Đề tài Khảo sát hiệu giá của vacxin sởi được sản xuất tại Polyvac dùng cho thử nghiệm lâm sàng

song tỷ lệ miễn dịch ở trẻ vẫn ở mức thấp. Người đại diện của Cơ quan Bảo vệ sức khoẻ cộng đồng của Anh cho biết, việc trẻ em không tiêm phòng bệnh sởi, bệnh quai bị, bệnh rubella có thể là nguyên nhân chính dẫn tới sự phát triển nhanh của loại bệnh lây nhiễm này trong thời gian gần đây. Các chuyên gia dự đoán rằng, chỉ tính riêng ở Anh, số bệnh nhân bị bệnh sởi có thể tăng lên từ 30.000 đến 100.000 trường hợp/năm. Để ngăn chặn sự lây lan bệnh truyền nhiễm này sang các khu vực khác cần phải tiến hành tiêm vacxin mở rộng cho các em học sinh. Bệnh sởi cũng là một vấn đề nghiêm trọng tại Nhật Bản. Riêng ở Hokkaido, trong số 541 trường hợp mắc bệnh sởi, trẻ em chiếm khoảng 17,7%, trong đó trẻ trên 6 tháng tuổi chiếm 68%, 95% số mắc bệnh đều chưa tiêm phòng vacxin. Điều đó cho thấy sự cấp bách của việc tiêm phòng cho trẻ ngay từ khi dưới 1 tuổi [16]. Từ vài chục năm nay, với thuốc chích ngừa sởi, bệnh sởi ít xảy ra ở những quốc gia tiến bộ, chẳng hạn như Mỹ, nhưng vẫn còn là một ám ảnh kinh hoàng cho những người dân các nước đang phát triển.  Bệnh lại rất hay lây và dễ dàng lan ra từ những người du lịch quốc tế. Hiện nay trên Thế giới có đến 30 tới 40 triệu trường hợp bệnh sởi xảy ra, gây ra hơn 750.000 cái chết. 1.2.4.2. Tình hình mắc bệnh sởi ở Việt Nam Hầu như không một người Việt Nam nào không từng nghe nói tới bệnh sởi. Ðứa bé nào bị mọc nhiều nốt đỏ trong người cũng được cho là đang bị “ban sởi”. Một đứa bé dưới 5 tuổi có thể bị rất nhiều bệnh có kèm theo triệu chứng nổi những vết đỏ khắp người và lần nào cũng cho là lên ban, phải kiêng ra nắng gió, phải kiêng nước, nếu không thì sẽ bị “chạy hậu”. Tỷ lệ mắc bệnh sởi tại Việt Nam đã giảm rõ rệt trong những năm qua, đây là hiệu quả của hoạt động tiêm chủng mở rộng (TCMR) được triển khai rộng rãi trên cả nước. Tuy nhiên cho đến nay bệnh sởi vẫn chưa được loại trừ tại Việt Nam. Thời tiết sắp chuyển sang mùa đông xuân - mùa bệnh sởi phát triển mạnh nên những hiểu biết về căn bệnh này và cách phòng chống sẽ giúp cộng đồng hiểu rõ hơn giá trị của việc phòng bệnh bằng vacxin. Chương trình TCMR đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong và mắc bệnh sởi ở Việt Nam.Tỷ lệ lưu hành bệnh sởi ở Việt Nam hiện đã giảm đến 573 lần so với trước năm 1985, thời điểm bắt đầu chương trình TCMR. Căn bệnh này đang được khống chế tốt và dự kiến sẽ bị loại trừ vào năm 2010. Tình hình bệnh sởi ở Việt Nam thời kỳ trước khi tiêm 1 liều vacxin sởi trong chương trình TCMR cũng tương tự như ở các nước trên Thế giới. Trong thời kỳ này được ghi nhận ở miền Bắc Việt Nam với tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất là 65/100.000 người dân (năm 1981), tỷ lệ mắc cao nhất là 137,7/100.000 người dân (năm 1979) và 125,7/100.000 người dân (năm 1983) và đây là 2 đỉnh của một chu kỳ dịch sởi cách nhau khoảng từ 4-5 năm. Bệnh sởi lưu hành địa phương ở mọi nơi trong cả nước và phổ biến ở trẻ em, nhất là ở trẻ dưới 5 tuổi. Việc gây miễn dịch phòng bệnh sởi bằng một liều vacxin sởi sống giảm độc lực được bắt đầu trong chương trình TCMR ở Việt Nam từ tháng 10 năm 1985. Sau 5 năm, tỷ lệ tiêm 1 liều vacxin sởi cho trẻ em từ 9 - 11 tháng tuổi đã tăng dần từ 19% (năm 1985) tới 89% (năm 1989) và tỷ lệ mắc bệnh sởi đã giảm xuống từ 91/100.000 người dân (năm 1986) xuống 23/100.000 người dân (năm 1989). Từ đó đến năm 2000, tỷ lệ tiêm 1 liều vacxin sởi luôn được duy trì trên 90% và tỷ lệ mắc bệnh sởi đã giảm đến mức thấp nhất là 8,55/100.000 người dân và cao nhất là 19,01/100.000 người dân (năm 1993) và 23,16/100.000 dân (năm 2000) và đây cũng là 2 đỉnh của một chu kỳ dịch sởi cách nhau khoảng từ 8 - 9 năm của thời kỳ sau khi tiêm vacxin sởi. Như vậy, sau 16 năm thực hiện tiêm 1 liều vacxin sởi cho trẻ em từ 9 - 11 tháng tuổi tỷ lệ mắc bệnh sởi đã giảm xuống 84%, chu kỳ dịch sởi đã kéo dài gấp đôi và tỷ lệ mắc bệnh cao đã được chuyển dịch lên nhóm tuổi cao hơn. Tuy nhiên, bệnh vẫn còn tản phát ở nhiều nơi và vẫn xảy ra dịch sởi với quy mô có nhỏ hơn thời kỳ chưa tiêm vacxin sởi. Tình hình này cũng tương tự như ở các nước khác trên Thế giới. Theo Cục Y tế dự phòng (Bộ Y tế) cho biết, đến nay có 30 tỉnh, thành phố có người bị bệnh sởi và sốt phát ban dạng sởi; số ca dương tính sởi là 650. Tại Hà Nội ngày 23/02 có thêm 29 ca sốt phát ban dạng sởi, tổng số từ đầu vụ dịch đến nay là 1.235 ca, trong đó 230 ca được xác định dương tính với sởi, hơn 77% số người mắc ở độ tuổi 18. Dịch sởi đã xuất hiện tại 329 xã, phường trên tất cả 29 quận, huyện của Hà Nội. Theo Viện Các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới quốc gia, từ đầu vụ dịch có 15 trường hợp biến chứng nặng do sởi, hiện vẫn còn năm ca nặng biến chứng viêm não, viêm màng não.  Theo Sở Y tế TP Hồ Chí Minh, đến ngày 23/02, thành phố có 28 trường hợp mắc bệnh sởi. Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Hà Tĩnh cho biết, sau nửa tháng triển khai phòng, chống bệnh sởi ở bản Rào Tre, huyện Hương Khê và ở huyện Nghi Xuân, tỉnh Hà Tĩnh. Đến nay, dịch sởi cơ bản được khống chế, không có trường hợp nào mắc thêm. Dịch sởi xuất hiện đầu tiên vào ngày 05/02 ở bản Rào Tre. Người bệnh là Hồ Thị Lý (26 tuổi). Nhưng những ngày sau đó có thêm ba người bệnh khác lây bệnh. Và một tuần sau đã có 26 trường hợp mắc bệnh, trong đó người bệnh hơn 18 tuổi là 10 người. Cũng trong thời gian này, tại huyện Nghi Xuân rải rác có ba người bệnh mắc bệnh sởi. Từ ngày 03/02, trên địa bàn huyện Thanh Hà (Hải Dương) có hơn 20 trường hợp có biểu hiện sốt phát ban dạng sởi, chủ yếu tại xã Việt Hồng, Tiền Tiến, Thanh Hải. Ðộ tuổi của người bị nhiễm bệnh chủ yếu 18-40 tuổi. Từ đầu tháng 2 đến nay, dịch sởi phát triển nhanh tại nhiều địa phương trong tỉnh Nam Ðịnh. Số liệu của Sở Y tế cho biết, đến ngày 24/02 đã phát hiện 27 bệnh nhân sốt phát ban dạng sởi, Hiện có 9/10 huyện, thành phố phát hiện người bệnh mắc dịch sởi, gần đây nhất vào ngày 21/02 Trung tâm Y tế dự phòng huyện Vụ Bản phát hiện thêm một trường hợp có triệu trứng sốt phát ban dạng sởi.  