. Từ mẫu cây, sử dụng kỹ thuật chiết tách khác nhau để có được cao chiết ethanol toàn phần hoặc các loại cao có tính phân cực khác nhau. Áp dụng các phương pháp phân tích sơ bộ về hóa- thực vật để biết trong cao chiết có thể chứa các loại hợp chất tự nhiên nào. Trong báo cáo này, em xin trình bày về phương pháp sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc xuất hiện kết tủa mà em đã thực hiện. 31 2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid [7, 11] 2.1.1 Thuốc thử alkaloid Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid. * Phản ứng tạo kết tủa có màu: − Thuốc thử Mayer: • Công thức: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%. • Dấu hiệu: Tạo kết tủa vô định hình màu trắng vàng. − Thuốc thử Dragendoff: • Công thức: + Dung dịch A: 850mg Bismut nitrat trong 40ml H2O và 10ml acetic băng. + Dung dịch B: Hòa tan 8g KI trong 20ml H2O. Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử. • Dấu hiệu: Tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ. − Thuốc thử Wagner: • Công thức: Hòa tan 5g Iod trong 100ml dung dịch KI 10%. • Dấu hiệu: Cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen. − Thuốc thử Bouchardat: • Công thức: 2.5g Iod và 5.0g KI hòa tan trong 10ml nước cất. • Dấu hiệu cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm. 2.1.2 Định tính alkaloid Thí nghiệm: Tẩm 10g bột trái mướp đắng bằng 5ml dung dịch NH4OH 25%. Đậy kín bằng giấy lọc rồi để qua đêm. Sau đó đem chiết với 25ml CHCl3. Dịch CHCl3 được lắc với 10ml dung dịch H2SO4 2%. Lấy dịch acid làm mẫu thử. -Với thuốc thử Wagner: Cho kết tủa màu nâu. 32 -Với thuốc thử Mayer: Dung dịch có màu trắng đục. 2.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid [6, 7] 2.2.1 Thuốc thử flavonoid Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetate chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với FeCl3. Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Cindin của Willstater. Thuốc thử là tập hợp các hóa chất gồm: dung dịch HCl đậm đặc, bột Mg kim loại, rượu isoamyl [CH3(CH3)CHCH2CH2CH2OH]. 2.2.2 Định tính flavonoid Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột trái mướp đắng trong 50ml EtOH 95o trong 30 phút. Lọc, lấy 1ml dịch EtOH vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg vào lắc thì thấy dung dịch có màu tím. 2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất anthraglycoside 2.3.1 Thuốc thử anthraglycoside Anthraquinon (phản ứngBotrager): Pha hữu cơ của dịch chiết anthraquinon sẽ có màu đỏ khi có sự hiện diện của chất kiềm. Do vậy dạng kết hợp phải được thủy phân và chuyển sang dạng oxy hóa trước khi thực hiện phản ứng. Anthron và anthranol: − Phản ứng Schouteten: Cho huỳnh quang xanh với natri borat. − Phản ứng tạo màu xám với natri nitrodimethyl alanin. 2.3.2 Định tính anthraglycoside [7 ] Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột trái mướp đắng trong 30ml ether ethyl. Lọc và lặp lại nhiều lần cho đến khi dịch ether không còn màu. Tập trung dịch lọc và lắc với 50ml dung dịch KOH 10%. Lớp kiềm được trung hòa với dung dịch HCl 25% đến pH=7. Lọc, lấy phần kết tủa trên giấy lọc, đem hòa tan bằng EtOH 95o. Nhỏ vài giọt dung dịch KOH 10% vào dịch EtOH thấy có màu vàng cam. 33 Bã sau khi đã loại các chất tan trong ether được chiết tiếp với EtOH 95o. Nhỏ vào dịch EtOH vài giọt KOH 10% thấy có màu đỏ cam. 2.4.Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid [6, 7] 2.4.1 Thuốc thử steroid − Liebermann-Burchard: − Anhydrid acetic: 20ml. H2SO4 đậm đặc: 1ml. Cho 1 giọt thuốc thử vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ có màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ bền vững trong một thời gian. − Phản ứng Rosenheim: Cho vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90% vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ xuất hiện màu tím, sau 20 phút chuyển sang màu xanh lơ. − Salkowski: Dung dịch tách làm 2 lớp: Lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ. 