Đề tài Lên men cơm rượu theo phương pháp truyền thống

có. - Tổng số bào tử nấm mốc trong 1kg gạo, không lớn hơn: 10.000 bào tử. - Chọn hạt to, khỏe để hạn chế lượng vi sinh vật trên hạt. Kiểu hạt Số lượng vi sinh vật tính bằng 1000 khuẩn lạc/1g hạt Nấm mốc Vi khuẩn, nấm men Số lượng chung A. flavus Asp. oryzae Penicillium Bình thường 1 0,3 0,01 0,25 0,7 Non, xanh, lép >2 1 0,05 0,5 6,5 Độc tố vi nấm aflatoxin: không phát hiện thấy bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. 11 Tên các loại nấm mốc Độc tố do chúng tiết ra Asp. flavus Asp. paraciticus Aflatoxin Asp. ochraceus Penicillium verrucosum Ochratoxin Asp. terreus Territrem Eurotium chevalieri Eurotium telodami Echinulin Fusarium sporotrichiodes T2 – toxin và trichothecenes Penicillium citreonigrum Citreoviridin Penicillium citrinum Citrinin Năng lượng: 100g gạo cung cấp năng lượng là 360 Kcal. 2. BÁNH MEN: 2.1. : - . - . - . - : bao gồm các vị thu ... 12 : bột thuốc bắc 20,5g bao gồm: Quế: 7g ; đại hồi: 6g ; tiểu hồi: 5g ; thảo quả: 1,5g ; sa nhân: 1g 2.2. Vi sinh vật trong bánh men: 2.2.1. Nấm men: Chủ yếu gồm hai giống: - Endomycopsis (chủ yếu là Endo.Fibuligenes). - Saccharomyces (chủ yếu là S. cerevisiae). Endomycopsis fibulligenes là loài nấm men rất giàu enzym amilase, glucoamilase. Do đó chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa . Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, raffinose, galactose. Chúng có khả năng lên men được nhiệt độ cao (khoảng từ 36 – 40oC ). Chúng có khả năng chịu được độ axit. Đặc biệt chúng có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 – 0,025%. Đặc điểm này rất thuận lợi cho nên khi cần sử dụng thuốc sát trùng. Đặc điểm quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả năng lên men các loại nguyên liệu rất khác nhau như : gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12 – 14 % có khi 16 – 18%. Nồng độ rượu trong dung dịch lên men có thể đạt 10 – 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 – 32o C. Ngoài hai loài nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loài nấm men dại khác nhau. Chúng vừa có khả năng thuỷ phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển hoá đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hoá này còn thấp. Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao, có khi lên tới 60 -65o C và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0,005-1%. 2.2.1.1.Một số tính chất sinh lý của nấm men: : - Nhiệt độ tối ưu khoảng 28 – 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác 13 làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. - Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men giảm nhanh, chủ yếu là dễ bị nhiễm vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. - Khi lên men ở 29,50C, tổn thất do tạo sinh khối là 7,37 %, ở 17,50C tổn thất là 5,32 % và nếu lên men dịch đường ở 100C thì tổn thất chỉ chiếm 4,42 % lượng đường có trong dung dịch. - Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều esther, aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. : - Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH nhất định. - Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcohol ethylic là 4,5 – 5,5. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8 – 5,2 nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. - Tăng pH sẽ dễ bị nhiễm khuẩn; glycerin tạo nhiều hơn và giảm hiệu suất lên men. Vì vậy, khi gây men giống trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,8 – 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. : - Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. - Nồng độ dịch đường thấp làm giảm năng suất thiết bị lên men, tốn hơi khi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải. - Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16 – 18 % ( tùy theo mức độ thuần khiết), tương đương 13– 15% 14 đường, để sau khi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 – 9,5 % V. : - Trong điều kiện sản xuất, dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó đảm bảo vô trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. - Có thể dùng hóa chất khác nhau như clorua vôi, formalin, fluosilicat natri. Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chế được phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nấm men. Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không vượt quá 0,02% so với dịch lên men. - Tùy theo tính chất và mức độ phân ly của mỗi acid mà tác hại của chúng lên nấm men sẽ không giống nhau. 2.1: Ảnh hưởng của một số acid tới nấm men Acid Nồng độ Thời gian tiêu diệt, giờ Làm ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men % Mol/l % Mol/l HCl 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46 H2SO4 0,39 0,039 1,30 0,123 2,04 H3PO4 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28 CH3COOH 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25 Acid lactic 0,90 0,100 3,00 0,333 1,27 - Ngoài ra, trong dịch đường lên men luôn chứa một lượng furfurol, melanoidin, cũng gây ảnh hưởng tới nấm men. 15 2.2.1.2. : - . - . - . 2.2.2. : 2 . thủy . : Mucor Rhizopus. 2.2.2.1.Mucor: - : 25 – 30oC. - . - Mucor rouxxi (32 – 35o . Ở Mucor rouxii, ngoài hệ men amylase còn có enzym rượu hóa nên trong điều kiện yếm khí, enzym của Mucor rouxii có thể biến đường thành rượu. Hiện tượng này rất hay gặp trong quá trình sản xuất nấm mốc bề mặt trên môi trường chất rắn có tinh bột giữ ở nhiệt độ cao (39 – 400C). Khả năng vừa có thể đường hóa vừa có thể rượu hóa của nấm mốc được ứ ylose. 2.2.2.2.Rhizopus: - : 40o 45oC. 16 - . - Rhizopus thường được nuôi cấy, phát triển trên môi trường dịch thể giàu dinh dưỡng và có thông khí, hệ enzym amylase tương đối hoàn chỉnh, nên thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương pháp amilose. - R. oryzae . 2.2.3. Vi khuẩn: - Trong bánh men thuốc bắc thấy nhiều loài vi khuẩn phát triển. Trong đó thấy chủ yếu là loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. - Các loài vi khuẩn thường làm chua môi trường. Trong thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra là có lợi vì sẽ làm giảm pH của môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men và nấm mốc phát triển. Tuy nhiên, pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men. Mặt khác, nếu trong dịch lên men có mặt của oxy thì vi khuẩn axetic sẽ oxy hoá rượu thành axit axetic. Qúa trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành. - Ngoài ra, trong bánh men còn có nhiều loài vi khuẩn khác chưa xác định được (tạm xếp vào loại vi khuẩn tạp nhiễm). 2.3. : 2.4. : - . - N . - . - : = 100 : 2 – 3 : 2 – 3 : 50 – 60. 