Theo Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Phú Thọ, đến nay toàn tỉnh đã phát hiện 47 người bệnh thuộc 10/13 huyện, thành phố, thị xã mắc sốt phát ban dạng sởi Hầu hết người bệnh có độ tuổi từ 14 đến 30 [12]. Khi miễn dịch giảm thì nguy cơ mắc bệnh sẽ rất cao. Đó là lý do khiến số thanh niên mắc bệnh gia tăng. Một điều nguy hiểm nữa là bệnh sởi do virut lây lan rất mạnh, virut phát tán qua đường hô hấp vào không khí, những người không có miễn dịch hoặc miễn dịch kém thì khả năng bị lây nhiễm cao. 1.3. Phòng và điều trị bệnh sởi Sởi thường xuất hiện nhiều vào cuối năm cũ, đầu năm mới. Không chỉ gây các biến chứng như kiết lỵ ra máu mũi, tiêu chảy kéo dài, viêm phổi, sởi còn có thể là nguyên nhân gây còi xương, suy dinh dưỡng, thậm chí tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi nếu không được điều trị đúng. 1.3.1. Vacxin phòng bệnh sởi Cách phòng bệnh tốt nhất là tiêm phòng. Phòng bệnh bằng vacxin được khuyến cáo khi trẻ đủ 9 tháng tuổi, tuy nhiên người ta thấy rằng việc tiêm một mũi vacxin duy nhất không đủ tạo ra miễn dịch bền vững và rộng rãi trong cộng đồng vì tỷ lệ trẻ tiêm phòng bệnh sót cũng như tỷ lệ đạt được miễn dịch của vacxin này cũng chỉ đạt khoảng 90%. Do vậy cần phải tiêm nhắc lại mũi thứ 2, thời gian tiêm là khi trẻ đủ 6 tuổi, độ tuổi bước vào lớp 1. Việc tiêm liều thứ 2 có thể tạo miễn dịch tới 99%. Chương trình TCMR Việt Nam đã thực hiện mũi nhắc lại này trên cả nước từ năm 2006. Tại các địa phương còn xuất hiện những vụ dịch sởi nhỏ, đối tượng mắc không chỉ trẻ em thì cần thiết phải thực hiện những chiến dịch tiêm nhắc cho người dân khu vực này để tạo miễn dịch lớn và bền vững trong cộng đồng trong nhiều năm. Có hai loại vacxin phòng bệnh sởi là vacxin bất hoạt bởi focmalin và vacxin sống giảm độc lực. 1.3.1.1. Vacxin bất hoạt Vacxin bất hoạt bằng formalin có nguồn gốc từ chủng Edmonston đã được cấp phép tại Mỹ năm 1963 và được sử dụng cho đến năm 1967. Phác đồ tiêm chủng là 3 liều vacxin bất hoạt hoặc hai liều vacxin bất hoạt và một liều vacxin sống được tiêm cách tháng. Vacxin bất hoạt gây đáp ứng miễn dịch ngắn và có một số phản ứng phụ đặc biệt là mắc sởi không điển hình nên sau đó ít được sử dụng [16]. 1.3.1.2. Vacxin sống giảm độc lực Chủng virut dùng trong sản xuất vacxin sống giảm độc lực được tạo ra bằng cách cấy truyền liên tiếp trên các tế bào nuôi cấy để chọn dòng virut đã mất độc tính nhưng vẫn dữ tính kháng nguyên. Nhiều loại vacxin giảm độc lực đã phát triển và được sử dụng có hiệu quả trên Thế giới, bao gồm các chủng Edmonston A và B do Enders phân lập được dùng rộng rãi nhất hiện nay. Vacxin chế từ chủng Moraten được sử dụng duy nhất tại Mỹ. Vacxin chế từ chủng Schwarz là sản phẩm chiếm ưu thế tại nhiều quốc gia khác, ngoài ra một số vacxin được chế từ một số chủng khác giảm độc nhiều hơn như AIK-C, Schwarz-F88, CAM-70, DT79 đang và đã được sử dụng tại Nhật [17]. Cũng như hầu hết các vacxin khác vacxin được sản xuất từ chủng AIK-C được sản xuất trong tế bào phôi gà nguyên phát. Loại vacxin này đã bắt đầu được sản xuất tại Việt Nam, Bộ Y tế đã giao cho Trung tâm Nghiên cứu sản xuất vacxin và sinh phẩm y tế (POLYVAC) thực hiện dự án sản xuất vacxin sởi tại Việt Nam. Dự án được thực hiện bằng nguồn vốn viện trợ không hoàn lại của chính phủ Nhật Bản. Mục tiêu của dự án là xây dựng một cơ sở sản xuất vacxin sởi với công suất 7,5 triệu liều/năm đạt tiêu chuẩn GMP