Đề tài Lên men Ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định

(2009), [5], khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu tới quá trình lên men. Kết quả như sau: Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men Ethanol bằng nấm men S. cerevisia GC-IIB31 tự do và cố định , nhiệt độ 30 độ C, pH 4.5 Nồng độ đường dao động trong khoảng 12- 21% và thực hiên lên men từ 24- 120h. Ta thấy rằng ở nồng độ đường 12%, nấm men tự do đạt hiệu suất sinh Ethanol 2,34%, tiêu thụ 8,08% đường. Tuy nhiên đối với nấm men cố định thì đạt hiệu suất sinh Ethanol là 4,13% và tiêu thụ 11,04% đường. Hiệu suất tối đa thu nhận được khi nồng độ đường là 15% ở trong cả 2 trường hợp sử dụng nấm men tự do hay cố định. Nấm men tự do cho 6,49% etanol, tiêu thụ hết 14,92% đường trong khi đó đối với nấm men cố định thì tạo ra 5,85% Ethanol và tiêu thụ hết 14.9% đường. Ở hai nồng độ 18% và 21% còn lại thì hiệu suất thu nhận Ethanol giảm xuống rất thấp. Khi nồng độ đường lên cao, làm cho độ nhớt tăng cao, làm giảm quá trình trao đổi chất, giảm hiệu suất tổng hợp ethanol Kết quả nghiên cứu của Irfana Ikram [5] cho thấy nồng độ đường cho hiệu suất sinh Ethanol cực đại chỉ đạt 15%, thấp hơn so kết quả thu được của thầy Lê Văn Việt Mẫn. Có thể sự sai lệch này là do kỹ thuật thực hiện khác nhau như mật độ nấm men, tạp nhiễm, v, v … Nồng độ đường cũng có ảnh hưởng quyết định tới quá trình lên mên và ảnh hưởng tới tốc độ tạo thành sản phẩm và năng suất cuối cùng khi được bổ sung vào trong thời kỳ sinh trưởng phát triển của nấm men. Nồng độ đường ban đầu nó ảnh hưởng tới lượng Ethanol thành phẩm. Theo hình trên ta thấy sản phẩm Ethanol tối đa thu nhận được ở môi trường có chứa 15% đường ở trong cả 2 trường hợp lên men sử dụng nấm men S. cerevisiae cố định hay tự do. Khi nồng độ đường tiếp tục tăng dẫn đến làm giảm lượng Ethanol là do hàm lượng đường tăng dẫn đến làm tăng độ nhớt môi trường dẫn đến việc làm giảm quá trình trao đổi chất do đó mà làm giảm hiệu suất tạo thành ethanol. Maziar Safaei Asli ( 2009), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường vào quá trình sản xuất Ethanol theo chu kỳ, sử dụng chủng nấm men Saccharomyces Cerevesiae SC1, kết quả thể hiện trên hình 5 và 6, [6],. Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ đường đầu vào quá trình sản xuất ethanol. Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu vào quá trình chuyển hóa đường. Từ hình 5 và 6. cho ta thấy nồng độ đường ban đầu ảnh hưởng tới nồng độ Ethanol và quá trình chuyển hóa đường trong suốt quá trình lên men. Căn cứ theo kết quả, nồng độ Ethanol tăng khi tăng nồng độ cơ chất nhưng có sự biến đổi rộng trong khoảng thời gian diễn ra lên men. Những nồng độ Ethanol tối đa là 23, 46.1 và 95.1 g/l thu nhận được ở 48, 72 và 120h với các dung dịch đường tương ứng là 50, 100 và 250 g/l. Như ta đã thấy, với nồng độ đường thấp, sản phẩm Ethanol được tạo ra trong giai đoạn phát triển tăng trưởng của nấm men chỉ trong một thời gian ngắn và do đó cần ít thời gian lên men. Trong bài nghiên cứu của Pramanik (2003) cho thấy khi nồng độ Ethanol đạt đến khoảng 95g/l thì nó trở thành chất ức chế, nhưng trong bài nghiên cứu này không cho thấy hiện tượng trên [7]. Cũng theo kết quả của nghiên cứu này sản lượng Ethanol tối đa và tối thiểu thu nhận được ở dung dịch đường ban đầu là 100 và 250 g/l. Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng đồ đường ban đầu tới hiệu suất Ethanol Nồng độ đường ban đầu( g/L ) Hiệu suất lên men 50 0.446 100 0.461 150 0.453 200 0.442 250 0.416 Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ đường tới hiệu suất tổng hợp Ethanol Tốc độ sinh trưởng và lượng sinh khối đạt cực đại khi dùng nấm men cố định sẽ cao hơn khi dùng nấm men tự do. Vì khi lên men với nồng độ cơ chất cao, dùng nấm men cố định, trên bề mặt chất mang sẽ xuất hiện một gradient nồng độ, và giúp cho nấm men làm quen dần với môi trường 3.1.2. Ảnh hưởng của khoáng chất: Khoáng chất đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của tế bào men, đặc biệt là phospho. Phospho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của photphatit, nucleoproteit cũng như axit nucleic. Phospho, Magie và lưu huỳnh có tác dụng làm hoạt hóa photphataza trong quá trình lên men. Lưu huỳnh và sắt đều tham gia phản ứng oxy hóa khử, ngoài ra sắt cùng với các chất vô cơ khác như Zn, Mn, Cu, Mg.. đều là những chất không thể thiếu đối với nhiều enzym oxy hóa) oxydaza, katalaza peroxydaza). Canxi còn giúp và loại bỏ các chất độc thải ra khi lên men, đồng thời giúp cho tổng hợp protit, làm tăng quá trình oxy hóa và có tác dụng tạo thành một số vitamin. Bảng 2. Ảnh hưởng của các chất khoáng bổ sung vào môi trường trong quá trình lên men Ethanol bởi nấm men cố định S.cerevisiae trong gel alginate Khoáng chất Nồng độ Etanol , % khối lượng 20h 48h Mẫu đối chứng, không bổ sung khoáng chất 4.48±0.09 8.01±0.16 CuCl2( 1mg/L) 4.67±0.09 8.32±0.15 CuCl2( 2mg/L) 4.3±0.1 7.58±0.15 CuCl2( 3mg/L) 4.12±0.11 7.26±0.16 CaCl2( 40mg/L) 4.73±0.12 8.36±0.15 CaCl2( 80 mg/L) 4.68±0.11 8.25±0.18 MgSO4(2g/l)+ ZnSO4(0.3g/L) 4.79±0.1 8.41±0.17 Điều kiện lên men: pH= 5, nhiệt độ 30oC, tốc độ khuấy trộn 100 rpm, nồng độ đường ban đầu là 150 g/l, mật độ tế bào nấm men ban đầu khoảng 2.5* 107CFU/ml, [8] Từ kết quả của bảng 2 cho ta thấy tầm quan trọng của việc bổ sung thêm khoáng chất trong môi trường lên men đối với chủng nấm men S. cerevisiae. Nhìn chung, việc bổ sung các khoáng chất( Cu, Ca, Mg và Zn) đều làm tăng nồng độ Ethanol, cải thiện quá trình tiêu thụ đường và làm tăng mật độ chất nền alginate hơn so với trường hợp lên men với nấm men cố định mà không có bổ sung thêm khoáng. Hình 8. Hiệu quả của quá trình lên men từ lõi ngô thủy phẩn bởi nấm men cố định S.cerevisiae với việc bổ sung các loại khoáng chất khác nhau. Mẫu được phân tích sau 48h lên men. Điều kiện lên men giống bảng 2 Như chúng ta đã biết thì các muối khoáng tham gia vào quá trình trao đổi chất của nấm men như là chất hoạt hóa của các enzym, hoặc nó là một phần của enzym, là một phần của trung tâm hoạt động enzym. Từ hình 8 cho ta thấy việc bổ sung khoáng chất đều làm tăng hiệu quả của quá trình lên men (trừ trường hợp bổ sung CuCl2 (2 mg/L), và hiệu quả quá trình