17 - . - Vào ổ men: trộn bột gạo, men gốc, và bài thuốc cái cho thật . - Theo dõi và mở men: sau khi vào ổ men 2 ngày thì mở men, chuyển các bánh men vào nong thưa để hong khô. - Hong khô: có thể hong men trên gác bếp hay sấy khô bằng bếp than. ngâm men hong khô nước 18 3. : 3.1. : - , vận chuyển nguyên liệu, nấu nguyên liệu, pha loãng dung dịch, làm nguội bán thành phẩm và thành phẩm, vệ sinh thiết bị, cấp nước cho lò hơi. - , chữa cháy trong khu vực sản xuất. 3.2. : nước mặt (sông, ngòi) hoặc nước ngầm (giếng). 3.3. : - Phải trong suốt, không màu, không mùi. 3.1 Yêu cầu hàm lượng muối trong nước (mg/l) Cl - SO4 2- As Pb F- Zn Cu NO3 - 0,5 80 0,05 0,1 3 5 3 40 - Không cho phép có NH3 và muối của acid nitric. - Đối với quá trình lên men rượu, tổng hàm lượng các muối có trong nước là 2.000mg/lít có tác dụng kích thích quá trình lên men, nhưng hàm lượng đạt tới 3.000mg/lít lại có tác dụng xấu đến quá trình lên men. - 2+ 2+ /l. - : không có hoặc chỉ có vết của các muối kim loại nặng như Hg, Ba,… Chất cặn không vượt quá 1,000mg/lít. - có hại lại dễ phát triển. Quá trình lên men nếu pH > 7 sẽ thúc đẩy quá trình tạo thành glycerin. 19 3.2: Thành phần các muối hoà tan trong nước ảnh hưởng đến quá trình sản xuất rượu. Các loại muối Lượng muối (g/l nước) Ảnh hưởng đến đường hoá Ảnh hưởng đến dịch hoá Ảnh hưởng đến lên men + tốt - xấu 0 không + tốt - xấu 0 không + tốt - xấu 0 không CaSO4 200 + + 0 MgSO4 200 0 0 0 FeSO4 100 - 0 0 0 NaHCO3 400 0 - 800 - Ca(HCO3)2 200 - + - 400 - 0 + 0 - NaCl 400 0 0 - - 800 0 0 - MgCl2 400 + + 0 - CaCl2 200 + + + - 400 + + + Ca(NO3)2 400 + + - NaNO3 400 0 0 - NaNO2 100 0 0 - Hỗn hợp SO4 2- Clorua 1000 0 + + Nitrate… 2000 0 + + NH3 20 - - - H2S Bão hoà 0 + + 20 Hinh 3 Lên men hở Gạo Nước Bánh men Bã hèm Ethanol Nấu Làm nguội Trộn men Lên men kín Chưng cất 21 1. : 1.1. Mục đích công nghệ: - Mục đích của việc làm chín hạt gạo nhằm hồ hóa tinh bột gạo giúp cho vi sinh vật dễ sử dụng tinh bột này để lên men rượu. 1.2. Các biến đổi: - Vật lý: độ mềm tăng, độ bền cơ học giảm, nhiệt độ tăng … - Hóa lý: sự hòa tan của nguyên liệu tăng do ñun nguyeân lieäu vôùi nöôùc, seõ xaûy ra caùc hieän töôïng tröông nở. - . 1.3. Cách thực hiện: - Gạo nguyên liệu được ngâm( từ 30-40 phút) nhằm rửa sạch chất bẩn bám bên ngoài hạt, đồng thời làm cho hạt gạo mềm, trương nở giúp dễ dàng cho quá trình nấu. Sau khi để ráo, gạo được cho vào nồi, thêm nước và nấu chín. 1.4. Các thông số công nghệ: - Lượng nước cho vào được tính toán sao cho cơm sau khi nấu không quá nhão cũng không bị sống. Tỉ lệ gạo nước khoảng 1:1 theo thể tích. - Nấu nguyên liệu như nấu cơm ăn bình thường không nên nấu sống. 22 2. : 2.1. Mục đích công nghệ - , chuẩn bị cho quá trình trộn men. 2.2. Các biến đổi: - - Sinh học: dễ bị nhiễm vi sinh vật 2.3. Cách thực hiện: - Cơm sau khi nấu chín được trãi đều trên một bề mặt phẳng để làm nguội. 2.4. Các thông số công nghệ: - Làm nguội xuống nhiệt độ từ 30 – 32oC. - Nhiệt độ cơm cao sẽ làm bánh men rất khó hoạt động. 3. : 3.1. Mục đích công nghệ: - . - 2 . 3.2. Các biến đổi: - Sinh học: Số lượng vi sinh vật tăng. 23 - : . 