của WHO. Công nghệ sản xuất vacxin do viện Kitasato, Nhật Bản chuyển giao và chủng AIK-C được lựa chọn để sản xuất vacxin [13]. Hình 1: Vacxin sởi sản xuất tại Việt Nam 1.3.1.3. Vacxin sởi kết hợp với vacxin quai bị và rubella (MMR) Cũng như nhiều nước trên Thế giới, việc tiêm chủng phòng bệnh sởi thường được kết hợp với vacxin quai bị và rubella đang được người dân Việt Nam rất ưa chuộng. Vacxin hỗn hợp này được cấp phép năm 1971. Một liều MMR (0,5ml) chứa ít nhất 1000 CCID50 của chủng sởi Moraten, ít nhất 5000 CCID50 chủng quai bị Jeryl Lynn và ít nhất 1000 CCID50 chủng virut vacxin rubella RA27/3. Có thể có vacxin sởi phối hợp với rubella mà không có thành phần quai bị. Hai loại vacxin MMR khác cũng được cấp phép, một loại có chứa chủng sởi CAM-70 và loại kia chứa chủng Shawrz F88. Số liệu nghiên cứu miễn dịch và an toàn cho thấy việc kết hợp kháng nguyên sởi và kháng nguyên quai bị, rubella rất an toàn và hiệu quả [17]. 1.3.2. Điều trị bệnh sởi Hiện nay, chúng ta vẩn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu đối với virut sởi. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh sớm được đặt ra nhằm ngăn chặn sự lây lan và phát triển thành dịch ở những nơi đông dân cư. Bệnh nhân sởi được điều trị không đặc hiệu: chế độ dinh dưỡng, nghỉ ngơi và điều trị triệu chứng: + Cho bệnh nhân dùng những thức ăn giàu chất dinh dưỡng, dễ tiêu hóa, không cần thiết kiêng cữ. Lưu ý dùng thêm thức ăn nhiều vitamin A để tránh biến chứng loét giác mạc, mù mắt. + Vệ sinh răng miệng, da, mắt. + Hạ sốt: Lau mát, thuốc hạ sốt thông thường (Paracetamol, không dùng Aspirin vì dễ gây hội chứng Reyes). + Giảm ho bằng Dextromethorphan, Codein, thuốc long đàm. + Kháng Histamin: Pipolphen, Dimedron. + Sát trùng mũi họng, nhỏ mắt bằng nước muối sinh lý, vitamin A chống khô mắt. + Chỉ sử dụng kháng sinh khi có biến chứng: viêm thanh quản, viêm phổi. + Các biện pháp hồi sức cấp cứu được áp dụng tùy theo tình trạng của bệnh nhân: thở oxy hỗ trợ, thở máy, hồi sức tim mạch.[10] 1.4. Tình hình tiêm chủng vacxin sởi phòng bệnh tại Việt nam Tất cả trẻ em Việt nam từ 9 – 12 tháng đều được tiêm chủng vacxin sởi để phòng bệnh sởi. Vacxin sởi là trong các vacxin nằm trong chương trình Tiêm chủng mở rộng, tiêm miễn phí cho trẻ. Từ trước tới nay vacxin sởi được khuyến cáo cần tiêm 1 mũi, tuy nhiên trong thời gian gần đây tình hình mắc Sởi khá phức tạp, do vậy chủ trương của Chương trình tiêm chủng mở rộng đang thực hiện thí điểm tiêm bổ sung mũi 2 cho trẻ dưới 6 tuổi. Liều lượng : 0,5 ml/liều, trong đó chứa ≥ 3000 virut sởi/0,5 ml/liều 1.5. Sản xuất vacxin sởi tại Việt nam Mỗi năm chương trình Tiêm chủng mở rộng cần khoảng 1,5 triệu liều vacxin sởi cho trẻ trong độ tuổi 9 – 12 tháng tuổi (tiêm mũi 1) và tiêm bổ sung mũi 2 trong trường hợp cần thiết. Vacxin sởi sử dụng cho chương trình Tiêm chủng mở rộng hiện nay đều là vacxin nhập ngoại, lý do là chưa có vacxin sởi sản xuất tại Việt nam. Năm 2004, Việt Nam nhận được dự án xây dựng cơ sở sản xuất vacxin sởi do Chính phủ Nhật và tổ chức JICA giúp đỡ bằng nguồn vốn ODA không hoàn lại. Polyvac là đơn vị được Bộ Y tế chỉ định thực hiện dự án này. Đến tháng 4/2006 