2.4.2 Định tính steroid Thí nghiệm: Hòa tan 1g bột trái mướp đắng khô trong 20ml CHCl3. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử. Với mẫu cao, sử dụng 0.1g hòa vào 30ml CHCl3, lấy dịch lọc làm mẫu thử. • Với thuốc thử Liebermann- Burchard: Có màu hồng đỏ. • Với thuốc thử Salkowski: Thêm 0.5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc. Dung dịch tách làm hai lớp, lớp H2SO4 (lớp trên) có màu xanh và lớp CHCl3 (lớp dưới) có màu đỏ với thuốc thử Salkowski. 2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin [7] 2.5.1 Thuốc thử saponin Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin. 34 Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện qui định. Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml (thu được nước sắc). Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, …10ml nước sắc. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao các cột bọt. Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin. − Phản ứng Liebermann: • Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 1ml anhydrid acetic, thêm từ từ 0.3 – 0.5ml H2SO4 đậm đặc. • Dấu hiệu: + Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene. + Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid. − Phản ứng Kahlenberg: • Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 0.5ml dung dịch SbCl3 bão hòa trong CHCl3, khuấy đều, đem soi UV. • Dấu hiệu: + Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene. + Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid. 2.5.2 Định tính saponin Thí nghiệm: Cân 1g bột trái mướp đắng cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội. Cho khoảng 35 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy rất nhiều bọt (cột bọt cao 6cm). 2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử [11] Thí nghiệm: Acid hóa 2g bột trái mướp đắng bằng 20ml dung dịch H2SO4 1%. Lọc, cô cạn còn 5ml. Nhỏ vào mẫu thử 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun nhẹ thấy xuất hiện tủa màu đỏ nâu. 2.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin [6, 7 ] 2.7.1 Thuốc thử tannin • Stiasny: Formol (36%): 20ml. Dung dịch HCl đậm đặc : 10ml. • Dung dịch gelatin mặn: Gelatin: 2g. Dung dịch NaCl bão hòa: 10ml. • Dung dịch acetate chì bão hòa cho kết tủa màu vàng nhạt. • Dung dịch FeCl3 1% trong nước tạo phức màu đen. 2.7.2 Định tính tanin Thí nghiệm: Lấy 5g bột trái, thêm 100ml nước cất rồi đun sôi trong 10 phút. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 – 4 giọt dung dịch acetate chì bão hòa thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt. Lấy 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin mặn, xuất hiện kết tủa trắng. Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2ml dung dịch FeCl3 1%, dung dịch chuyển thành màu nâu đen. 2.8 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside [6, 7 , 11] 2.8.1 Thuốc thử glycoside Thuốc thử tác dụng lên phần aglycon. 36 − Thuốc thử Tollen (xác định theo đường khử trong glycoside): • Công thức: Pha 0.5ml dung dịch AgNO3 10% với 0.5ml dung dịch NaOH 10%. Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa. • Dấu hiệu: Có Ag kết tủa. − Thuốc thử Molish: • Công thức: Nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1ml H2SO4 đậm đặc. • Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ thẳm. − Thuốc thử Baljet: • Công thức: Pha dung dịch acid picric 1% trong EtOH với dung dịch NaOH 10% trong nước theo tỷ lệ thể tích 1:1. • Dấu hiệu: Nhỏ 3 – 4 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính. − Thuốc thử Legal: • Công thức: Hòa tan 1mg chất thử trong 2 – 3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0.5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2N. • Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ tím. 2.8.2 Định tính glycoside Thí nghiệm: Lấy 10g bột trái mướp đắng khô, loại các chất không phân cực bằng ether petrol. Tiếp tục chiết bằng soxhlet với dung môi EtOH 50o. Dịch lọc EtOH 50o được loại tạp bằng acetate chì cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó, loại acetate chì dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô. Hòa tan cao bằng EtOH 95o và lấy dung dịch này làm mẫu thử. - Với thuốc thử Tollen: Xuất hiện kết tủa trắng. - Với thuốc thử Molish: Có màu đỏ carmine. 