Đề tài Liệu pháp gen và ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh

dùng để chuyển gen liệu pháp vào tế bào đích và thường đạt kết quả cao. Thực hiện theo hình thức ex vivo Kỹ thuật liposome (liposome technique) : thực hiện theo hình thức in vivo. Cần chú ý chọn tế bào đích để nâng cao hiệu quả V. Nguyên lý của liệu pháp gen : 1. Tách dòng gen liệu pháp : Tách dòng gen liệu pháp được thực hiện bằng các phương pháp tách dòng thực nghiệm thông thường, trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và kỹ thuật gen. Gen liệu pháp có thể tách dòng từ các nguồn tế bào cho khác nhau như tế bào vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật, tế bào người và một số loại virus. Tách dòng gen liệu pháp có hiệu quả cao đối với các gen đã biết rõ kích thước, vị trí của gen trong bộ gen. Hiệu quả tách dòng gen liệu pháp còn phụ thuộc vào cấu trúc, chức năng gen, sản phẩm của hoạt động gen cũng như mức độ hiện đại của các thiết bị thí nghiệm. Tùy theo đặc tính của gen liệu pháp và mục đích của liệu pháp gen, có thể tách dòng gen liệu pháp từ bộ gen (genome) hoặc từ mRNA. Trường hợp cần các gen nguyên vẹn (kể cả các vùng không mang mã di truyền) phải tách dòng từ bộ gen, thường chỉ thực hiện với các gen có kích thước nhỏ. Nếu các gen cần thiết có kích thước lớn, hoặc chỉ cần các phần DNA mang mã di truyền, phải thực hiện cách tách dòng từ mRNA. Trường hợp này cần tách chiết mRNA và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược để tạo các cDNA tương ứng. Trường hợp gen liệu pháp là các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự (mạch kép hoặc mạch đơn), có thể tạo các đoạn oligo nucleotide bằng phương pháp tổng hợp nhân tạo. 2. Các loại vectơ thường sử dụng trong liệu pháp gen Để có thể nâng cao hiệu quả của liệu pháp gen trong chữa bệnh, một vấn đề quan trọng là chọn vectơ chuyển gen phù hợp với gen cần chuyển, phù hợp với loại tế bào đích và loại bệnh cần trị. Vectơ chuyển các gen liệu pháp trong liệu pháp gen gọi là các vectơ liệu pháp. Vectơ liệu pháp có một số đặc điểm riêng: Phải đảm bảo đưa các gen liệu pháp vào tế bào (cơ thể) dễ dàng, không gây tổn thương hoạt động của các gen khác trong bộ gen (không hoặc rất ít gây đáp ứng miễn dịch, không gây phá hủy chức năng các mô, không có tác động kích hoạt gen tiền ung thư…). Phải có khả năng mang một gen liệu pháp có kích thước càng lớn càng tốt. Có sự linh hoạt với các tế bào đích, mô đích để có thể gắn gen liệu pháp vào đúng những vị trí định trước Hiện nay, dựa vào nguồn gốc của vectơ liệu pháp gen, người ta chia các vectơ liệu pháp làm 2 nhóm: vectơ có bản chất virus (viral vector) và vectơ không có bản chất virus (nonviral vector). 2.1 Các vectơ liệu pháp gen có bản chất virus (viral vector) Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn với các tế bào chuyên biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào. Khi xâm nhiễm tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của virus vào trong các tế bào chủ. Một số nhóm virus có thể gắn được bộ gen virus hoặc một số gen của chúng vào bộ gen của tế bào chủ, tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn với tế bào chủ, có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia tế bào chủ, tạo nên các provirus. Hiện tượng tạo provirus được gọi là trạng thái tiềm sinh của virus. Đối với các virus gây bệnh, đó là thời gian ủ bệnh. Trong quá trình tồn tại và phân chia của tế bào chủ, bộ gen virus cũng được nhân lên tạo vô số tế bào mang gen virus, vẫn hoạt động bình thường. Khi