nhà máy xây dựng hoàn thành, bắt đầu giai đoạn chuyển giao công nghệ sản xuất vacxin sởi. Tháng 11/2007, 3 loạt vacxin đầu tiên sản xuất thành công, được cấp chứng chỉ chất lượng và được phép sử dụng tiêm thử nghiệm trên người tình nguyện (thử nghiệm lâm sàng). Chủng sản xuất vacxin sởi là chủng AIK-C, được sản xuất trên trứng gà sạch nhập khẩu từ Đức. Vacxin sởi sản xuất tại Polyvac là vacxin sống giảm độc lực đông khô. 1.6. Kiểm định vacxin sởi sản xuất tại Việt nam Vacxin sởi sản xuất tại Polyvac có chất lượng theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quy định, sản phẩm thành phẩm sau khi đông khô sẽ được kiểm tra chất lượng thông qua 6 thử nghiệm sau : Thử nghiệm vô trùng Thử nghiệm nhận dạng Thử nghiệm hiệu giá và ổn định nhiệt Thử nghiệm độ ẩm tồn dư Thử nghiệm an toàn chung trên động vật Thử nghiệm quan sát trạng thái vacxin Thử nghiệm hiệu giá của vacxin sởi là thử nghiệm nhằm xác định hàm lượng virut sởi. Có nhiều phương pháp chuẩn độ hiệu giá như : - Chuẩn độ vi lượng, gây nhiễm trên tế bào cảm thụ Vero kín 1 lớp, quan sát đám hoại tử và tính hàm lượng virut theo công thức Kaber hoặc Reed - Muench, đơn vị tính CCID50/0,5 ml (liều huỷ hoại 50% tế bào). - Phương pháp tạo đám hoại tử, gây nhiễm trên tế bào cảm thụ Vero kín 1 lớp, nhuộm và đếm số lượng đám hoại tử, tính hàm lượng virut, đơn vị tính PFU/0,5 ml. Hiện tại Polyvac đang sử dụng phương pháp tạo đám hoại tử để chuẩn độ hiệu giá vacxin sởi sản xuất tại cơ sở. Theo tiêu chuẩn của WHO, vacxin sởi phải chứa ≥ 3000 CCID50 / liều / 0,5 ml (hoặc ≥ 3000 PFU / liều). Tương đương ≥ 3 lg CCID50 / liều / 0,5 ml (hoặc ≥ 3 lg PFU / liều) 1.7. Thử nghiệm lâm sàng Theo quy chế cấp phép sử dụng vacxin của Bộ Y tế, mọi vacxin mới đều phải qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, là giai đoạn thử nghiệm trên người tình nguyện nhằm đánh giá: tính an toàn và tính sinh miễn dịch nhằm bảo vệ người tiêm vacxin không mắc bệnh sởi. Vacxin sởi sản xuất tại Polyvac mặc dù có quy trình công nghệ giống với vacxin đang sản xuất tại Nhật Bản, nhưng chưa từng được sử dụng tại Việt Nam nên cũng được coi như là vacxin mới, bắt buộc phải thực hiện thử nghiệm lâm sàng trên người tình nguyện. Tất cả trẻ tình nguyện đều được kiểm tra sức khỏe và lấy máu kiểm tra kháng thể sởi trước khi tiêm, sau tiêm 6 tuần lấy máu để kiểm tra kháng thể sởi, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch. Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá bằng tạo đám hoại tử 2.1.1. Nguyên vật liệu 2.1.1.1. Mẫu chuẩn Sử dụng mẫu chuẩn vacxin sởi do Viện Kitasato Nhật Bản cung cấp, ký hiệu mẫu chuẩn M16-6. Hiệu giá quản lý 104,2 – 104,6 PFU/0,5ml ). Bảo quản ở - 700C 2.1.1.2. Hoá chất, môi trường Nước hồi chỉnh vacxin (Polyvac sản xuất) MEM (Polyvac pha) 7,5% NaHCO3 (Polyvac pha) Kháng sinh P-S (Polyvac pha) Huyết thanh bê (BS) (Gibco - Mỹ) Glutamin 200mM (Polyvac pha) Huyết thanh bê bào thai (FBS) (Code No. 16140-071, Gibco - Mỹ) Agarose ME (Code No. 50013R- Iwai - Nhật) Eagle MEM (Code No. 05901-Nissui ) Đỏ trung tính 0,2% (Neutral Red ) (Polyvac pha) 2.1.1.3. Dụng cụ Dụng cụ sử dụng phải được tiệt trùng để đảm bảo vô