lên men đạt giá trị tối đa ở trường hợp bổ sung hỗn hợp MgSO4 (2g/L) và ZnSO4 (0.3 g/L). Cũng theo nghiên cứu này thì ion Magie đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc giảm thiểu những ảnh hưởng có hại của đặc tính độc của Ethanol và sốc nhiệt vào chủng S. cerevisiae. Cả stress nhiệt và Ethanol có thể gây ra rối loạn trong nội cân bằng ion trong tế bào, dẫn đến làm giảm các hoạt động trao đổi chất và cuối cùng là tế bào chết. Tuy nhiên, ion magie làm giảm proton, và đặc biệt là tính thấm aninon của màng tế bào bằng tương tác qua lại với màng phospholipit, kết quả làm ổn định màng. Như vậy, rõ ràng là việc bổ sung thêm magie đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình lên men có nồng độ cơ chất và sản phẩm cao. Tương tự như vậy, việc bổ sung thêm Zn cũng rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của nấm men, đặc biệt trong quá trình lên men với các cơ chất thiếu Zn. Các ion Cu cũng làm tăng sản lượng Ethanol và sự sinh sản của nấm men với nồng độ 1 mg/L. Hơn nữa, với tăng thêm nồng độ của ion Cu (2 và 3 mg/L), các tác động có lợi về sự ổn định cơ học của các hạt alginate- cố định đã được quan sát. Mặc khác, nồng độ của các ion Cu cao sẽ gây độc đối với nấm men, do đó mà làm giảm hiệu quả quá trình lên. Mặc dù vậy, việc bổ sung ion Cu rất cần thiết trong các quá trình đường hóa và lên men của quá trình lên men từ tinh bột thủy phân, khi đó Cu có thể hoạt hóa các enzym tham gia quá trình thủy phân tinh bột, ví dụ như enzym α-amylase, làm cho hiệu quả quá trình đường hóa và lên men tăng lên rõ rệt. Bên cạnh các ion Cu, các ion Ca và Mg cũng đóng vai trò như những chất hoạt hóa enzym α-amylase và do đó cũng làm tăng hiệu quả của quá trình đường hóa và lên men từ cơ chất là tinh bột. 3.1.4. Ảnh hưởng của vitamin: Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin B1 có trong thành phần của coenzym cacboxylaza. B2 có ở dạng este phosphoric, axit nicotin có trong coenzymaza… Biotin và axit paraaminobenzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của nấm men. Bảng 3. Ảnh hưởng việc bổ sung vitamin trong môi trường lên men Ethanol từ dịch lõi ngô thủy phân bởi nấm men S. cerevisiae cố định trong alginate Vitamin Nồng độ Etanol( % khối lượng) 20h 48h Mẫu đối chứng không bổ sung vitamin 4.48±0.09 8.01±0.16 Inositol (1g/l) 4.7±0.1 8.46±0.16 Thiamine (5mg/L)+ Pyridoxine (5mg/L)+ Biotin (10µg/L) 4.61±0.12 8.25±0.15 Ca-pantothenate( 1g/L) 4.81±0.11 8.56±0.18 Hình 9. Hiệu suất của quá trình lên men của dịch lõi bắp thủy phân được lên men bởi nấm men cố định S. cerevisiae có bổ sung vitamin . Từ kết quả trên cho ta thấy hiệu quả quá trình lên men đạt cao nhất là 82,08% khi bổ sung Ca- pantothenate( 1g/L), khi bổ sung Ca- pantothenate vào thì hiệu quả quá trình lên men tăng gần 8% ( từ 76,79 lên 82,08%). Ảnh hưởng của Ca- pantothenate mạnh hơn nhiều so với ảnh hưởng của hỗn hợp vitamin B (thiamin, pyridoxine và biotin), hỗn hợp vitamin này chỉ làm tăng khoảng 2% so với mẫu đối chứng (từ 76.79% lên 78.7%). Ca-pantothenate, hỗn hợp vitamin và Inositol đều làm tăng khả năng chịu đựng của nấm men đối