Đề tài Hệ vi sinh vật có lợi trong bia

ure, nitrate. Đối với việc sử dụng nitrate cần phải thông O2 vô nhiều, nếu không thì nitrate bị khử thành nitrite, là chất độc của nó. Trong quá trình lên men bia bình thường, thì sự hấp thụ đạm nhanh hơn là lên men các loại đường. Khi tổng hợp đạm xong, nấm men thải ra chất đạm khác, càng đến cuối cùng càng thải ra nhiều hơn là hấp phụ. Đối với chất khoáng thì nấm men còn có K – Mg – Ca – Fe – PO4 – Cl. Nấm men sau khi trao đổi chất sẽ làm giảm pH xuống 4 – 4,4, trong khi đó pH bên trong tế bào nấm men thì chỉ đạt 5,9 – 6. Nếu trong môi trường không có chất đệm như bia thì pH môi trường sẽ bị nấm men hạ thấp xuống 3 (hoặc 2). Nấm men nổi thuộc lọai Saccaromyces cerevisiae: lọai này chỉ phát triển và lên men ở nhiệt độ từ 12-130C trở lên Nấm men chìm thuộc lọai Saccaromyces carlsbergensis, phát triển tốt ở ngay nhiệt độ thấp 6-70C. Lọai này đang được sử dụng rộng rãi ở nước ta. 2.2.2.Đặc điểm sinh lý và sinh hoá: Lên men 13 loại đường Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…) Tính chống chịu với 0,01%  hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit ID 32C). Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatine Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid. Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 350C, 370C, 420C. Tạo thành tinh bột. Sản sinh acid từ glucoza Thủy phân Urê Phân giải Arbutin Phân giải lipid Năng lực sản sinh sắc tố Sinh trưởng trên môi trường chứa 50 % và 60 % glucoza Hóa lỏng gelatine Phản ứng với Diazonium Blue B Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1 % Để xác định loài mới còn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào, thành phần đường trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch, giải trình tự ADN và lai ADN... Những chủng đột biến dùng trong sản xuất bia đen hoặc bia hơi ngọt: Từ những chủng thuộc nhóm: S.Carlsbergensis và S.Uvarum có thể gây đột biến để tạo thành những chủng mới có khả năng sử dụng cho các sản phẩm bia đen hoặc bia hơi ngot. Những chủng này thường có khả năng kết dính không lớn, xong khi bia đã kết thúc len men và được làm lạnh tốt thì quá trinh lắng trong xảy ra dễ dàng. 2.3. Cấu tạo của nấm men. Men bia là một loại cơ thể đơn bào, có hình trứng hay hình bầu dục, đường kính khoảng 5-10 µm. Trong tế bào nấm men có chứa các chất như: đạm chiếm 45-70%, chất béo chiếm 2-5%, chất khoáng ( chủ yếu là phosphate ) chiếm 8%, ngoài ra còn có một số loại vitamin như: vitamin B1,B2, một ít vitamin C ,tiền tố D và một số chất phân giải đạm, đường phục vụ cho quá trình lên men, hô hấp, tổng hợp. VD: Enzyme phân giải đạm: proteaza,peptidaza…. Enzyme phân giải đường: α-amylaza →dextrin (C6H10O5)n b-amylaza→maltoza (C6H12O6)n Hình 3.1 Một số hình ảnh của tế bào nấm men Tế bào nấm men được cấu tạo từ màng tế bào, thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nguyên sinh chất và nhân. Hình 3.2: Cấu trúc tế bào nấm men Màng tế bào ( màng nhầy ): là lớp chất dạng keo, có thành phần hóa học chủ yếu là nước ( chiếm 98% ) và polysaccharite. Màng tế bào là một màng bán thấm có chức năng thẩm thấu các hạt phân tử đạm, đường nhỏ thuộc loại dinh dưỡng của tế bào. Nó có chức năng bảo vệ tế bào và là nơi tích lũy chất dinh dưỡng cho tế bào nấm men. Thành tế bào: dày 25nm, có cấu trúc nhiều lớp và có thành phần hóa học chủ yếu là glucan ( D- glucose ), mannan ( D-manoza ) chiếm 90% trọng lượng vỏ, ngoài ra thành tế bào còn có các chất khác như: protein (6-7% ), hexozamin, một ít lipid, lipophotphat, các chất chứa kitin. Thành tế bào có chức năng cố định hình dạng tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, có vai trò trong việc bắt màu thuốc nhuộm khi nhuộm màu gram (ví dụ thuốc nhuộm gram :gluco, xanh metylen, fuchsine…) Màng nguyên sinh chất: nằm sát thành tế bào, dày 7-8nm, dược cấu tạo bởi ba lớp: trong đó có hai lớp phân tử protein ( chiếm 50% trọng lượng khô của màng và 10-20% của tế bào ), và một lớp kép photpholipid ( chiếm 20-30% trọng lượng khô của màng ).Màng nguyên sinh chất có vai trò vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, làm giá thể cho một số enzyme ( ví dụ permeaza để vận chuyển các chất vào tế bào và enzyme tổng hợp các chất như photpholipid) Nguyên sinh chất :nằm toàn bộ trong tế bào nguyên sinh chất ( trừ nhân ). Đây là vùng dịch thể đồng nhất khi tế bào còn non và có cấu trúc lổn nhổn khi tế báo già. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men có các cơ quan con như: Lưới nội chất : là một hệ thống có nhiều màng, nhiều ống phân nhánh phức tạp nằm bao bọc xung quanh nhân. Lưới nội chất có chức năng vận chuyển các vật chất cho tế bào và các cấu tử khác, nó đưa protein nối vào các nhiễm sắc chất và vận chuyển protein đi nuôi cơ thể. Lưới nội chất có hai loại: loại nhám để gắn các hạt ribosome, còn loại trơn thì tham gia vào quá trình sinh tái tổng hợp lipid. Bộ máy golgi : là hệ thống các túi mỏng xếp chồng lên nhau , có tác dụng chứa các sản phẩm bị phân cắt như: protein, lipid và vận chuyển chúng vào tế bào. Bộ máy golgi gần như là cơ quan vận chuyển của tế bào. Ty thể : là những thể hình cầu , hình que, hình sợi và có kích thước 0,2- 0,3 × 0,41 mm. Nó được bao bọc bởi hai lớp màng: màng ngoài nhẵn, màng trong có hình lượn sóng hay hình răng lược bên trong có chứa dịch hữu cơ. Ty thể được coi là trạm năng lượng của tế bào, nó thực hiện oxy hóa toàn bộ các hợp chất hữu cơ thành năng lượng ATP, giải phóng năng lượng ATP, tham gia tổng hợp một số chất như protein, lipid, hydratcacbon là những chất tham gia vào cấu tạo của tế bào. Không bào: là những khối có hình trứng hay hình củ khoai, bên trong có chứa các hạt như: lipid, glucogen ,một số hạt tinh bột … Không bào có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu, tham gia vào quá trình trao đổi chất, dự trữ các chất dinh dưỡng cho tế bào. Các không bào này sẽ to lên khi môi trường lên men bị thiếu chất dinh dưỡng hoặc khi nó bị già bị già cỗi. Lyzosome : là những khối cầu có đường kính 0,2 - 0,4 nm, có khi lên tới 1 – 2nm. Nó được tạo bởi màng lipoprotein. Trong lyzosome có chứa enzyme thủy phân nên nó có vai trò tiêu hóa nội bào. Ribosome : là những hạt nhỏ , đường kính từ 15 – 20 nm, bên trong có chứa 40 - 60 % ARN, 35 - 60 % protein, một ít lipid và một số men như: ribonucleaza… Nhân: nhân có hình tròn hoặc bầu dục, nhân của tế bào nấm men đã có màng nhân. Màng nhân gồm có hai lớp: màng trong và màng ngoài, ở giữa hai màng là lớp phospholipids, và có lớp viền protein ở màng ngoài. Trên màng có nhiều lổ thủng ( ở tế bào nấm men già, trên mỗi tế bào có khoảng 200 lổ, chiếm 6 - 8 % diện tích màng). Trong nhân: có chứa các chất nhân, hạch nhân và các nhiễm sắc thể Nhân có vai trò : mang hệ thống thông tin di truyền chứa trong AND, điều khiển việc tổng hợp protein, enzyme và các hoạt động sống khác của tế bào. Ở nấm men Saccharomyces Cerevisiae có một loại plasmid hay còn được gọi là 2µm plasmid, có vai trò trong thao tác chuyển gen của kỹ thuật di truyền. Loại plasmid này là một AND vòng có chứa 6300 đồi base. 2.4. Sinh sản của nấm men Nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men. Khi đó thành tế bào mở ra để tạo ra một chồi (bud). Chồi phát triển thành tế bào con và có thể tách khỏi tế bào mẹ ngay từ khi còn nhỏ hoặc cũng có thể vẫn không tách ra ngay cả khi lớn bằng tế bào mẹ. Nhiều khi nhiều thế hệ vẫn dính vào một tế bào đầu tiên nẩy chồi và tạo thành một cành nhiều nhánh tế bào trong giống như cây xương rồng. Chồi có thể mọc ra theo bất kỳ hướng nào (nẩy chồi đa cực- multilateral budding) hoặc chỉ nẩy chồi ở hai cực (nẩy chồi theo hai cực- Bipolar budding) hoặc chỉ nảy chồi ở một cực nhất định (nẩy chồi theo một cực – monopolar budding). Nấm men chìm: hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi, có dạng hình cầu. Nấm men nổi: tế bào mẹ và con sau khi nảy chồi thì dính lại với nhau tạo thành chuỗi các tế bào nấm men, có dạng hình cầu hoặc oval với kích thước 7-10 mm Nấm men còn có hình thức sinh sản phân cắt như vi khuẩn. Có thể hình thành một hay vài vách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cắt (fission cells). Điển hình cho kiểu phân cắt này là các nấm men thuộc chi Schizosaccharomyces. Ở một số nấm men thuộc ngành Nấm đảm, có thể sinh ra dạng bào tử có cuống nhỏ (sterigmatoconidia) hoặc bào tử bắn (ballistoconidia hay ballistospore). Bào tử có cuống nhỏ thường gặp ở các chi nấm men Fellomyces, Kockovaella và Sterigmatomyces, khi đó chồi sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách ra khi nhánh bị gẫy. Bào tử bắn được sinh ra trên một gai nhọn của tế bào nấm men và bị bắn ra phí đối diện khi thành thục. Nếu cấy các nấm men sinh bào tử bắn thành hình zích zắc trên thạch nghiêng  hoặc trên đĩa Pertri thì sau một thời gian nuôi cấy sẽ thấy xuất hiện trên thành ống nghiệm hoặc nắp đĩa Pertri có một hình zích zắc khác được hình thành bởi các bào tử bắn lên. Bào tử bắn là đặc điểm của nấm men thuộc các chi Bensingtonia, Bullera, Deoszegia, Kockovaella, Sporobolomyces.... Một số nấm men còn có một hình thức sinh sản vô tính nữa, đó là việc hình thành các bào tử đốt (arthroconidia hay arthrospore). Khi đó sẽ hình thành các vách ngăn ở đầu các nấm men dạng sợi, sau đó tách ra thành các bào tử đốt. Loại này gặp ở các nấm men thuộc cả hai ngành: Nấm túi và Nấm đảm.Thường gặp nhất là ở các chi nấm men Galactomyces, Dipodascus (dạng vô tính là Geotrichum) và Trichosporon. Nấm men còn có thể tạo thành dạng tản (thallus) dưới dạng khuẩn ty (sợi nấm- Hyphae) hay  khuẩn ty giả (giả sợi nấm – Pseudohyphae) Dạng sinh sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi (Ascospore) được sinh ra từ các túi (Asci). Có thể xảy ra sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào nấm men tách rời hoặc giữa tế bào mẹ và chồi. Còn có cả sự biến nạp trực tiếp trong 1 tế bào sinh dưỡng (vegetative cell), tế bào này biến thành túi không qua tiếp hợp (unconjugated ascus). Thường trong mỗi túi có 4 hay đôi khi có 8 bào tử túi. Trong một số trường hợp lại chỉ có 1 – 2 bào tử túi. Bào tử túi ở chi Saccharomyces có dạng hình cầu, hình bầu dục; ở chi Hanseniaspora và loài Hansenula anomala  có dạng hình mũ ; ở loài Hansenula saturnus bào tử túi có dạng  quả xoài giữa có vành đai như dạng Sao Thổ. Một số bào tử túi có dạng kéo dài hay hình xoắn…Bề mặt bào tử túi có thể nhẵn nhụi, có thể xù xì hoặc có gai… Bào tử màng dày (hay bào tử áo- chlamydospore) là dạng bào tử giúp nấm men vượt qua được điều kiện khó khăn của ngoại cảnh, chứ không phải là hình thức sinh sản. Một số nấm men còn có thể sinh vỏ nhày. 2.5. Phát triển nấm men Phần III. KỸ THUẬT LÊN MEN 3.1. Sản Xuất Nhân Giống Men Bia 3.1.1. Nguyên Liệu Sản Xuất Dù nấm men được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm hay trong qui mô công nghiệp đều phải được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển.Chất dinh dưỡng chủ yếu cho quá trình phát triển của nấm men là rỉ đường. Có hai loại rỉ đường:rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Rỉ đường mía: là phụ phẩm thu được trong công nghiệp ép mía thành đường sau khi đã thu saccharose. Có thể nói, rỉ đường là một hỗn hợp khá phức tạp. Rỉ đường có chứa một lượng đáng kể các hợp chất chứa nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ thuận lợi cho quá trình nuôi cấy nấm men. Thành phần của rỉ đường: phụ thuộc vào phương pháp sản xuất đường, điều kiện bảo quản đường cũng như phụ thuộc vào giống mía và điều kiện trồng trọt của cây mía. Trong rỉ đường mía có: 15-25% nước, 80-85% chất khô hoà tan. Thành phần của chất khô: Đường: thường được gọi là đường tổng số hay đường lên men đươc (chiếm hơn 50%): trong đó đường saccharose chiếm 30-35%, đường khử chiếm 15-20%( glucose, fructose) Thành phần chất khô còn lại (nhỏ hơn 50%), trong đó 30-32% chất hữu cơ, 18-20% chất vô cơ. Ngoài ra trong rỉ đường mía còn có chứa nhiều loại vitamin, trong đó đáng lưu ý hơn cả là biotin. Rỉ đường củ cải: là nước cốt sinh ra trong quá trình sản xuất đường từ củ cải đường. Thành phần của rỉ đường củ cải: Saccharose: 48% Rafinose: 1% Đường chuyển hoá khác:1% Các axit hữu cơ:2% Rỉ đường củ cải chứa nhiều loại vitamin, trong đó hàm lượng biotin thấp hơn trong rỉ đường mía. Xử lý đường bị thiếu hay bị xấu: Nếu rỉ đường không đủ chất dinh dưỡng cho nấm men( chẳng hạn như nhu cầu nấm men đối với Mg > 0,15% cao hơn nồng độ có trong rỉ đường) thì ta cần bổ sung cho đầy đủ nấm men. Nếu rỉ đường bị xấu, tuỳ thuộc vào yếu tố ảnh hưởng mà có những phương pháp xử lí khác nhau: Rỉ đường chứa vi khuẩn tạo Nitric: cho Chotetraccyline từ 1-5g trên 1m3 dung dịch rỉ đường pha loãng để làm trong đường thời gian 1h. Rỉ đường có SO2: Clo 11g/110g SO2 trong 60 phút. Rỉ đường có acid bay hơi cao: Dung H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đường. Rỉ đường có độ màu cao(2 ml dd Iốt 0.1N): pha loãng ít nhất 20 lần. Canxi cao(lớn hơn 1%):pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:3, hạ pH đến 4.5 để 4h ly tâm loại kết tủa. 3.1.2. Sản Xuất Nấm Men Bia 3.1.2.1. Qui trình sản xuất: Sacharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn.Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất được sản xuất với qui mô lớn trên thế giới. Nguyên liệu chính dung để sản xuất men là mật rỉ, ngoài ra một số hoá chất khác sẽ được cung cấp trong quá trình nuôi cấy men để bổ sung các chất dinh dưỡng mà mật rỉ không đủ. Quá trình nuôi dưỡng men Saccharomyces là quá trình hiếu khí, vì vậy người ta phải thổi vào bồn một lượng khí lớn. Trong quá trình nuôi cấy nấm men người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồn lên men theo lượng cồn có trong môi trường lên men. Nếu lượng mật nạp vào nhiều quá nấm men sẽ không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khiến nồng độ cồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu mật nạp vào quá ít thì nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng cho sinh trưởng. Chất lượng của nấm men phụ thuộc vào công dụng của nó. Nếu sản xuất nấm men bánh mì thì năng lực sinh khí trong bột là thông số cần kiểm soát, nếu nấm men dung cho công nghiệp cồn thì khả năng sản xuất cồn, khả năng chịu nồng độ cồn cao là quan trọng. Hiện nay, nhờ vào tiến bộ của công nghệ gen nên người ta có thể tạo ra các chủng nấm men phù hợp với các công dụng của nó và cho năng suất cao (dựa trên 1 kg nguyên liệu chính). Tuy nhiên công nghệ kiểm soát quá trình lên men vẫn đóng vai trò quan trọng để sản xuất các mẻ men chất lượng và sản lượng cao. Quy trình sản xuất nấm men có thể được tóm tắt như sau: Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Nuôi cấy men giống trong nhà máy Ly tâm men giống Nuôi cấy men thương mại Ly tâm men thương mại Lọc men Đóng gói sản phẩm men tươi hoặc sấy khô để có sản phẩm men khô. Sản phẩm men tươi có thời hạn sử dụng ngắn, chỉ vài tuần và phải trũ lạnh, sản phẩm men khô có thời hạn sử dụng dài hơn, thường trên một năm nếu được hút chân không và được trữ trong điều kiện thường. Quá trình sản xuất men sẽ tiêu tốn rất nhiều nước và thải ra môi trường một lượng lớn nước thải với hàm lượng COD và BOD cao đòi hỏi các nhà máy phải trang bị hệ thống xử lý nước thải. 3.1.2.2. Giữ giống men bia: Những nồi men bia thuần khiết được tách ra từ một tế bào , nuôi cấy và bảo quản sao cho giữ được những tính chất quí ban đầu của chúng. Trong bảo quản quá trình sống của men giống xảy ra rất chậm và hạn chế sự phát triển của chúng. Giữ được trạng thái tìm sinh này có thể áp dụng nhứng phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp từ 2-40C, đông khô ở dạng bào tử hoặc kỵ khí.Bảo quản giống thưần khiết ở 5-80C trong bảo hoà CO2 cò thể giữ được những