3.3. Cách thực hiện: - Bánh men rượu được trộn vào bằng cách bóp nhỏ, rắc đều lên bề mặt lớp cơm. 3.4. Thông số công nghệ: - Tỉ lệ bột men so với lượng gạo khoảng 2,5 – 5% khối lượng gạo. 4. : 4.1. Mục đích công nghệ: - Tạo điều kiện cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển, sinh tổng hợp enzyme amylase. - - Chuẩn bị cho quá trình lên men kín. 4.2. Các biến đổi: - Vật lí: nhiệt độ tăng, thay đổi tỉ trọng. - Sinh học: ở giai đoạn này, có sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc và một số vi khuẩn nhiễm, xảy ra đầu quá trình lên men. Trong đó, vi khuẩn phát triển nhanh, tạo thành một số acid hữu cơ, làm giảm pH môi trường. pH môi trường giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Song song đó, các loài nấm men cũng bắt đầu phát triển nhưng yếu hơn. - . - Hóa sinh: nấm mốc sinh tổng hợp enzyme amylase thủy phân tinh bột tạo thành đường. Do sự phát triển của nấm mốc và nấm men Endomycopsis, tinh bột được chuyển thành đường. Các loài nấm men và nấm mốc này trong quá trình phát triển tạo ra rất nhiều enzym amylase và glucoseamylase. Glucose tạo ra trong quá trình thủy phân tinh bột, bình thường sẽ ức chế ngược lại phản ứng thủy phân. Nhưng ở đây lượng đường 24 glucose tạo thành hầu như sẽ được chuyển hóa thành cồn hoặc phục vụ cho sinh sản và phát triển của VSV, do đó, cơ chế kìm hãm ngược của glucose thường không xảy ra. 4.3. Cách thực hiện: - Cơm đã trộn men được đem ủ để mốc mọc đều cả khối cơm; sau đó vun thành đống, phủ bằng vải và giữ ở nơi thoáng mát trong 2 – 3 ngày. 4.4. Thông số công nghệ: - Thời gian ủ mốc từ 5 – 20 giờ. - Nhiệt độ của quá trình: 28 – 32oC, điều kiện thoáng mát. 5. LÊN MEN KÍN: 5.1. Mục đích công nghệ: - Chuyển đường thành ethanol. 5.2. Các biến đổi: - Hóa sinh: Chủ yếu là quá trình chuyển hóa đường thành cồn. Quá trình này được thực hiện bởi: Saccharomyces sp., Endomycopsis sp. Trong đó Saccharomyces đóng vai trò cơ bản. Song song với quá trình này còn có quá trình chuyển hóa tạo đường, các acid hữu cơ và các sản phẩm phụ khác. - Sinh học: sự gia tăng sinh khối nấm men, nấm mốc ngừng phát triển. . - Cảm quan: . - 2 ) - . - Vật lý: nhiệt độ tăng . 5.3. Các yếu tố ảnh hưởng: 5.3.1. , chất lượng giống cấy: 25 - Lượng bánh men cho vào ít thì lượng vi sinh vật không đủ để thực hiện các quá trình chuyển hóa, hiệu suất thấp. - Lượng bánh men cho quá nhiều thì nguồn dinh dưỡng không đủ cung cấp cho hệ vi sinh vật phát triển, làm giảm hiệu suất lên men. 5.3.2. : - Hàm lượng đường thuận lợi cho nấm men lên men là 10-15%. - Nồng độ đường cao sẽ tạo áp suất thẩm thấu lớn lên tế bào nấm men, ức chế nấm men, thời gian lên men kéo dài, đường không được sử dụng triệt để. - Nồng độ đường thấp thì không có lợi về kinh tế và hiệu suất lên men cũng không cao. 5.3.3. : - pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5-5.5. Đối với dịch đường từ nguyên liệu thường khống chế ở pH = 4.8-5.2 nhằm tạo điều kiện cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. 5.3.4. : - Nhiệt độ tối ưu cho nấm men Saccharomyces khoảng 28-32oC. Ở nhiệt độ thấp hơn, nấm men dại và các vi sinh vật tạp nhiễm bị ức chế, nấm men sẽ lên men tốt hơn và triệt để hơn. Ở nhiệt độ cao, 35-38oC nấm men dại và các vi sinh vật tạp nhiễm phát triển mạnh, nên hoạt tính của nấm men giảm nhanh. 5.4. Cách thực hiện: - Sau khi lên men hở, cơm rượu có mùi thơm nhẹ của rượu, ăn thấy ngọt, có vị hơi cay của rượu thì chuyển sang thùng lên men kín ủ với nước sạch. 5.5. Thông số công nghệ: - Tỉ lệ gạo : nước = 1 : (2÷3). - (lên men ) khoảng 3 – 4 . - : 28 – 30oC. 26 5.6. Thiết bị lên men: - Thùng lên men là những chum vại có nắp đậy kín. 6. CHƯNG C T: 6.1. Mục đích công nghệ: - Khai thác: làm giàu cấu tử ethanol, tách ethanol từ dung dịch dấm chín để thu rượu trắng truyền thống. - . 