với cồn, từ đó nó kích thích sự tổng hợp các chất béo vì vậy sẽ làm giảm sự rò rỉ của màng tế bào của nấm men. Bổ sung khoáng và Vitamin Dựa trên những kết quả đã thu được, tiếp tục lên men bổ sung đồng thời vitamin và khoáng chất như sau: MgSO4 (2g/L), ZnSO4 (0.3g/L), CuCl2 (1mg/L), Ca-pantothenate (1g/L) và Inositol (1g/L). Dựng đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của bổ sung vitamin và khoáng chất tới sản phẩm Ethanol và việc tiêu thu đường như sau: Hình 10. Động lực học của quá trình sản xuất Ethanol và tiêu thụ dường glucose trong quá trình lên men dịch lõi ngô thủy phân bởi nấm men cố định S.cerevisiae (mẫu không và có bổ sung vitamin và khoáng chất) Hình 11. Số lượng tế bào thu nhận được trong quá trình lên men Bảng 4. Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamin và khoáng chất vào môi trường trong quá trình lên men Ethanol Lên men W (ethanol) ( %) Sản lượng lý thuyết ( %) Yp/s (g ethanol/ g tinh bột) P (g/L.h) Nấm men cố định không bổ sung vitamin và khoáng chất 8.01±0.16 76.79±1.54 0.43±0.009 1.67±0.03 Nấm men cố định có bổ sung MgSO4 (2g/L)+ ZnSO4 (0.3g/L)+ CuCl2 (1mg/L)+ Ca- pantothenate (1g/L)+ Inositol (1g/L) 9.67±0.17 92.35±1.62 0.52±0.009 2.01±0.04 Từ kết quả thu được cho ta thấy việc lựa chọn bổ sung hỗn hợp vitamin và khoáng chất , nồng độ cồn đạt được là 9,67%, hiệu suất sinh cồn lý thuyết là 92,35%. Hiệu quả quá trình lên men tăng khoảng 20% (từ 76,69 lên 92,35%). Các chất bổ sung còn làm tăng Yp/s từ 0.43 lên 0.52 g ethanol/g tinh bột và hiệu suất quá trình lên men cũng tăng từ 1.67 lên 2.01 g/L.h 3.2. Ảnh hưởng của các thông số công nghệ: 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho phát triển của chúng. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28÷ 32oC. Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác, nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20÷ 22oC sẽ hạn chế được phát triển của tạp khuẩn. Sau 8 đến 10h nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28÷ 30oC, tiếp đó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30oC, men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35÷ 38oC chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este aldehyt và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. Kết quả nghiên cứu của Irfana Ikram cho thấy: Nhiệt độ khảo sát dao động trong khoảng 25- 40 độ C và thực hiên lên men từ 24- 120h. Trong khoảng nhiệt độ khảo sát như trên: nấm men cố định đạt hiệu suất sinh ethnol 5,38 %, suất tiêu thụ đường cực đại 14,62%; nấm men cố định đạt hiệu suất sinh ethnol 4,18 %, suất tiêu thụ đường cực đại 11,71 %. Hiệu suất sinh Ethanol cực tại khi nhiệt độ bằng 30 độ C cho cả nấm men tự do và nấm men cố định. Ở 30 độ C, nấm men nấm men cố định đạt hiệu suất sinh ethnol 6,42 %, suất tiêu thụ đường cực đại 14,79 %; nấm men cố định đạt hiệu suất sinh ethnol 5,83 %, suất tiêu thụ đường cực đại 17,02 %. Hình 12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men Ethanol bằng nấm men S. cerevisia GC-IIB31 tự do và cố định , nồng độ đường ban đầu 15% , pH 4.5, Dưới đây là kết quả khảo sát khác của K. Pramanik, biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới nồng độ Ethanol tạo thành và sự chuyển hóa của đường. Hình 13. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới nồng độ Ethanol Hình 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa của đường Bảng 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ vào Hiệu suất sinh Etanol Nhiệt độ (oC) Hiệu suất sinh Ethanol 28 0.405 30 0.451 32 0.461 34 0.446 36 0.41 38 0.434 40 0.421 Thông thường, tốc độ lên men tăng khi ta tăng nhiệt độ tới nhiệt độ tối ưu khoảng 30 đến 40oC. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu và khoảng nhiệt độ cho sự phát triển, sinh trưởng và lên men đều phụ thuộc mạnh vào chủng nấm men. Từ kết quả thu nhận ở trên ta thấy tốc độ tạo thành sản phẩm đạt giá trị tối đa ở khoảng nhiệt độ cao 35, 36 và 38oC, nhưng sản lượng cồn đạt tối đa ở 32oC. Tốc độ chuyển hóa đường giảm nhanh khi ta tăng nhiệt độ và sau đó việc tiêu thụ cơ chất cũng trở lên tương đối chậm. % chuyển hóa đường được tìm thấy là 100%, 97% và 87.3% ở 30oC, 35oC và 38oC. Nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzim. Từ kết quả thu nhận được cho ta thấy, ở nhiệt độ 30oC là nhiệt độ tối ưu cho việc thu nhận Ethanol cũng như tốc độ quá trình lên men. 3.2.2. Ảnh hưởng của pH: Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định- trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của canh trường. Sazajsani và cộng sự (1996) đã khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trong hạt cellulose trong quá trình sản xuất cồn. Kết quả cho thấy khả năng lên men của tế bào nấm men cố định không phụ thuộc vào pH khi pH nằm trong khoảng 3,1 và 6,25. Trong khi đó, như đã biết, khả năng lên men của nấm men tự do phụ thuộc vào pH, và giá trị pH tối thích khoảng 4. Kết quả này tương tự như khi cố định nấm men trong gel calcium alginate (hình 2.15) (William và Munnecke, 1981; Buzias và công sự, 1989) và trong mạng prepolymer hòa tan (Jirku, 1998. Đó là do chất mang và cố định đã bảo vệ tế bào khỏi những thay đổi của hàm lượng ion H+ trong môi trường [9], [10], [11], [12]. Hinh 15: Ảnh hưởng của pH đến tốc độ lên men của nấm men cố định (l) và nấm men tự do (o). Tốc độ lên men tương đối được tính bằng phần trăm so với tốc độ lên men cực đại Buzisas và cộng sự (1989) cũng nhận thấy rằng khả năng sống sót của nấm men hầu như không phụ thuộc vào pH, trong đó khả năng sống sót của nấm men tự do bị ảnh hưởng rất lớn bởi pH, [11]. Hình 16: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sống sót của nấm men cố định (l)và nấm men tự do (´). Hình 17: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men £¢, pH 2,80; ¯¿ pH 3,0; ™˜ pH 3,25; rp pH 3,50; sq pH 3,70. Các ký hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với nấm men cố định và nấm men tự do. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcol etylic là 4.5÷ 5.0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH= 4.8÷5.2, nhằm kết hợp giữ cho amylaza tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men. Chính vì vậy khi gây men giống trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3.8÷4.0 để hạn chế phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Hình 18. Ảnh hưởng của pH đến lượng cồn sinh ra theo thời gian lên men Hình 19. Ảnh hưởng của pH tới sự chuyển hóa của đường theo thời gian lên men. Từ kết quả thu được cho ta thấy: Với tất cả các giá trị pH thì lượng cồn sinh ra tăng lên một cách đều đằn cùng với thời gian . Nồng độ cồn tối đa đạt được là ở pH= 4.5, còn giá trị nhỏ nhất là ở 3.5. Ở pH= 3.5, là giá trị pH quá thấp làm cho nấm men không hoạt động được. Khi pH tăng lên cao pH= 5 - 5.5 thì dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp, tạo điều kiện nấm men dại hoạt động, đồng thời sinh ra các sản phẩm không mong muốn như glycerin, hay các axit hữu cơ….Theo đó, pH tối ưu cho quá trình lên men rượu là 4.25 3.3. Các yếu tố khác. 3.3.1. Hàm lượng ethanol: Ethanol là sản phẩm chính. Tuy nhiên Ethanol cũng là chất độc đối với tế bào nấm men. Ethanol ức chế sự sinh trưởng của nấm men theo cơ chế không cạnh tranh. Ethanol chủ yếu tác động lên màng tế bào chất và một số màng nội bào khác. Ethanol xâm nhập vào vùng kỵ nước, tác động đến thành phần photpholipit của màng tế bào, làm thay đổi chiều dài và mức độ không no của các axit béo. Kết quả là cấu trúc và tính thấm của màng tế bào thay đổi, do đó ảnh hưởng đến khả năng sống sót và phát triển năng lực lên men của nấm men. Ở hàm lượng thấp ảnh hưởng của Ethanol đến tế bào nấm men là không đáng kế. Bên cạnh những yếu tố bất lợi , nồng độ ethnol cao cũng ảnh hưởng có lợi đến tính chất ethanol. Theo nghiên cứu của Magrus tất cả các loài coliform đều bị tiêu diệt ở hàm lượng cồn 11-12%, ngay cả với Euterobacter agglomerans, loài vi khuẩn thường gặp trong lên men bia. 3.3.2. Ảnh hưởng của chất mang: Hình 20. Ảnh chụp từ kính hiển vi của nấm men cố định. (A). Cố định tế bào nấm men trong PVA( đường kính 3,5 mm và chiều dày là 0,3 mm). (B). Cố định tế bào nấm men trong alginate,[13] Hình 21 . Nồng độ Ethanol và mật độ tế bào trong suốt quá trình lên men bột bắp thủy phân với nồng độ chất mang khác nhau của S. cerevisiae var ellipsoideus trong alginate. Điều kiện lên men: pH = 5.0; 30oC, 100rpm; nồng độ đường ban đầu là 176 g/l. Hình 22. Nồng độ Ethanol và mật độ tế bào trong suốt quá trình lên men bột bắp thủy phân với nồng độ chất mang khác nhau của S. cerevisiae var ellipsoideus trong PVA. Điều kiện lên men: pH = 5.0; 30oC, 100rpm; nồng độ đường ban đầu là 176 g/l. Bảng 6. Nồng độ sản phẩm trong dịch canh trường sau các chu kỳ lên men liên tiếp với nấm men cố định trong alginate và PVA của S. cerevisiae var elipsoideus Từ kết quả trên cho thấy, nồng độ Ethanol tối đa đạt được là 10.05%(w/w) trong quá quá trình lên men bột bắp thủy phân băng 5%(v/v) nồng độ chất mang của nấm men cố định trong Ca- alginate. Chất mang PVA có các đặc tính cơ lý và khả năng chịu đựng tốt hơn; tuy nhiên nồng độ cồn sản phẩm lại thấp . Một nghiên cứu khác của Mai Ngoc Dung, Dong Thi Thanh Thu [14] Hình 23. Ảnh hưởng của nồng độ alginate tới hiệu suất lên men ethanol. Bảng 7. Số liệu Quan hệ giữa nồng độ alginate và hiệu suất cố định Nồng độ alginate , % 