Đề tài Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật

Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật CONCEPTS ON BIOTECHNOLOGY Ph­¬ng ph¸p t¹o gièng Kh¸i niÖm Kü thuËt chuyÓn gen vµo thùc vËt lµ kü thuËt ®­a mét hay nhiÒu gen l¹ ®· ®­îc thiÕt kÕ ë d¹ng ADN t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo lµm cho gen l¹ g¾n vµo bé gen tÕ bµo chñ. Trong tÕ bµo chñ, c¸c gen nµy ho¹t ®éng tæng hîp nªn c¸c protein/enzyme ®Æc tr­ng dÉn tíi viÖc xuÊt hiÖn c¸c ®Æc tÝnh míi cña c¬ thÓ chuyÓn gen. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật Trực tiếp: súng bắn gen, vi tiêm, xung điện, siêu âm, hóa chất. Gián tiếp: chuyển gen thông qua sinh vật trung gian (Virus hoặc vi khuẩn). 1.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens Là một loài vi khuẩn đất thuộc nhóm vk Gram âm Có chứa 1 loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid khi chuyển vào thực vật sẽ gây bệnh khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy roots) Chủng Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes được sử dụng trong chuyển gen vào thực vật. Agrobacterium tumefaciens Crown Gall Disease Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid). Ti-Plasmid có kích thước khoảng 200kb đã được xác định trình tự, gồm có 3 vùng cơ bản trong vận chuyển ADN và cảm ứng hình thành khối u là T-DNA, các bờ T-DNA và vùng Vir. Ti Plasmid Tumor- producing genes Virulence region Opine catabolism ORI T-DNA region DNA between L and R borders is transferred to plant as ssDNA; T-DNA encoded genes can be substituted by target genes 1.2.Cơ chế chuyển gen gây u thực vật của vi khuẩn A. tumefaciens Overview of the Infection Process - Cơ chế chuyển gen gây u: Khi cây bị thường sẽ tiết ra 1 chất độc vết thương có cấu trúc dạng hợp chất phenol. Acetosyringone hấp dẫn vi khuẩn đất tới các mô đó, là chất hoạt hoá nhóm gen vir (gồm 6-9 đơn vị sao mã) điều khiển sinh tổng hợp các sản phẩm (protein/enzyme). Các protein/enyme có các chức năng sau: + Cắt vùng bờ trái, bờ phải (T-DNA) giải phóng sợi đơn T-DNA + Bảo vệ sợi đơn T-DNA vừa cắt. + Vận chuyển sợi đơn T-DNA xâm nhập TBTV và gắn vào NST (hệ gen). Do trên đoạn T-DNA chứa một số gen mã hoá sinh tổng hợp phytohormone (auxin và cytokinin) kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, không được kiểm soát dẫn đến hình thành khối u. Đây là cơ chế chuyển gen tự nhiên vào thực vật của vi khuẩn A. tumefaciens. 1.3. Thiết kết vector chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens Vector Ti-plasmid tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens có một số hạn chế trong khi chuyển gen vào thực vật vì: - Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb). - Ti-plasmid không tự tái bản trong E. coli. - Đoạn T-DNA của Ti-plasmid mang các gen điều khiển sinh tổng hợp auxin và cytokinin cản trở sự tái sinh của cây trong qúa trình nuôi cấy. Nó còn chứa các gen điều khiển tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây ảnh hưởng đến năng suất. - Ti-plasmid không mang gen chỉ thị (reporter, seletion genes) nên khó chọn lọc cây chuyển gen. - Các điểm cắt của RE nằm rải rác nên khó thao tác. Do đó, cần thiết kế lại Ti-plasmid tự nhiên để đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của một vector chuyển gen thực vật. Quá trình thiết kế vector này như sau: * Nguyên lý chung: - Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển T-DNA gắn vào NST tế bào thực vật. - Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng T-DNA. Có 2 loại hệ thống vector chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens: - Vector đồng liên hợp (co-integrated vector) * Dựa trên sự tái tổ hợp của 2 loại plasmid. - Plasmid 1: Có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E. coli nên tái bản được trong E. coli. Có chứa phần bờ trái hoặc bờ phải, có các gen mục tiêu và các gen chỉ thị, có đoạn ADN tương đồng Ti-plasmid. - Plasmid 2: là Ti-plasmid cải tiến. Cắt bỏ toàn bộ phần T-DNA, giữa lại vùng bở phải hoặc bờ trái, giữ lại vùng gen Vir, bỏ đi vùng tổng hợp enzyme di hóa opine. Vector này được nhân dòng trong vi khuẩn A. tumefaciens. Sau đó, cho tương tác 2 loại plasmid 1 và plasmid 2, kết quả tạo ra vector liên hợp được sử dụng chuyển gen vào thực vật. Plasmid này khá phức tạp nên ít được sử dụng - Vetor nhị thể (Binary vector): là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: - Plasmid 1: Có nguồn gốc từ E. coli nhưng được thiết kế lại: + Thêm gốc tái bản trong A. tumefaciens. + Gắn các gen mục tiêu, promoter, gen chỉ thị nằm giữa LB, RB. - Plasmid 2: là Ti-plasmid được cắt bỏ toàn bộ các phần LB, RB, T-DNA, gen mã hóa enzyme sử dụng opine nhưng vẫn giữ lại góc tái bản trong A. tumefaciens, vùng gen Vir. Chuyển cả plasmid 1 và plasmid 2 vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Binary vector system Co-integrative and binary vectors Binary vector LB RB Co-integrative 1.4. Qui trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Tạo cây in vitro. - Cắt tạo các đĩa lá nhằm tạo vết thương cho mô thực vật. - Ngâm đĩa lá trong dung dịch có chứa vi khuẩn A.tumefaciens mang hệ thống vector chuyển gen trong vài phút đến vài chục phút. Trong dung dịch có bổ sung acetosyringone. - Nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy. Cho thêm thời gian để vi khuẩn A. tumefaciens sống và chuyển gen vào tế bào lá trong thời gian 2-5 ngày. - Lấy mẫu ra và diệt khuẩn A. tumefaciens bằng dung dịch kháng sinh cefotaxim (không gây độc cho mô thực vật) trong thời gian 15-30 phút. - Vớt mô, thấm khô và cấy nuôi cây trên môi trường chọn lọc (kháng sinh, mantose, PPT, v.v.) trong một thời gian nhất định tuỳ thuộc loài cây. - Chọn lọc các mô sống mang gen chuyển, cấy lên môi trường tái sinh. - Phân tích sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển bằng các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Southern blot, Norhern blot, Western blot). - Thu được các dòng cây chuyển gen. - Đánh giá các dòng cây chuyển gen (biotest) trong phòng cách ly. - Giới thiệu vật liệu chuyển gen./. 1.5. Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào thực vật Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen: là sử dụng những công cụ (súng bắn gen) có thể tạo được áp lực trong không khí đẩy được các viên đạn (bằng kim loại trơ, đường kính khoảng 1µm) có phủ các vector chuyển gen đi với tốc độ 1300 ms. Với tốc độ bắn này, viên đạn có thể xuyên quan các lớp tế bào bên ngoài của mô và xâm nhập vào các tế bào bên trong gặp nhân và gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào. Chọn lọc tế bào mang gen và tái sinh thành cây chuyển gen. Phương pháp “bắn gen” DNA Nhiễm sắc thể thực vật Gen quan tâm Các hạt + Ưu điểm: - Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào. - Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật. - Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. - Các vector mang gen mục tiêu có cấu tạo đơn giản. - Chỉ cần một lượng nhỏ plasmid DNA. - Biểu hiện tạm thời gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vài ngày sau khi biến nạp. + Nhược điểm: - Có