6.2. Các biến đổi: - . - . - . 6.3. Cách thực hiện: - Quá trình chưng cất được tiến hành bằng cách đun sôi hỗn hợp lên men, hơi bay lên được dẫn qua ống dẫn và được làm lạnh bằng cách cho ống dẫn đi qua bồn nước để ngưng tụ rượu bên trong lòng ống. Dung dịch rượu thu được trong suốt, có mùi thơm đặc trưng và nồng độ rượu sẽ giảm dần theo thời gian chưng cất. 6.4. Thông số công nghệ: - 55 – 65o . - 35 – 45o . - . 6.5. Thiết bị: - Nồi nấu có ống dẫn hơi 27 V : TIÊU 1. : - . - : 0,789 g/cm3. - : 78,35o = 760mmHg. - : -114,3°C (158,8 K). - . 2. C : - : 1,200 cP ở 20°C. 3. : 4: C theo TCVN-71 Chỉ tiêu chất lượng Cồn loại I Cồn loại II Nồng độ rượu Etylic, %V 96 95 Hàm lượng aldehyt tính theo aldehytaxetic, mg/l 8 20 Hàm lượng este tính theo axetat etyl, mg/l 30 50 Hàm lượng dầu fusel tính theo alcol izoamylic và izobutylic, hỗn hợp 3:1, mg/l 30 60 Hàm lượng alcol metylic, %V 0, 006 0,1 Hàm lượng axit tính theo axit axetic, mg/l 9 18 Hàm lượng furfurol không được có Không được có Thời gian oxy hoá, phút 25 20 28 1. 1.1. : 1.1.1. : - . - : cellulose, hemicellulose, lignin. - ). - . 1.1.2. : - . - Th 180 – 200o – 245o – thủy phân. - : HCl, H2SO4, H3PO4. - : . - : 29 Fungi: Phanerochaete chrysosporium, Polyporus brumalis, Polyporus versicolor,Trametes sp, Poria sp. Bacteria: Nocardia sp, Streptomyces sp, Pseudomonas sp, Flavobacterium sp. 1.1.3. thủy : - thủy phân: 2SO4 . 2SO4 . - thủy phân: thủy . : o – . o – – . o ß – . 1.1.4. : 1.1.4.1. : - = 140 – 180oC. - thủy 3 30 thủy . - 2 . - . Hình 5.1: . 1.1.4.2. thủy phân: - : thân ngô. - Phương p . - . - . 31 - 100o 85% H2SO4 2SO4 thủy 110o . Acid đ . Sau thủy 89%. Hình 5.2: thủy phân - Saccharomyces cerevisiae . - Fusarium oxysporum 2. - . 32 Hình 5.3: 1.1.4.3. : - ... - (70 – 77%): 1.,25 : 50o thủy – thủy thủy thủy . Sau khi thủy 33 . Hình 5.4: thủy 1.1.4.4. thủy phân: - Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện ở Natick Development Center (NDC) và ở Đại học California (Berkeley) để thiết kế và đánh giá 1 34 quy trình thủy phân giấy báo bằng enzyme. Giấy báo được chọn làm cơ chất vì nó chứa lượng cellulose cao, cấu trúc của nó thích hợp và nó luôn có sẵn. - Quy trình được biểu hiện ở hình 5.5. 1 phần quan trọng của toàn bộ chí phí của quy trình là quá phần quan trọng khác của toàn chi phí của quy trình là xử lý trước cơ chất. Máy nghiền bi đã được phát hiện là phương pháp vật lý có ảnh hưởng nhất về việc tạo ra 1 lượng cellulose lớn nhất có sẵn trong cơ chất để cho enzyme thủy phân, những thiết bị này lại rất đắt tiền. Hình 5.5: Quy trình thủy phân giấy báo bằng enzyme của Natick Development Center (NDC) 35 1.2. Waste Sulfite Liquors (WSL): - 90oC. - 300m3 . - . - 15 – Sacchromyces cerevisiae . - : 1. . - . 1.3. Lactoserum (whey): - 200m3 thủy phân lactase. 2. Rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh ethanol. Tuy nhiên, đa số tạo thành những sản phẩm phụ ngoài ethanol. Các sản phẩm phụ này bao gồm các loại rượu khác (butanol, isopropylalcol, 2,3-butandiol), các acid hữu cơ (acetic, butyric, formic, 36 lactic), các poliol (arabitol, glicerol, xilitol), các keton (aceton) và các chất khí khác nhau (metan, cacbonic, hydro). Những vi sinh vật có khả năng sản xuất etanol như sản phẩm chính (ít nhất một mol ethanol trên một mol glucose được sử dụng). 