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Khối lượng sinh khối (g) 1 1 1 1 1 Khối lượng sinh khối cố định (g) 0.9905 0.9920 0.9943 0.996 0.9970 Hiệu suất cố định 99.05 99.20 99.43 99.65 99.70 Khối lượng tổng của chất mang (g) 35.3291 37.07 38.526 40.5325 41.8729 Lên men mật rỉ: pH 4, nồng độ đường 12%, nhiệt độ 30 C, thời gian lên men 72 giờ, số lượng tế bào trong môi trường 56x108 tế bào. Trong một khoảng nồng độ, nồng độ Alginate tăng thì hiệu suất lên men tăng, tuy nhiên khi nồng độ tăng cao hơn nồng độ tối ưu thì hiệu suất giảm xuống. Nồng độ alginate là 1.5%, hiệu suất là thấp nhất, do gel alginate có cấu trúc mềm , bị phân giải trong quá trình lên men, tế bào bị giải phóng ra khỏi chất mang Nồng độ alginate là 2%, 2,5%, 3,0% thì hiệu suất tương đương nhau và cao nhất . Nồng độ alginate bằng 3.5, hiệu suất lên men thấp hơn so với trường hợp algiante có nồng độ 2%, 2.5%, 3%, nhưng cao hơn so với trường hợp nồng độ 1.5%. Khi nồng độ cao, chất mang sẽ cứng, cản trở sự khuếch tán của các chất . 3.3.3. Ảnh hưởng của Oxy: Sục khí để hòa tan oxy vào dịch đường sẽ giúp cho nấm men phát triển nhanh hơn. Tuy nhiên, theo một số nhà nghiên cứu, sục khí không cần thiết đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột. Sục khí sẽ làm tăng lượng rượu bay hơi. Mặc khác, nếu dư sẽ dẫn đến tạo nhiều sinh khối và aldehyt, do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu. Một khảo sát khác của Irfana Ikram về ảnh hưởng của Oxy đối với lên men Ethanol, xem Hình 24. Ảnh hưởng của thể tích canh trường lên quá trình lên men ethanol, nồng độ đường ban đầu 15% , nhiệt độ 30 độ C, pH 4,5. Thể tích canh trường 200, 250, 300, 350 ml, thể tích bình lên men 500 ml, Thời gian lên men từ 24- 120h. Khi thể tích canh trường là 200 ml: nấm men tự do đạt hiệu suất sinh 4,29%, hiệu suất sử dụng đường 12,9%; nấm men cố định đạt hiệu suất sinh 2,24%, hiệu suất sử dụng đường 13,01%. Hiệu suất sinh Ethanol cực đại khi thể tích canh trường là 300 ml cho cả nấm men tự do và nấm men cố định. Thể tích canh trường 200 ml, nấm men nấm men tự do đạt hiệu suất sinh ethnol 6,95 %, suất tiêu thụ đường cực đại 13,99 %; nấm men cố định đạt hiệu suất sinh ethnol 6,22 %, suất tiêu thụ đường cực đại 14,49 %. Đối với thể tích 250 ml và 350 ml, hiệu suất sinh Ethanol cũng thấp hơn. Trường hợp thể tích 300 ml đã sinh ra Ethanol cực đại có thể là do lượng oxy có sẵn trong không gian trống là thấp và gây ít ảnh hưởng đến lên men, theo Irfana Ikram [5] Hình 24. Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên men tới hiệu suất lên men ethanol. Điều kiện lên men: nhiệt độ 30oC, pH= 4.5, nồng độ đường ban đầu 15%, nấm menn Saccharomyces cerevisiae GC- II B31 3.3.4. Vấn đề tái sử dụng nấm men cố định: Irfana Ikram [5] khảo sát tốc độ sử dụng đường khi tái sử dụng nấm men cố định là 6 lần. Hình 25. Khả năng sử dụng đường khi tái sử dụng nấm men cố định Khảo sát tốc độ sinh EtOH khi tái sử dụng nấm men cố định là 6 lần. Hình 26. Quan hệ Sản lượng Ethanol tạo thành với việc tái sử dụng lại nấm men cố định, ở lượng đường 15%, nhiệt độ 300C,pH = 4,5. Thời gian khảo sát 