trùng. Phương pháp tiệt trùng sử dụng là : sấy khô, hấp ướt hoặc chiếu tia γ... Pipet 10ml (Code No.7087-10, Pyrex - Mỹ) Pipet Aid (Code No. 4910, Coning - Mỹ) Pipet man 10 ~ 200µl (Code No. F123601, Gilson – Pháp) Pipet Man 100 ~ 1000µl (Code No. F123602, Gilson – Pháp) Pipet Man 1ml ~ 5ml (Code No. F123603,Gilson – Pháp) Đầu týp 10 ~ 200µl (Coning - Mỹ) Đầu típ 100 ~ 1000µl (Coning - Mỹ) Đầu típ 1ml ~ 5ml (Coning - Mỹ) Týp thuỷ tinh đáy tròn 5ml (Code No. 9820-12, Pyrex - Mỹ) Chai thuỷ tinh 100ml (Dural - Đức) Chai thuỷ tinh 1000ml (Dural - Đức) Giá cắm týp (Việt Nam ) Bơm tiêm chia liều 5 - 10ml (Socorex- Nhật) Máy trộn (Code.No TM- 1 , AS ONE ) Kính hiển vi (Code No. IX51- 71 PHP, OLYMPUS ) Tủ ấm CO2 (Code No. MCO175 , SANYO ) Bể điều nhiệt (AS ONE ) Khăn không sinh bụi (Hàn Quốc) Bình đựng chứa môi trường thải (Code No. 2126-5000, Nalgene- Mỹ) Phễu inox (Việt Nam) Phiến nuôi tế bào 6 giếng (Coning - Mỹ) Nhãn ghi tên mẫu (Nhật) Chai 2,5L (Trung Quốc) Bút phớt (Nhật) Chậu nhựa (Việt Nam) 2.1.1.4. Tế bào sử dụng Tế bào Vero (FV) là tế bào cảm thụ với virut sởi được sử dụng để chuẩn độ hiệu giá vacxin sởi. Tế bào Vero được nuôi trên phiến 6 giếng với nồng độ 20´104 tế bào / ml ´ 3ml / giếng. Nuôi ở 370C ± 10C , 5% CO2 trong vòng 2 ~ 3 ngày, tế bào kín 1 lớp dùng để chuẩn độ. 2.1.1.5. Môi trường sử dụng GM5%BS môi trường phát triển nuôi tế bào và pha loãng mẫu Môi trường phủ thạch lần 1: Hộn MEM 2 lần (không có đỏ trung tính) với Agarose1% theo tỷ lệ 1:1 Môi trường phủ thạch lần 2 : Hộn MEM 2 lần (có đỏ trung tính) với Agarose1% theo tỷ lệ 1:1 Chuẩn bị MEM 2 lần Pha MEM 3 lần (1000 ml) + Eagle MEM 28,2g + WFI vừa đủ 1000ml Sấy tiệt trùng 1210C / 15 phút Chia ra chai : 66,7ml / chai (sử dụng chai đã sấy tiệt trùng) Sử dụng FBS đã bất hoạt để pha MEM 2 lần Sử dụng nước WFI đã sấy tiệt trùng ở 1210C/30 phút để pha MEM 2 lần Thành phần MEM 2 lần (Không có đỏ trung tính) (1) (ml) MEM 2 lần (Có đỏ trung tính) (2) (ml) MEM 3 lần 66,7 66,7 FBS 4,0 4,0 7,5% NaHCO3 4,0 4,0 Glutamin 200 mM 2,0 2,0 P-S 1 1 Đỏ trung tính 0,2% - 10 WFI 22,3 12,3 Tổng 100 100 MEM 2 lần ngâm bể điều nhiệt ở nhiệt độ ~ 440C khoảng 10 ~ 15 phút trước khi trộn với Agarose 1% để phủ thạch. Chuẩn bị pha Agarose 1% + Agarose 1,0 g + WFI vừa đủ 100 ml Sấy tiệt trùng 1210C/15 phút Agarose 1% chỉ pha sử dụng trong ngày. Chỉ sử dụng chai thủy tinh loại 500 ml để pha thạch Agarose 1% Sau sấy tiệt trùng, lấy ra khỏi lò sấy bảo quản ở nhiệt độ ~ 440C trong bể điều nhiệt cho đến khi trộn với MEM 2 lần. Pha môi trường GM5% BS Thành phần Thể tích (ml) MEM 930 BS 50 NaHCO3 7,5% 15 Kháng sinh (P- S) 5 Tổng 1000 2.1.2. Quy trình thực hiện 2.1.2.1. Chuẩn bị mẫu và mẫu chuẩn Chuẩn bị hộp xốp để mẫu có sẵn đá vụn Lấy mẫu và mẫu chuẩn từ tủ cất mẫu ra đặt vào hộp xốp đã chuẩn bị ở trên Vận chuyển hộp chứa mẫu đến nơi thử nghiệm. Mẫu được bảo quản như vậy cho đến khi pha loãng 2.1.2.2. Pha loãng, gây nhiễm, nuôi Thực hiện trong điều kiện vô trùng, trong Clean bench Chuẩn bị cho pha loãng mẫu và mẫu chuẩn bậc 5 và 10: xếp týp pha loãng ra giá cắm týp, căn cứ vào số lượng mẫu và số nồng độ pha loãng xếp đủ theo thứ tự. Hút 1,8ml GM5%BS cho