37 3.TÁCH CHIẾT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1 Thiết bị - Điểm chảy (mp oC) được đo trên máy Electrothermal IA 9000 Series. - Sắc ký cột thường dùng silicagel 60, MERCK, đường kính hạt: 0.04 – 0.63mm. - Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản silicagel 60 F254, MERCK tráng sẵn. - Máy cô quay chân không. - Máy soi UV Hình 2.2: Sắc ký cột thường Hình 2.3: Sắc ký bản mỏng (TLC) 3.1.2 Hóa chất - Petroleum ether, Trung Quốc - Diethyl ether, Trung Quốc - Chloroform, Trung Quốc - Ethyl acetate, Trung Quốc 38 - Acetone, Trung Quốc - Methanol, Trung Quốc - Nước cất - Ethanol 95o 3.2. Chiết xuất các nhóm hợp chất Trái mướp đắng sấy khô, xay nhỏ (4.5 kg), được chiết với ethanol 95o. Sau đó, cô loại dung môi thu được cao dạng sệt gọi là cao tổng (cao EtOH 95o) (537 g). Cao tổng hòa tan trong một lượng nước vừa đủ sệt. dung dịch này được lắc với petroleum ether (PE), thu lấy dịch PE và cô loại dung môi thu được cao PE. Pha nước còn lại sau khi lắc với EP được lắc tiếp tục với ethyl acetate (EtOAc), dịch EtOAc cô loại dung môi thu được cao EtOAc (219 g). Pha nước còn lại sau khi lắc với EtOAc được lắc tiếp tục với methanol (MeOH), dịch MeOH cô đuổi dung môi thu được cao MeOH (254 g). 39 Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết xuất các nhóm hợp chất của trái mướp đắng 3..3. Phân lập và tinh chế các hợp chất Sau khi thu được các cao chiết, chúng tôi đã sử dụng sắc ký bản mỏng để kiểm tra xem trong mỗi loại cao chiết có khoảng bao nhiêu hợp chất. So sánh với những hợp chất đã phân lập được từ trái mướp đắng trước đây, chúng tôi phát hiện trong cao EtOAc có nhiều hợp chất. Vì vậy, chúng tôi đã dùng cao EtOAC để phân lập các hợp chất sử dụng phương pháp sắc ký côt thường. Bột trái mướp đắng Cao EtOH 95o Dịch nước Dịch nước Cao EtOAc Dịch nước Cao MeOH Cao PE Chiết với ethanol 95o Cô đuổi dung môi Chiết với petroleum ether Cô đuổi dung môi Chiết với ethyl acetate Cô đuổi dung môi Chiết với methanol Cô đuổi dung môi 40 Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ trái mướp đắng Từ cao EtOAc, tiến hành lên cột thường với các thông số sau: - Khối lượng cao: 219 g - Khối lượng silica gel: 600 g - Đường kính cột: 9 cm - Chiều cao lớp silica gel: 35 cm - Dung môi ổn định cột: Petroleum ether. - Thể tích lấy mỗi phân đoạn: 500ml Tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly bằng cách tăng dần tỉ lệ CHCl3 trong hệ PE:CHCl3. Theo dõi cột bằng sắc ký bản mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện. − Sắc ký cột thường − Sắc ký bản mỏng Tinh chế Tinh chế MC 5 Ph ân đ oạ n 14 MC 1 MC1A & MC1B MC 6 Cao EtOAc Ph ân đ oạ n 11 Ph ân đ oạ n 10 − Sắc ký cột thường − Sắc ký bản mỏng Ph ân đ oạ n 1 Ph ân đ oạ n… Ph ân đ oạ n 8 Ph ân đ oạ n 9 41 Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC (hệ dung môi giải ly CHCl3:MeOH:H2O = 9:1; 85:15; 8:2; 7:3:0.5; 6:4:1). Gom các phân đoạn có Rf giống nhau, thu được tất cả 14 phân đoạn chính. Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột thường Phân đoạn Hệ dung môi Kết quả thử TLC 1 PE:CHCl3 = 8:2 Vết kéo dài 2 PE:CHCl3 = 7:3 Nhiều vết 3 PE:CHCl3 = 6:4 Vết kéo dài 4 PE:CHCl3 = 4:6 Nhiều vết 5 PE:CHCl3 = 3:7 Nhiều vết 6 PE:CHCl3 = 2:8 Vết kéo dài 7 CHCl3 100% Vết kéo dài 8 CHCl3:MeOH = 95:5 Có 2 vết đậm 9 CHCl3:MeOH = 93:7 Vết kéo dài 10 CHCl3:MeOH = 9:1 Có 2 vết đậm 11 CHCl3:MeOH = 88:12 Có 1 vết đậm 12 CHCl3:MeOH = 85:15 Vết kéo dài 13 CHCl3:MeOH=8:2 Nhiều vết 14 CHCl3:MeOH=75:25 Vết kéo dài 42 ™ Tại phân đoạn 8 (dung môi giải ly CHCl3:MeOH = 95:5), chạy sắc ký bản mỏng thu được hai vết đậm. Rửa bằng ethyl acetae và kết tinh lại nhiều trong chloroform thu được hai chất . Kí hiệu MC1và MC6 . ™ Tại phân đoạn 10 (dung môi giải ly CHCl3:Me