5.1 Tên vi khuẩn mmol Ethanol sản xuất được trên mmol Glucose được chuyển hoá Clostridium sporogenes up to 4.15 a) Clostridium indolis (pathogenic) 1.96 a) Clostridium sphenoides 1.8 a) (1.8) b) Clostridium sordelli (pathogenic) 1.7 Zymomonas mobilis(syn. Anaerobica) 1.9 (anaerobe) Zymomonas mobilis (Ssp. Pomaceas) 1.7 Spirochaeta aurantia 1.5 (0.8) Spirochaeta stenostrepta 0.84 (1.46) Spirochaeta litoralis 1.1 (1.4) Erwinia amylovora 1.2 Leuconostoc mesenteroides 1.1 Streptococcus lactis 1.0 Sarcina ventriculi 1.0 37 Một số vi khuẩn ( ví dụ: Enterobacteriaceas, Spirochaeta, Bacteroides ) chuyển hoá glucose theo con đường EMP, trong một thời gian ngắn, nó sử dụng 1 mol glucose sinh ra 2 mol pyruvat sau đó bị mất cacbon thành acetaldehyde và khử thành rượu. Bên cạnh đó, con đường EDP là con đường lên men rượu từ glucose nhờ một số vi khuẩn khác. 2.1. Zymomonas mobilis: Là vi khuẩn thuộc giống Zymomonas nó có khả năng sản xuất ethanol vượt trội hơn cả nấm men về một số mặt. Nó được phân lập lần đầu tiên từ đồ uống có chứa cồn, như rượu cọ (palm wine) của châu Phi hay một loại rượu của Mehico: rượu thùa (pulque), ngoài ra còn từ chất lấy từ rượu táo hay bia của người châu Âu. 2.1.1. Đặc điểm: - Zymomonas là vi khuẩn Gram (-),kỵ khí, hình que. - Dài từ 2 -6 m và rộng từ 1- 1.5 m, xuất hiện từng cái một nhưng hầu hết ở dạng cặp. - Kích thước chiều rộng lớn của Zymomonas được thể hiện rõ qua kính hiển vi, hầu hết những vi khuẩn khác chiều rộng chỉ khoảng 0.5- 0.75 m. - Hầu hết các giống (70%) không di động được, phần ít (30%) di động được với 1-4 tiên mao phân cực.Khả năng di động bị mất ở 1 số giống. - Hình dạng: 45% giống hình hoa thị, 33% dạng chuỗi, và 62% tế bào có những sợi nhỏ, có 1 số giống có chiều dài tới 28 m. - Tế bào không có dạng bào tử, không có màng nhày vỏ bọc bên ngoài, không có lipid nội bào, không có glycogen. - : Topt = 30 – 40 o = 4.0 – 5.0 2.1.2. Quá trình lên men: 2.1.2.1. Con đường lên men: - Zymomonas mobilis chuyển hoá đường thành pyruvat qua con đường ED (Entner-Doudorolff). Pyruvat sau đó lên men tạo ra ethanol và CO2 là sản phẩm duy nhất ( tương tự nấm men ). 38 - Sự Z. mobilis so với S. cerevisiae về mặt sản xuất bioethanol là: Đường hấp thu và sản lượng ethanol là cao hơn. Khí tạo thành ít hơn. Khả năng chịu ethanol cao hơn. Không phụ thuộc vào sự điều chỉnh lượng oxi thêm vào trong suốt quá trình lên men. Tuân theo sự vận động gen. - Mặc dù có những giới hạn khắt khe hơn so với nấm men: nó chỉ sử dụng được loại cơ chất giới hạn glucose, fructose và sucrose ( hiện nay, các nhà khoa học đang tìm cách khắc phục điều này). ). Nhưng áp dụng của kỹ thuật di truyền vào vi khuẩn ảnh hưởng sẽ đến sự lên men đường trong lignocellulose (Ingram, 1993), bằng việc chèn aportable, operon nhân tạo chứa gen của Z. mobilis mang enzyme dehydrogenase and pyruvate decarboxylase có khả năng chuyển hóa các loại đường khác. Những vi khuẩn này có thể phát triển hay lên men các loại đường cellobiose, cellotriose, xylobiose, xylotriose, maltose, maltotriose, và các đường oligo khác. Không yêu cầu quá trình phân giải thành đường đơn trước khi lên men. Hiêu quả có thể đạt hơn 90% so với lý thuyết. Những nhà nghiên cứu tại Department of Energy's National Renewable Energy Laboratory in Golden, Colorado cho thấy rằng việc sửa đổi di truyền ở Z. mobilis làm cho nó có thể sản xuất ethanol từ đường 5 cacbon như xylose. Mặc dù, sử dụng Z. mobilis sản xuất ethanol có năng suất cao hơn 