týp pha loãng bậc 10 (1 lg) và hút 1,1ml GM5%BS cho týp pha loãng bậc 5 (0,5 lg ) Lấy các khay tế bào (phiến 6 giếng) từ tủ 370C, 5%CO2 ra, soi trên kính hiển vi để quan sát tế bào, kiểm tra tình trạng tế bào. Tế bào kín đều 1 lớp đủ điều kiện cho thử nghiệm. Loại bỏ nước nổi nuôi tế bào trong phiến (sử dụng chai nhựa 5L và phễu inox để thực hiện thao tác này) trải khăn không sinh bụi thấm cồn lên bàn. Úp ngược phiến lên khăn không sinh bụi thấm cồn đã chuẩn bị sẵn để thấm hết môi trường còn sót lại trong giếng tế bào. Dán nhãn về phía bên phải phiến với thông tin: tên mẫu, số phiến Hồi chỉnh vacxin: 0,7 ml (đối với mẫu chuẩn M16-6) và 5,5 ml (đối với vacxin mẫu do Polyvac sản xuất) Pha loãng bậc 10: cho 0,2ml mẫu vào týp có sẵn 1,8ml GM5% BS → trộn đều, (mẫu đã được pha loãng ở nồng độ 10-1 ở týp này). Pha loãng nồng độ tiếp theo, thêm 0,2ml mẫu ở nồng độ 10-1 vào týp chứa 1,8ml môi trường ở týp kế tiếp → trộn đều, được mẫu pha loãng 10-2 tiếp tục làm như vậy đến khi hết nồng độ pha loãng Pha loãng bậc 5: cho 0,5 ml mẫu pha loãng 10-1 sang týp chứa 1,1ml GM5%BS → trộn đều, mẫu được pha loãng 10-1,5. Pha loãng 10-2,5 cũng thực hiện như vậy từ týp pha loãng 10-2 tiếp tục làm như vậy đến khi hết nồng độ pha loãng Ví dụ : Quy trình pha loãng như sau: Bậc pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 Mẫu 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml GM5%BS 1,8 ml 1,8 ml 1,8 ml 1,8 ml Bậc pha loãng 10-1,5 10-2,5 10-3,5 Mẫu 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml GM5%BS 1,1 ml 1,1 ml 1,1 ml 3 nồng độ pha loãng cuối cùng sẽ được gây nhiễm, gây nhiễm 0,1ml/giếng ×2 giếng/1 nồng độ. Dưới đây là sơ đồ minh hoạ việc gây nhiễm trên phiến 6 giếng 10-3 10-3,5 10-4 Lặp lại bước (6) và (7) với các mẫu và mẫu chuẩn còn lại cho đến hết Sau gây nhiễm láng phiến sang trái, phải để lượng mẫu gây nhiễm phủ kín bề mặt tế bào, xếp phiến vào khay hấp phụ ở điều kiện 37 ± 10C, 5%CO2 trong 60 phút Kết thúc thời gian hấp phụ lấy khay tế bào đặt vào Clean bench, lấy MEM 2 lần và Agarose 1% chuẩn bị sẵn từ bể điều nhiệt ra, dùng khăn không sinh bụi thấm cồn lau sạch bên ngoài 2 chai và chuyển vào Clean bench, lau lại một lần nữa trong clean bench. Đổ chai MEM 2 lần vào chai Agarose (tỷ lệ 1:1) lắc đều, dùng pipet thuỷ tinh 10ml vô trùng để phủ thạch, phủ 3ml/giếng. Phủ xong phiến nào phải lắc nhẹ phiến cho đều môi trường gây nhiễm và môi trường phủ thạch hoà đều vào nhau. Để nguyên số phiến vừa phủ thạch tại chỗ cho đến khi đông hoàn toàn (20 ~ 30 phút) nuôi ở điều kiện 37 ± 10C, 5%CO2 trong 7 ngày Sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 37 ± 10C, 5%CO2 tiến hành phủ thạch lần 2 có đỏ trung tính, thành phần của phủ thạch lần 2 như mô tả ở 2.1.1.5 Tiếp tục nuôi ở 37 ± 10C, 5%CO2 trong vòng 3 ~ 4 ngày Đếm PFU (mầu trắng trên nền mầu đỏ) Tính kết quả 2.1.2.3. Phương pháp tính kết quả Căn cứ vào số lượng đám huỷ hoại đếm được (PFU) Quy tắc tính kết quả Tính hiệu giá tại từng nồng độ pha loãng, Tính giá trị trung bình giữa các nồng độ pha loãng của cùng 1 mẫu Tính giá trị trung bình của mẫu Chuyển đổi đơn vị tính hiệu giá Chỉ tính kết quả với các điều kiện sau Nồng