có một tác nhân nào đó (thường là tia tử ngoại, các chất độc, tia phóng xạ hoặc nhiệt độ cao…) tác động vào provirus, làm cho bộ gen virus tách khỏi tế bào, thực hiện quá trình tái bản gen virus và tổng hợp các thành phần của virus trong tế bào chủ. Sự lắp ghép các thành phần của virus tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ và tiếp tục xâm nhiễm tế bào khác. Đây là giai đoạn biểu hiện bệnh rõ nhất. Trên cơ sở hiểu biết về bộ gen virus, cơ chế xâm nhiễm tế bào, cơ chế gắn gen của virus vào bộ gen tế bào, con người đã tìm ra các biện pháp loại bỏ hoặc gây bất hoạt các gen có hại của virus, nhưng vẫn giữ lại các gen giúp cho sự xâm nhiễm và gắn gen virus vào bộ gen tế bào, tạo nên các vectơ liệu pháp gen. Các viral vector được chia thành nhiều nhóm tùy theo đặc điểm cấu trúc bộ gen, đặc điểm xâm nhiễm, đặc điểm gây bệnh của virus… . Viral vector gồm một số loại chủ yếu: vectơ adenovirus, vectơ retrovirus, vectơ adeno-associated virus (AAV), vectơ herpes simplex virus (HSV)… . 2.1.1 Vectơ adenovirus Đặc điểm và cấu tạo di truyền Adenovirus là một loại virus có caspid đa diện 20 mặt, phần lõi chứa DNA mạch kép. Vỏ caspid của virus chứa 3 protein: hexon, fiber và base penton. Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt 20 mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 chóp ngoài vỏ virus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử. Adenovirus được phân lập đầu tiên từ amidan vòm họng của người, gây các bệnh về đường hô hấp. Bộ gen của adenovirus là một chuỗi DNA xoắn kép dài 36 kb, gồm hơn 50 gen. Trong bộ gen của adenovirus có 4 vùng gen quan trọng, ký hiệu là E1, E2, E3 và E4. Gen E1 có chức năng mã hóa cho các protein enzyme giúp cho quá trình phiên mã tổng hợp các protein sớm (protein enzyme của virus). Gen E2 và E4 điều hòa quá trình tái bản DNA virus, dịch mã tổng hợp protein muộn đồng thời có liên quan đến sự đáp ứng miễn dich của vật chủ trong quá trình tấn công của adenovirus. Nguyên lý thiết kế vectơ adenovirus Vectơ adenovirus được tạo nên từ các adenovirus tái tổ hợp. Đầu tiên cần tạo các adenovirus tái tổ hợp có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ nhưng mất khả năng tái bản trong tế bào chủ. Để thiết kế vectơ adenovirus phải loại bỏ gen E1 của adenovirus, thay thế bằng phức hợp promoter-gen liệu pháp và các gen cần thiết điều khiển quá trình biểu hiện của gen liệu pháp trong tế bào chủ. Gen E3 cũng được gây bất hoạt hoặc loại bỏ. Bộ gen virus sau khi loại bỏ gen E1 và E3 được đưa vào tế bào đóng gói (packaging cell) cùng với gen liệu pháp. Tại đây, quá trình tái tổ hợp ở những điểm tương đồng tạo nên bộ gen adenovirus tái tổ hợp chứa gen liệu pháp. Cơ chế hoạt động Adenovirus có thể xâm nhiễm cả tế bào không phân chia và các tế bào đang phân chia. Vectơ adenovirus có thể mang các gen liệu pháp kích thước lớn từ 8 kb đến 30 kb, không gây đột biến gen của tế bào đích. Điểm bất lợi nhất khi sử dụng vectơ adenovirus là gây hiệu ứng giảm mạnh đáp ứng miễn dịch của tế bào. Vectơ adenovirus có khả năng xâm nhiễm nhiều loại tế bào do nhiều loại tế bào đích có các cơ quan thụ cảm phù hợp với adenovirus. Khi xâm nhiễm vào trong tế bào chủ, phần lõi mang bộ gen virus và gen liệu pháp chui qua lỗ màng nhân. Bộ gen của adenovirus không có khả năng gắn với bộ gen của tế bào chủ. Trong nhân của tế bào chủ, các gen của adenovirus thực hiện quá trình phiên mã, quá trình dịch mã trong tế bào chất của tế bào tạo các protein liệu pháp và các protein cần thiết cho virus. 