24-144 giờ, 24 giờ lấy mẫu 1 lần. Số liệu ghi nhận tốc độ sử dụng đường và hiệu suất sinh EtOH Trong chu kỳ đầu tiên : Hiệu suất thu được 5.38%, tiêu thụ đường 11.95% Trong chu kỳ thứ 2 và 3: Hiệu suất thu lên đến cực đại 7.56% Chu kỳ thứ 4 : tiêu thụ đường 14.89%, hiệu suất lên men cao hơn dùng nấm men tự do 1.14 lần. Hai mẻ cuối: tiêu thụ đường và hiệu suất giảm nhanh . Lý do có thể độ bền của chất mang chỉ đáp ứng được yêu cầu trong 4 mẻ đầu, đến hai mẻ cuối, chất mang bị đứt mạch, tế bào bị rửa trôi. SO SÁNH HIỆU SUẤT LÊN MEN CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH VÀ NẤM MEN TỰ DO: Hoạt động trao đổi chất của nấm men cố định nuôi cấy trong canh trường có nồng độ khác nhau. Hoạt động trao đổi chất của nấm men được đánh giá bằng: Tốc độ sử dụng cơ chất. Nồng độ Ethanol sinh ra Nghiên cứu thầy Lê Văn Việt Mẫn cho thấy : Hình 27. Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men ở 300C, pH = 4.5 và nồng độ đường ban đầu là 140g/l (a); 170g/l (b) và 220 g/l; sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate Nấm men tự do: Tổng số tế bào ▲ ; Số tế bào chết- Cycle I: Tổng số tế bào- ; Số tế bào chết - Cycle II: Tổng số tế bào- ● ; Số tế bào chết - ○ Tốc độ tăng trưởng của nấm men trong chu kỳ II, thấp hơn trong chu kỳ I vì: Lý do thứ 1 là cuối chu kỳ I, nồng độ cồn cao, pH thấp, vì vậy trong chu kỳ II, vi sinh vật cần nhiều thời gian để thích nghi với canh trường và tiếp tục phát triển Lý do thứ 2 là cấu trúc chất mang trở nên xốp vì sự tăng trưởng của nấm men và khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men, nên nấm men có điều kiện thuận lợi để tiếp xúc với áp lực thẩm thấu cao Tuy nhiên tốc độ sinh trưởng của nấm men và lượng sinh khối cực đại do nấm men cố định tạo ra sẽ cao hơn nấm men tự do. Có thể khi lên men có nồng độ đường cao, dùng nấm men cố định, sẽ xuất hiện một gradient nồng độ quanh chất mang, giúp cho tế bào nấm men thích nghi dần với áp lực thẩm thấu . Có thể thấy rõ hiệu quả vượt trội của nấm men cố định so với nấm men tự do qua bảng Bảng 1. Đặc tính của lên men Ethanol bằng nấm men cố định ở những nồng độ đường 140, 170 và 220 g/L Bảng 8. Đặc tính của lên men Ethanol bằng nấm men cố định ở những nồng độ đường 140, 170 và 220 g/L Đặc tính Tốc độ sử dụng đường(g/l.h) Nồng độ Etanol (%v/v) Nồng độ đường ban đầu(g/L) 140 170 220 140 170 220 Nấm men cố định- chu kỳ I 1.93 1.83 1.90 8.4 10.4 11.7 Nấm men cố định- Chu kỳ II 2.04 1.19 1.09 8.6 10.4 10.4 Nấm men tự do 1.43 0.72 0.98 4.7 4.7 5.6 Nghiên cứu của Ljiljana Mojović và cộng sự ( 2009),[15] cũng cho kết quả tương tự , xin xem hình 28. Hình 28 : Tiến trình tiêu thụ đường và sản sinh Ethanol từ bắp thủy phân bằng nấm men S.cereviae var ellipsoider cố định trên gel canxi alginate. Đường liền nét : nồng độ cồn; đường đứt : nồng độ đường Như đã trình bày ở trên, thì nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do: Tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men. Ổn định hoạt tính của nấm men. Các chất mang cố định có tác dụng như là một tác nhân bảo vệ tế bào chống lại những ảnh hưởng bất lợi của pH, nhiệt độ,