độ gây nhiễm có số đếm PFU trong khoảng ≥ 10 và <100 PFU ở cả 2 phiến gây nhiễm Cùng nồng độ gây nhiễm có số đếm PFU chênh nhau <3,16 lần (tương đương 0,5 lg PFU/0,5 ml) Cùng một mẫu có 2/3 nồng độ gây nhiễm thoả mãn điều kiện a và b Ví dụ tính như sau 10-2 10-2,5 10-3 Tính hiệu giá tại các nồng độ gây nhiễm Tại nồng độ gây nhiễm 10-2 M = ( 55 + 52 ) / 2 = 53,5 Hiệu giá = lg102 + lg 53,5 =2 + 1,73 = 3,73 (1) Tại nồng độ gây nhiễm 10-2,5 M = ( 26 + 21 ) /2 = 23,5 Hiệu giá = lg102,5 + lg 23,5 = 2,5 + 1,37 = 3,87 (2) Tính hiệu giá của mẫu Hiệu giá mẫu = [ (1) + (2) ] /2 = ( 3,73 + 3,87 ) / 2 = 3,8 PFU / 0,1ml (3) Chuyển đổi : (3) + lg5 = 3,8 + 0,7 = 4,5 PFU / 0,5ml Tính hiệu giá trung bình Hiệu giá mẫu (1) = 104,50 Hiệu giá mẫu (2) = 104,44 Hiệu giá mẫu (3) = 104,52 → Trung bình = 104,49 Kết quả chuẩn độ hiệu giá có giá trị khi thỏa mãn 2 điều kiện sau : 1) Hiệu giá mẫu chuẩn M16-6 (Viện Kitasato - Nhật Bản cung cấp) nằm trong khoảng 4,2 ~ 4,6 lg PFU / 0,5ml. 2) Chênh lệch hiệu giá giữa các lọ mẫu của cùng một mẫu trong cùng một lần thử nghiệm ≤ 0,5 lg PFU / 0,5 ml 2.2. Phương pháp khảo sát hiệu giá vacxin sởi dùng cho thử nghiệm lâm sàng 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu 3 loạt vacxin liên tiếp sản xuất 11/2007 được tiêm thử nghiệm lâm sàng trên trẻ em tình nguyện tại huyện An Lão - Hải Phòng. Quá trình thực hiện thử nghiệm lâm sàng từ 3 ~ 7/11/2008. Mã số 3 loạt vacxin : M-0107 ; M-0207 và M-0307 Để kết quả thử nghiệm lâm sàng có tính khách quan, chúng tôi lựa chọn vacxin Rouvac hiện đang được sử dụng trong chương trình Tiêm chủng mở rộng để tiêm đối chiếu, vacxin đối chiếu có ký hiệu R. Trong khuôn khổ của khóa luận chúng tôi chọn ngẫu nhiên 5 xã để lấy mẫu khảo sát hiệu giá trước tiêm và hiệu giá thu hồi sau tiêm. 5 xã gồm: Bát Tràng, An Thái, Quang Trung, Trường Sơn và An Tiến. Mỗi xã đều tiêm đủ 3 loại vacxin do Polyvac sản xuất và vacxin đối chiếu. Mẫu vacxin trước tiêm: lấy ngay tại kho của Polyvac trước khi giao mẫu cho nhóm vận chuyển mẫu đến địa điểm tiêm thử nghiệm lâm sàng. Mẫu được bảo quản < 80C (thông thường bảo quản -300C tại Polyvac) cho đến khi kiểm tra hiệu giá. Như vậy trước tiêm có 4 mẫu: M-0107(T) ; M-0207(T) ; M-0307(T) và R(T) Mẫu thu hồi sau tiêm: thu hồi lọ vacxin ngay tại bàn tiêm của 5 xã (lọ nguyên chưa mở nắp, được bảo quản trong hộp xốp có phiến đá lạnh trong suốt thời gian tiêm), vận chuyển về Polyvac cũng trong điều kiện bảo quản lạnh (<80C) cho đến khi kiểm tra hiệu giá. Như vậy mẫu thu hồi sau tiêm là 20 mẫu (4 mẫu/1 xã), ký hiệu mẫu: M-0107/Bát Tràng,… 2.2.2. Quy trình chuẩn độ hiệu giá Thực hiện chuẩn độ hiệu giá 24 mẫu trên theo quy trình mô tả ở 2.1.2 2.2.3. Phương pháp khảo sát Tiêu chuẩn: ≥ 1000 PFU / 0,5 ml / 1 liều, tương đương ≥ 3 lg PFU / 0,5 ml / 1 liều (theo tiêu chuẩn của WHO) Khảo sát kết quả 4 mẫu vacxin trước tiêm và 20 mẫu thu hồi sau tiêm. Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xác định hiệu giá vacxin sởi mẫu M-0107 Bảng 1: Kết quả xác định hiệu giá vacxin sởi mẫu M-0107 Tên Mẫu Nồng độ gây nhiễm Hiệu giá lgPFU/0,5ml Hiệu giá trung bình 10-2 10-2,5 10-3 Trước tiêm M-0107(T) 71 65 19 19 4 11 4