2.1.2 Vectơ retrovirus ( retroviral vector) Đặc điểm cấu tạo và di truyền Retrovirus là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ cao, có khả năng gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ. Cấu trúc retrovirus gồm phần vỏ có ba lớp. Lớp vỏ ngoài cùng là glycoprotein, tiếp đến lớp vỏ kép lipid, trong cùng là vỏ caspid. Bên trong lớp vỏ caspid là RNA và các loại enzyme của virus. Enzyme phiên mã ngược giúp virus chuyển bộ gen RNA sang dạng cDNA mạch kép. Enzyme cài xen giúp cho quá trình cài xen bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ ở những điểm tương đồng. Cấu tạo retrovirus Bộ gen retrovirus gồm 2 sợi đơn RNA đồng dạng, kích thước khoảng 7-11 kb. Mỗi sợi RNA chứa ba nhóm gen chủ yếu: gag, pol, env. Một số virus gây ung thư có thêm nhóm gen gây ung thư oncogen. Gen gag mã hóa các protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt virion, gen pol mã hóa các enzyme phiên mã ngược và các enzyme cần thiết cho hoạt động của virus, gen env mã hóa protein trong cấu trúc các lớp vỏ của virus. Hai đầu mỗi sợi RNA có một trình tự lặp dài tận cùng – LTR (long terminal repeats). Đoạn lặp LTR mang một số trình tự cần thiết cho quá trình biểu hiện gen của virus và một trình tự đặc hiệu giúp gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ, gọi là trình tự gắn xen – att (attachment site). Trong bộ gen virus còn có một trình tự giúp quá trình đóng gói bộ gen của virus gọi là trình tự ᴪ. Bộ gen của virus gây bệnh ung thư MLV và DNA của virus (hình thái của bộ gen virus trong các tế bào bị nhiễm) Nguyên lý thiết kế vectơ Nguyên lý chung của quá trình thiết kế vectơ retrovirus là phải loại bỏ các gen độc của virus, chỉ giữ lại một số gen cần thiết cho quá trình xâm nhiễm, tái bản, gắn gen, đồng thời cài thêm các gen liệu pháp. Các giai đoạn thiết kế vectơ retrovirus: Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và oncogen, thay thế bằng gen liệu pháp tạo thành vectơ bộ gen Xử lý cắt riêng các gen gag, pol, env của retrovirus nhưng vẫn đảm bảo chức năng của các gen Đưa vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol,env đã xử lý của virus vào một tế bào đóng gói Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng hợp các thành phần của vỏ virus, các thành phần của vỏ virus kết hợp với vectơ mang gen liệu pháp hình thành nên vectơ retrovirus Cơ chế hoạt động Mỗi loại retrovirus có đặc điểm cấu trúc gen, khả năng xâm nhiễm và tái bản riêng, do đó từ các loại retrovirus khác nhau ta có các loại vectơ retrovirus khác nhau. Hai nhóm vectơ retrovirus được sử dụng nhiều nhất trong liệu pháp gen là Mo-MuLV (Moloney murine luekemina) và Lentivirus ( HIV – human immune deficiency virus, SIV – Simian immune deficiency virus). Vectơ Mo-MuLV sử dụng cho những tế bào đang phân chia, vectơ HIV và SIV sử dụng cho những tế bào ở trạng thái không phân chia. Vectơ retrovirus được đưa đến tế bào đích bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Sau khi vào trong tế bào, các thành phần vỏ của virus bị phân hủy trong tế bào chất của tế bào đích, RNA được giải phóng. Enzyme phiên mã ngược của virus xúc tác quá trình chuyển RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép. cDNA qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào đích, nhờ enzyme intergase của virus làm cho cDNA mạch kép được gắn xen vào bộ gen ở những điểm tương đồng. Gen liệu pháp cũng đồng thời được gắn xen vào bộ gen của tế bào đích phiên mã và dịch mã tạo nên các protein liệu pháp trong tế bào đích. 2.1.3 Vectơ Adeno-Associated