5%-10% so với nấm men nhưng nó vẫn chưa được áp dụng trong phương diện thương mại (Borman, 1995). Nhưng cái khác của Z. mobilis là chắn chắn chúng có khả năng sử dụng pentose như là nguồn cacbon để phát triển. - Con đường ED: Glucose bị phosphoryl hóa sau đó bị oxy hóa tới 6-P- gluconat. Tại điểm này, sự loại nước xảy ra tạo thành 2-keto-3-deoxy- 6-P-gluconat (KDPG), chất này sau đó bị thuỷ phân nhờ KDPG- 39 aldolase. Từ một mol glucose sẽ tạo thành 2 mol pyruvat và sinh ra một mol ATP. - Các nghiên cứu nuôi chủng Zymomonas mobilis ZM4 trên các môi trường nhân tạo chứa glucose, fructose hoặc saccharose đã cho thấy rằng loài vi khuẩn này không có khả năng chuyển hoá các loại đường này theo bất kì một con đường nào khác ngoài con đường ED. Dẫn liệu động học sinh trưởng của loài vi khuẩn này được trình bày theo bảng sau: Bảng 5.2: Các thông số động học đối với sinh trưởng của chủng Zymomonas mobilis ZM4 trong môi trường nuôi cấy tĩnh với các nguồn carbon khác nhau (nồng độ ban đầu 250g/l-theo N. Kosaric và ctv., 1983) Thông số Cơ chất Glucose Fructose Saccharose Tốc độ sinh trưởng(h-1) 0,18 0,10 0,14 Tốc độ tiêu thụ cơ chất(g/g/h) 11,3 10,4 10,0 Tốc độ tạo thành ethanol(g/g/h) 5,4 5,1 4,6 Sản lượng tế bào(g/g) 0,015 0,009 0,014 Sản lượng ethanol(g/g) 0,48 0,48 0,46 Sản lượng ethanol(% so với lí thuyết) 94,1 94,1 90,2 Nồng độ ethanol cực đại(g/l) 117 119 89 Thời gian có tốc độ cực đại(h) 0 – 19 0 – 28 0 – 15 - Theo bảng này tốc độ hấp thu đường và sự sản sinh ethanol đạt cực đại khi sử dụng môi trường chứa glucose. Sự kim hãm do cơ chất không biểu hiện nghiêm trọng ở loài vi khuẩn này vì sinh trưởng có thể ở nồng độ 40% glucose. 40 - Khi lên men nước mía, chủng Zymomonas mobilis Z7 có khả năng kết thúc sự lên men 100-200g/l saccharose với hiệu quả 59–88% trong vòng 20–29h. Tốc độ sản sinh ethanol dao động từ 2,2–5,3 g/l/h trong các thí nghiệm loại một lít. Các kết quả này phù hợp với động học lên men trên các môi trường bán tổng hợp dưới các điều kiện tương tự. Điều này chỉ ra rằng các cofacto cần thiết, các ion kim loại cũng như các nồng độ C, N, P là đầy đủ cho quá trình lên men ethanol do vi khuẩn này thực hiện. Bảng 5.3: Các thông số động học đối với Z.mobils và Saccharomyces cerevisae trên các môi trường chứa 250g glucose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không thông khí (30oC, pH=5,0 – theo N.Kosaric và ctv_1983) Các thông số động học Z. mobilis S. uvarum Tốc độ sinh trưởng riêng(l/h) 0,13 0,055 Tốc độ hấp thu glucose riêng(g/g/h) 5,5 2,1 Tốc độ tạo thành ethanol riêng(g/g/h) 2,5 0,87 Sản lượng tế bào(g/g) 0,019 0,033 Sản lượng ethanol (g/g) 0,47 0,44 Sản lượng ethanol tương đối(%) 92,5 86 Nồng độ ethanol cực đại(g/l) 102 108 - Bảng trên cho thấy trong điều kiện nuôi tĩnh, Zymomonas mobilis lên men hiệu quả hơn Saccharomyces uvarum. Các thông số động học thể hịên tính ưu thế này là tốc độ simh trưởng (2,4 lần cao hơn nấm men), tốc độ sinh ethanol riêng phần (2,9 lần cao hơn) và tốc độ hấp thu glucose riêng phần (2,6 lần cao hơn). - Trong lên men nấm men, oxy cần thiết để tổng hợp thành tế bào, ổn định các cấu trúc lipid, và duy trì các quá trình trong tế bào nói chung. Tuy nhiên, điều kiện hiếu khí cũng dẫn đến việc giảm thu hoạch cồn và tăng nồng độ sinh khối do hiệu ứng Pasteur. Vì nhiều vi khuẩn là kỵ 41 khí nên có thể đạt được những năng suất cồn cao hơn và sinh khối th