tính chất ban đầu, nâng cao được khả năng lên men và cải thiện được mùi vị của bia. 3.1.2.3. Nuôi cấy nấm men bia Nuôi cấy men bia trong sản xuất cũng theo nguyên tắc tăng dần thể tích và số lượng tế bào để đảm bảo khả năng lên men:giống từ ống nghiệm cấy qua các bình, các thùng rồi chuyển vào thùng lên men chính. Nếu nhà máy có thiết bị Greyner thì việc nhân giống sẽ từ ống nghiệm qua các bình Carlsberg , lên men ở 7-80C trong 5-6 ngày và tiếp tục tăng dần qua 200-300 lit rồi đưa vào thiết bị này cho lên men ở 80C trong 3 ngày, sau đó đưa vào các thùng lên men. 3.1.2.4. Sử dụng lại men sau khi lên men chính Cặn men ở các thùng lên men chính sau khi đã chuyển dịch vào lên men phụ chia làm ba lớp: Lớp dưới cùng là những tế bào già, có lực lên men yếu. Lớp giữa là những tế bào trẻ hơn có khả năng lên men mạnh. Lớp trên cùng là những tế bào có kích thước nhỏ , khả năng kết lắng kém cùng với những vẩn cặn protein và houblon. Chỉ nên dùng lại lớp men giữa sau khi đã xử lý, có nhiều cách xử lý men này trong sản xuất. Đơn giản nhất là cho cặn men qua rây có kích thước nhỏ để loại bỏ những tạp chất lớn, sau đó rửa bằng nước. Cho cặn men vào các thùng hở hoặc kín rồi để men lắng xuống phía duới, bỏ phần nước ở trên, rửa 1-2 lần trong 24h. Nước rửa là nước đun sôi để nguội không có tạp khuẩn, nên tiến hành rửa men trong nhà lạnh với nhiệt độ tốt nhất là 10C.Trước khi đưa vào lên men có thể hoạt hoá giống men đã rữa bằng cáchcho vào dịch đường malt có mật độ đường khoảng 5-7%, để tĩnh ở phòng lên men chính cho đến khi phát triển mạnh thì tiếp vào lên men. Nếu men bị nhiêm tạp thi cần phải được xử lý bắng axit H2SO4 0.4% hoặc H3PO4 0,6%.Cho men vào dung dịch axit để yên một giờ rồi đổ cẩn thận vào bình sạch, bỏ cặn bẩn. Dịch men được trung hoà bằng NaOH cho đến khi pH đạt 4,8-5,2. Men lắng xuống đáy được rửa bằng nước sôi để nguội rồi đem dùng cho lên men. Cũng có thể làm sạch men như sau:dùng dịch chiêt houblon bằng kiêm 2% có chứa 500-700 mg/l izohumulon hoà với cặn men. Trong điều kiện này khoảng 24h hoạt lực men không giảm còn các vi sinh vật tạp nhiễm bị chết. ª Ví Dụ Về Hệ Nhân Giống Nấm Men Thuần Khiết Khép Kín Của GEA Diessel  Hansen nhà là khoa học đầu tiên phát triển công nghệ nhân giống nấm men bia thuần khiết từ năm 1881. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, nhân giống nấm men bia ngày càng hoàn thiện và được xây dựng thành một quy trình chuẩn. Hiện nay, có nhiều quy trình nhân giống men khác nhau, phụ thuộc vào từng quy mô sản xuất và điều kiện công nghệ, một trong những quy trình được quan tâm, ứng dụng phát triển là hệ nhân giống nấm men thuần khiết khép kín của GEA Diessel Hình 3.3 Hệ Nhân Giống Nấm Men Thuần Khiết Khép Kín Của GEA Diessel Hệ thống nhân giống nấm men thuần khiết khép kín ở cấp trung gian Trung tâm nhân giống nấm men bia trung gian là một hệ thống khép kín bao gồm: Một tank cấu tạo hai vỏ có thể làm lạnh và gia nhiệt. Bơm tự động, đồng hồ điện tử, hệ sục khí và van kép. Hệ thống ống dẫn nhiệt và làm lạnh. Tổng thể tích của tank chứa là 80hl, nhưng nó chỉ sử dụng 35hl, nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thông