thể chuyển nhiều bản sao được chuyển vào tế bào gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen. - Hiệu quả chuyển gen thấp. - Đòi hỏi thiết bị đắt tiền như súng bắn gen, đạn vàng, tungten. * Phương pháp chuyển gen bằng xung điện: - Thường được sử dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Tế bào trần (protoplast) là tế bào được loại bỏ thành tế bào bằng việc xử lý tế bào với enzyme xenlulaza, pectinaza. - Sử dụng dòng điện có hiệu điện thế cao phát xung trong thời gian cực ngắn khoảng 5-6/1000 giây để tạo ra trên bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có đường kính 30 m, mà qua đó các ADN biến nạp có thể xâm nhập vào tế bào. + Ưu điểm: Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định, đặc biệt đối với các gen đơn. + Nhược điểm: Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều loài thực vật còn khó khăn. Phương pháp chuyểng gen nhờ PEG (polyethylen glycol): là phương pháp chuyển gen vào tế bào trần. Ở nồng độ cao PEG làm ADN cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan mà kết dinh lại trên màng sinh chất. Bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc pH cao ADN biến nạp sẽ được chuyển vào trong tế bào trần. + Ưu điềm: - Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công. - Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. + Nhược điểm: - Quá trình biến nạp khó điều khiển. Số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thể lớn. - Tần số biến nạp thành công biên động giữa các thí nghiệm. - Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp tế bào trần, gây khó khăn việc phân tích biểu hiện gen. - Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều loài thực vật còn khó khăn. Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm (micoinjection): Sử dụng các thiết bị hiển vi, vi thao tác. Sử dụng các kim tiêm rất mảnh để đưa các đoạn ADN trực tiếp vào nhân của tế bào trần, tế bào tiền phôi của hợp tử hay hạt phấn. + Ưu điểm: - Lượng ADN được biến nạp tuỳ ý và xác định. - ADN được đưa đúng vị trí mong muốn, thậm chí nhân tế bào. - Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như tế bào hạt phấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thực hiện được. + Nhược điểm: - Mỗi lần biến nạp chỉ đưa vào một tế bào duy nhất. Do vậy, đây là phương pháp tốn nhiều thời gian và công sức. - Chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao. - Đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền. 1.6. Các hướng nghiên cứu chính tạo cây lương thực biến đổi gen Kháng sâu và bệnh Cải tiến chất lượng dinh dưỡng Kháng thuốc diệt cỏ Kháng các yếu tố vô sinh bất lợi Các hướng nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen Tạo cây lâm nghiệp kháng sâu và côn trùng Tạo cây lâm nghiệp kháng được virus, vi khuẩn, nấm bệnh Tạo cây lâm nghiệp kháng được các điều kiện bất lợi của môi trường Tạo cây lâm nghiệp có chất lượng gỗ tốt Tạo cây lâm nghiệp sinh trưởng nhanh 1.7. Một số thành tựu về tạo cây trồng chuyển gen biến đổi gen Lúa chứa vitamin A, E, Fe, Zn Đu đủ kháng virus đốm vòng Chuối chín chậm Khoai kháng vi rus Ngô cao lysin Ca chua chín chậm Ng« kh¸ng thuèc diÖt cá C©y ®èi chøng C©y chuyÓn gen Khoai t©y kh¸ng bä ¨n l¸ §èi chøng C©y chuyÓn gen 134 triÖu tre thiÕu Vit A 3.1 triÖu trÎ bÞ mï tr­íc tuæi ®Õn tr­êng 2 triÖu bÞ tö vong Riªng §N ¸ 5 triÖu trÎ bÞ mï Phytoene Synthase Phytoene desaturase -Caroten biosynthesis Thö b¾p c¶i chuyÓn gen Bt kháng sâu ăn lá Sản xuất thuốc chữa bệnh bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA ở thực vật