virus Đặc điểm cấu tạo và di truyền Adeno-Asociated Virus (AAV) là loại virus kích thước nhỏ thuộc nhóm parvovirus không gây bệnh cho người. khi không có mặt của một loại virus trợ giúp khác như adenovirus, virus helper…, AAV có thể xâm nhiễm các tế bào không phân chia, gắn bộ gen virus vào bộ gen người ở vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 19 tạo nên tiền virus (provirus). Bộ gen của AAV là DNA sợi đơn, được bao bọc trong lớp vỏ caspid. Kích thước bộ gen khoảng 4,5 – 4,7 kb, hai đầu là các trình tự lặp tận cùng đảo ngược ITR (Inverted Terminal Repeats) gồm 145 bp. Bộ gen AAV gồm 2 nhóm gen chính là gen rep và gen cap, các promoter p5, p19 và p40, phần cuối bộ gen là trình tự gắn đuôi poly Adenin – poly A (polyadeninlation). Gen cap mã hóa protein trong cấu trúc vỏ caspid của AAV. Gen rep mã hóa các enzyme giúp cho quá trình tái bản, phiên mã và quá trình gắn bộ gen AAV vào bộ gen tế bào chủ. Nguyên lý thiết kế Khi thiết kế các vectơ AAV phải loại bỏ các gen rep, cap của AAV đồng thời thay thế vào vị trí đó là gen liệu pháp cùng promoter thích hợp. Bộ gen của AAV chỉ thích hợp với các gen liệu pháp có kích thước dưới 4kb, khi kích thước gen liệu pháp lớn hơn 5kb, vectơ sẽ mất tác dụng. Quá trình thiết kế vectơ AAV cần sự có mặt của virus trợ giúp, thường sử dụng là các adenoviral helpers giúp quá trình tái tổ hợp đồng thời với gen liệu pháp, gọi là sự đồng chuyển nhiễm. Hiện nay, thiết kế vectơ AAV người ta sử dụng đồng thời vectơ plasmid mang gen liệu pháp và các đoạn ITR, virus AAV và virus trợ giúp là adenoviral helper. Quá trình chuyển nhiễm đồng thời tạo nên vectơ AAV mang gen liệu pháp và các dạng adenovirus lai. Các adenovirus lai bị gây bất hoạt bằng kỹ thuật xử lý nhiệt, sau đó dùng kỹ thuật siêu ly tâm phân đoạn để tách các vectơ AAV mang gen liệu pháp. Cơ chế hoạt động Khi vectơ AAV tiếp cận tế bào ở các thụ thể đặc trưng, toàn bộ các gen qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào. Trong nhân tế bào chủ, một số gen mã hóa các protein enzyme được phiên mã và dịch mã, giúp cho quá trình tái bản DNA và gắn DNA vào vị trí đặc hiệu trên bộ gen tế bào chủ. Gen liệu pháp cũng được nhân lên, phiên mã và dich mã tạo nên các protein liệu pháp. 2.1.4 Vectơ liệu pháp từ Herpes Simplex Virus (HSV) Đặc điểm cấu tạo và di truyền của herpes virus Herpes virus là một nhóm virus lớn, gây bệnh ở người và động vật. Herpes virus có kích thước khoảng 150nm, cấu tạo gồm vỏ ngoài, vỏ trong, màng lipid, vỏ caspid và phần lõi chứa DNA. Vỏ caspid cấu tạo từ 162 đơn phân, tạo hình đa diện 20 mặt. Bộ gen là phân tử DNA mạch kép, kích thước 152 260 bp. Herpea virus tương đối đa dạng, gồm nhiều nhóm có sự phân biệt gọi là herpes typ 1, herpes typ 2.., do đó được gọi là virus đơn hình ( herpes simplex) ký hiệu là HSV-1, HSV-2. Bộ gen herpes virus gồm ba nhóm gen chủ yếu là: nhóm gen α hay gen rất sớm – IE (immediate early), nhóm gen β hay gen sớm – E (early) và nhóm gen γ hay gen muộn – L (late), hai đầu là các trình tự TR (terminal repeat)… . Trong bộ gen có khoảng một phần hai các gen không cần thiết cho sự tái bản của herpes virus trong tế bào chủ. Cấu tạo của herpes virus Nguyên lý thiết kế vectơ HSV-1 Thiết kế vectơ HSV-1 dựa trên cơ sở tái tổ hợp của virus HSV-1 với Amplicon plasmid. Amplicon plasmid là một plasmid tái tổ hợp mang gen Ori, gen kháng Ampicilin trong plasmid của E.coli đồng thời mang gen Ori và gen mã hóa khả năng đóng gói của HSV và gen liệu pháp có gắn đoạn promoter kiểm soát nhóm gen rất sớm. Amplicon