khí. Ưu điểm chính của thiết bị nhân giống này là cấu tạo đơn giản. Có một tank chứa, một máy bơm, một van kép, nên thiết bị dễ vận hành và chi phí bảo dưỡng thấp. Thiết bị nhân giống được nối với đường ống chuyển dịch đường sau lạnh nhanh. Van kép được cài đặt chương trình tự động đóng mở để kiểm soát quá trình bổ sung dịch đường vào tank nhân giống. Việc thanh trùng được tiến hành trên cơ sở phân tích các chỉ tiêu vi sinh của dịch đường. Hệ thống CIP phải được tách rời ngay lập tức ra khỏi thiết bị nhân giống để loại trừ khả năng nhiễm hoá chất tẩy rửa, đặc biệt là đối với hệ thống CIP được dùng chung cho nhiều thiết bị khác. Chủng giống nấm men thuần khiết được nhân giống trong hệ Carlsberg và quá trình này cũng được tự động hóa và hoàn toàn khép kín, bởi vậy, nguy cơ nhiễm khuẩn được loại trừ tuyệt đối. Dịch đường trong tank chứa sẽ được khuấy đảo tuần hoàn bằng máy bơm, nhằm mục đích tạo sự đồng đều và độ thông khí cần thiết. Sử dụng hệ thống Diessel CS3 để điều khiển nhu cầu nhiệt độ, thời gian và hàm lượng oxy hòa tan trong dịch đường phục vụ cho quá trình nhân giống. Lượng giống nấm men thuần chủng được tiếp vào tank chứa và phối trộn với dịch đường theo tỷ lệ thích hợp. Quy trình nhân giống nấm men khép kín Chủng nấm men bia thuần khiết thuộc loài nấm men chìm được nhân giống trong phòng thí nghiệm và trạm nhân giống như sau: Quy mô phòng thí nghiệm: Chủng nấm men bia thuần khiết phân lập từ ống gốc được nhân giống ở cấp 400 ml. Quá trình nhân giống được tiến hành ở nhiệt độ 200C trong thời gian 48 giờ và lắc liên tục. Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh của nấm men và tiến hành tiếp giống vào hệ nhân giống Carlsberg chứa 16lít dịch đường. Quá trình sục khí vô trùng với lưu lượng nhỏ được tiến hành liên tục ở nhiệt độ 200C trong 48 giờ. Quy mô trạm nhân giống trung gian Dịch nhân giống từ bình Carlsberg được chuyển vào tank nhân giống theo hệ thống đường ống vô trùng khép kín. Quá trình nhân giống trung gian được tiến hành trong 48 giờ ở điều kiện nhiệt độ 170C cùng với việc sục khí thích hợp bằng hệ bơm tuần hoàn.Trong giai đoạn 16 tiếng cuối cùng của quá trình nhân giống, nhiệt độ được giữ cố định ở 14oC. Kết thúc quá trình nhân giống, mật độ nấm men đạt khoảng 160 - 180 triệu tế bào/1ml. Tỷ lệ tế bào sống đạt 99,8%.Toàn bộ quá trình kéo dài 144 giờ, bao gồm cả giai đoạn nhân giống trên phòng thí nghiệm. Men giống được tái sử dụng, quy trình được rút ngắn thời gian bằng việc bổ sung dịch nước nha mới vô trùng với dịch men sữa, đảm bảo các chỉ tiêu vi sinh và hóa sinh Kết luận: Từ 16 lít dịch men giống thuần khiết trong hệ Carlsberg, thiết bị nhân giống trung gian của GEA Diesel có thể tạo ra 35hl dịch men giống với mật độ tế bào lên đến 170 triệu/1ml trong 48 giờ. Thiết bị chiếm ít không gian, dễ vận hành và bảo dưỡng. 