plasmid và virus trợ giúp cùng được gây nhiễm vào tế bào khả biến. Quá trình tái tổ hợp trong nhân tế bào khả biến tạo nên các vectơ HSV mang gen liệu pháp có thể sư dụng trong liệu pháp gen. Cơ chế hoạt động của vectơ HSV-1 Vectơ HSV-1 có khả năng cho gắn và chuyển những gen liệu pháp kích thước từ 30 đến 50 kb. Vectơ HSV-1 xâm nhiễm tế bào chủ nhanh, thời gian tiềm ẩn dài, không hoặc ít gây đáp ứng miễn dịch không mong muốn ở tế bào chủ. Hiện nay, vectơ HSV-1 sử dụng trong liệu pháp gen còn hạn chế do vectơ HSV-1 có thể tạo một số hợp chất độc trong tế bào một cách gián tiếp. Mặt khác, vectơ HSV-1 chỉ biểu hiện đặc hiệu ở các tế bào thần kinh, do đó phạm vi ứng dụng của vectơ HSV-1 trong chữa bệnh rất hẹp, chủ yếu điều trị các bệnh lien quan đến hệ thần kinh. 2.2 Các vector không có bản chất virus 2.2.1 Liposomes - Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và thành phần lipid cũng như tính hòa tan nước khác nhau. Thành phần và cấu trúc của nó xác định các tính chất này. - DNA tích điện âm. Tính “béo” cao và tích điện âm của màng tế bào người và màng nhân ngăn cản sự di chuyển tự do ra vào tế bào của DNA. Liposome mang điện tích dương, lớp vỏ ưa lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA. Tính hoà tan chất lipid này cho phép vận chuyển nó qua màng tế bào và màng nhân, dễ dàng đưa DNA vào nhân của tế bào. Hình 15. Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm vector chuyển gen. - Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại. Sự xâm nhập của protein trong vector ngăn cản đáp ứng miễn dịch của vật chủ và chúng không bị nguy hiểm hay bị tiêu diệt bởi các enzym (endonucleases) nội bào. - So với tất cả các vector không có bản chất virus, chuyển gen liposome có tiềm năng ứng dụng lớn nhất tại thời điểm hiện tại. 2.2.2 Các polymer cation Các polymer cation là chuỗi các phức hợp tích điện dương. Khi trộn với DNA, chúng tạo thành phức hợp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng mà có thể dễ dàng vào nhân. Lĩnh vực nghiên cứu này là cuộc cách mạng nhanh chóng các phân tử không độc có tính hiệu quả hơn và chuyển các gen tới các tế bào đúng đích hơn. Hình 16. Sự xâm nhập vào tế bào của các polymer cation. Hình 17. Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu sự tạo thành và tính ổn định của phức hệ polycation-DNA. 2.2.3 Cấy trực tiếp Sự cấy các DNA trần hay DNA tự do là một ví dụ khác của chuyển gen không có bản chất virus. Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u hoặc mô. Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh. Kỹ thuật này đã được ứng dụng cho cơ xương trong điều trị các bệnh thoái hoá cơ (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản các bệnh gan do virus (như bệnh viêm gan), và các bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim). Ngoài ra, các nghiên cứu trên động vật đã thành công trong điều trị ung thư như u ác tính và u bướu. Trong khi giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn, cũng có một số nhược điểm. Đầu tiên, sự quản lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi enzym nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận. Hiệu quả của biểu hiện di truyền cực kỳ khó nhận thấy. Hơn nữa, trong một số trường hợp không duy trì được biểu hiện của gen, các DNA lạ (foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch mạnh. 2.2.4 Liệu pháp tế bào gốc - Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra tranh cãi lớn trong khoa học, chính trị và tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy mô phòng thí nghiệm. - Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người. - Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại vật chủ. 2.2.5. Biến đổi biểu hiện gen Sự biểu hiện gen ở người có thể bị biến đổi trực tiếp bằng cách sử dụng các công cụ phân tử có khả năng xuyên qua tế bào, gắn tới gen đích của chúng và điều hoà gen sản xuất protein. Có một số công cụ được dẫn ra dưới đây: 2.2.5.1 Liệu pháp antisense Antisense là một phương pháp để ngăn cản hoạt động của gen. Có 2 cơ chế antisense oligonucleotide là mã trình tự và kháng nguyên tại miện mRNA được đưa vào tế bào hoặc gen kháng nguyên. Gen được nhân bản và đưa vào tế bào. Cơ chế của liệu pháp antisense Trong kỹ thuật antisense người ta có thể cắt sử dụng một đoạn nucleotide nhỏ đối nghĩa với DNA tổng hợp nên protein và làm bất hoạt gen đó để giảm việc sản xuất ra 1 loại protein đó-nhằm gia tăng sự sinh tồn, sự ổn định nhiệt và hoạt tính của RNA nhân tạo. người ta thường dùng phương pháp sau đây : Biến đổi đầu 3’ và 5’ làm tăng sinh tồn của RNA nhân tạo : thông thường các enzyme cắt DNA/RNA từ đầu 3’ đến đầu 5’, nhưng cũng có enzyme cắt từ đầu 5’ đến đầu 3’. Dể bảo vệ RNA nhân tạo tránh khỏi phản ứng của enzyme người ta thường thay thế 2 gốc nối phosphap P=O ở 2 đầu thành phosphorothioate P=S hay phosphapamindate P-N, hay băng các amin-linker ngắn, hay các hóa chất thông thường như cholesterol, cyclodextrin. Các hóa chất này có thể làm giảm hiệu quả của khả năng phân giải enzyme và làm tăng tính sinh tồn của RNA nhân tạo trong quá trình sinh học. dùng các hóa chất có tính hydrophobic cao như cholesterol, pyrene và các đa amin đã giúp việc chuyển DNA/RNA chuyển qua màng của tế bào hữu hiệu hơn. Dùng các RNA nhân tạo với sự biến đổi các gốc 2’-Oxy để làm gia tính tính ổn định nhiệt của RNA nhân tạo :2’-omethyl, 2’-amino, 2’-O-ankyl, LNA. Dể tìm ra loại oligonucleotide DNA/RNA nhân tạo nào đó có nhiều gốc biến đổi hóa học mà vẫn có thể hòa tan trong dung dịch nước, có thể bền vững trong những phản ứng phân giải của enzyme, có thể có tính kết hợp base-pairring rất chặt chẽ với các oligonucleotide DNA/RNA thiên nhiên. Mới đây LNA(lock nucleic acid), với cấu trúc hóa học được biến đổi nhưng vẫn mang đủ điều kiện RNA nucleic acid. LNA oligonucleotide sẽ có đặc điểm là xương sống phosphat,LNA sẽ không dễ dàng bị phân giải hoàn toàn hay biến đổi từ 3’Oxy sang 2’Oxy ở trong các môi trường dung dịch có pH<7 các oligonucleotide sẽ rất bền vững trước phản ứng của enzyme và có tính ổn định nhiệt cao khi có base pairring kết hợp với các RNA thiên nhiên. 2.2.5.2. Oligonucleotide Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử dụng để kìm hãm quá trình dịch mã của gen. Mạch đối (antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành. Khi mang tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu và ngăn cản sự sản xuất protein từ RNA này. Hình 18. Quá trình hoạt động của Oligonucleotide. Công nghệ mạch đối đã rất hữu dụng trong nghiên cứu nhưng các ứng dụng thương mại của nó rất không thành công. Điều này là do thời gian sống ngắn của các oligomucleotide và sự khác nhau của phân phối đặc hiệu. Hiện tại, có một dược phẩm oligonucleotide đã được chấp nhận là FDA, dùng để điều trị nhiễm cytomegalovirus ở võng mạc. Dự án bộ gen người hoàn thành đã làm sống lại mối quan tâm trong lĩnh vực này với các kỹ thuật phân phối mới làm liệu pháp oligomucleotide có hiệu quả hơn. 2.2.5.3. Ribozyme Hình 19. Cấu tạo của Ribozyme. Ribozyme là các chuỗi RNA ngắn (30-50 nucleotide) được thiết kế đặc biệt, có hoạt tính xúc tác (chúng gây ra các phản ứng hoá học). Ribozyme gắn với các đoạn RNA đặc hiệu và tách chúng ra khỏi RNA, do đó ngăn cản quá trình sản xuất protein. Các ribozyme này dường như có hiệu quả trong 12 đến 24 tiếng. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới nhất với ứng dụng trong các bệnh ung thư và các bệnh thoái hoá thần kinh (neuro-degenerative). Thông tin từ dự án bộ gen người có thể đem lại các ứng dụng có giá trị cho công nghệ này một cách nhanh chóng. Hình 20. Quá trình hoạt động của Ribozyme. 2.2.5.4. Promoter Promoter là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị phiên mã. Tất cả các vector liệu pháp gen hiện nay sử dụng các promoter của virus để điều khiển sự biểu hiện của các gen được chuyển. Việc thiết kế và sử dụng đặc hiệu mô làm các promoter trở thành lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, có thể cho phép hoạt hoá của gen được chuyển chỉ trong các mô dự kiến. Ví dụ, một vector sử dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được sử dụng trong các thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến. Vector này sẽ là đích của một số lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào bình thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến. B. ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP GEN TRONG CHỮA BỆNH I. Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen 1. Trong điều trị các bệnh do rối loạn di truyền Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đơn gen Trong tế bào, một số gen đơn bị hỏng hay mất cấu trúc bình thường ( rối loạn chức năng gen), có thể gây nên các bệnh di truyền. Bệnh tật trong trường hợp này có thể gây tử vong ở giai đoạn sớm nếu không được chữa trị, hoặc để lại các di chứng và di truyền 100% cho các thế hệ sau. Một số loại bệnh điển hình: Bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm Bệnh máu khó đông Bệnh xơ nang và viêm phổi cấp Bệnh giảm trí nhớ Parkinson Bệnh run rẩy Gaucher Bệnh rối loạn cholesterol gia đình Bệnh rối loạn mãn tính các chức năng hạt Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đa gen Một số loại bệnh do nhiều gen thuộc các locus khác nhau quy định, tùy theo mức độ hoặc mất chức năng của một hay nhiều gen (alelle) mà mức độ biểu hiện bệnh là khác nhau. Những bệnh ở trường hợp này di truyền 100% cho các thế hệ sau. Các bệnh điển hình như: Bệnh tim bẩm sinh Bệnh ung thư Bệnh tiểu đường Bệnh nghiện rượu Bệnh tâm thần phân liệt Hành vi tội phạm do gen 2. Trong chữa các bệnh do nhiễm trùng Là những bệnh do virus, vi khuẩn gây nên, trong đó có nhiều loại bệnh hiểm nghèo như bệnh ung thư, lao, HIV… gây thiệt hại to lớn về kinh tế, sức khỏe con người. liệu pháp gen là một trong những phương pháp chữa bệnh có hiệu quả cao, nhiều bệnh nhân mắc những bệnh nguy hiểm như ung thư gan, lao, viêm gan B… đã được chữa trị thành công bằng liệu pháp gen. trong tương lai, khả năng điều trị bệnh truyền nhiễm bằng liệu pháp gen ngày càng nhiều với hiệu quả và chất lượng càng cao. II. Một số xu hướng chữa bệnh bằng liệu pháp gen 1. Thay thế gen liệu pháp vào vị trí gen hỏng Nhiều bệnh gây nên do một gen đột biến, dẫn đến rối loạn chức năng gen gây thay đổi cấu trúc protein tạo nên các trạng thái bệnh lý. Chiến lược thay thế gen đã được áp dụng trong một số trường hợp điển hình như: Thay gen mã hóa “nhân tố VIII” trong điều trị bệnh máu khó đông Thay gen mã hóa Anpha-1-anti-trypsin khi chữa bệnh thiếu hụt Anpha-1-anti-trypsin Thay gen mã hóa enzyme glucocerebrosid