3.2. Yêu cầu chất lượng nấm men bia: Một nòi nấm men được dung để sản xuất nấm men phải đáp ứng những yêu cầu sau: Khả năng và tốc độ lên men trong điều kiện nhiệt độ thấp với dịch đường malt. Có khả năng kết lắng đối với những loài nấm men lên men chìm. Nấm men đưa vào sản xuất có tỷ lệ chết 10% Lượng nấm men phải đạt từ 10-20 triệu tế bào/ml dịch giống Nấm men phải có khả năng chuyển hóa đường đôi, đường đơn, peptid, acid amin và giải phóng CO2 , rượu etylic, nhiệt độ. Nấm men phải thuần chủng Tính ổn định trong sản xuất: Tạo ra hương vị và chất lượng sản phẩm đặc trưng Các chỉ tiêu trong quá trình lên men chính: Các yêu cầu trong giai đoạn lên men chính gồm các chỉ tiêu sau đây: Trước khi lên men: Nước nha phải có độ đường trên 10.5 (đo bằng đường kế) thì bia mới đạt tiêu chuẩn. Độ chua của nước nha không quá 1 (tính bằng số mililit dung dịch NaOH 0.1N tiêu tốn cho 10ml bia) Nấm men phải tuyệt đối khỏe mạnh,thuần khiết. Sau khi lên men: Độ dường trung bình trong 1 ngày do nấm men ăn phải từ 1 – 2 độ. Độ chua của dung dịch không quá 1.4 (tính bằng số mililit dung dịch NaOH tiêu tốn cho 10 ml bia) Áp suất trong các bồn không quá 0,5 kg/m3. Nhiệt độ trong dung dịch phai khống chế từ 12 – 140C không được để nhiệt độ quá cao. Thời gian trong giai đoạn này 6 – 10 ngày. Trong giai đoạn lên men khu vực lên men lúc nào cũng phải sạch sẽ và thông thoáng, để tránh các vi sinh vật có hại ảnh hưởng đến quá trình lên men. Các chỉ tiêu trong quá trình lên men phụ: Độ đường lúc này chỉ còn 2.7 Độ chua cung không quá 1.4 Độ mặn tối đa là 0.63 Nhiệt độ ở giai đoạn nay được không chế từ 0 – 20C Áp suất trong bồn không quá 1.5kg/cm2 Khi ta thả men dưới bồn men phải có dạng đặc xệt muốn như vậy ta phải hạ nhiệt độ xuống để men có thể lắng toàn bộ xuống đáy bồn. Thời gian lên men phụ khoảng vài tuần để men có thể lắng toàn bộ xuống đay bồn và ta có thể lấy toàn bộ số men ra cho bia trong hơn. Đây là giai đoạn ủ chín bia nên ở giai đoạn này thời gian càng kéo dài thì chất lượng bia càng ngon hơn. 3.3. Kỹ thuật lên men: đây là một khâu quan trọng trong quá trình sản xuất bia. Mục đích : Lên men các loại đường có trong dịch lên men dưới tác dụng enzym nấm men. Khi lên men sẽ làm thay đổi thành phần hóa học của dịch lên men tạo thành một loại nước uống gọi là bia, đồng thời hoàn thiện chất lượng cho bia. Trong quá trình lên men bia chia làm hai thời kỳ: lên men chính và lên men phụ. @ Thời kỳ lên men chính: trong thời kỳ này xảy ra sự biến đổi cơ chất mạnh mẽ nhất, gần như toàn bộ đường chuyển thành rượu etylic, manitol, galatiol và amin thành rượu bậc cao. Tiến hành lên men kín trong các thiết bị lên men, nhiệt độ 6-100C, lên men chính còn tạo ra axit hữu cơ, este, CO2, rượu cao ảnh hưởng đến việc hình thành hương thơm của bia. Ví dụ: Tyrozol là một trong những cấy tử quyết định hương thơm của bia. Lên men chính ngoài việc hình thành các thành phần quan trọng của bia, còn tham gia tạo mùi, vị đặc trưng cho bia, từ đây cũng là thời kỳ sản sinh ra chất diaxetyl. Nhiều dẫn liệu cho thấy: sự hình thành diaxetyl chủ yếu ở giai đoạn lên men chính. Cơ chất ban đầu là do sản phẩm trung gian trong quá trình trao đổi chất của nấm men và vi sinh lây nhiễm như Pediococcus, Aerobacter. Hàm lượng diaxetyl đạt cao nhất vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 của quá trình lên men chính, giảm dần trong quá trình lên men phụ (quá trình tàng trữ bia). Hàm