Đề tài Một số ứng dụng quan trọng của Axit Axetic

n giải các chất gây mệt mỏi nên hết bệnh Điều tiết độ kiềm acid dịch thể, duy trì tương đối ổn định của môi trường trong cơ thể: theo các nhà dinh dưỡng học phân tích dấm là loại thực phẩm tính kiềm sinh lý, qua sự thay thế trao đổi chất trong cơ thể sản sinh phản ứng tính kiềm. Do cơ thể mỗi ngày dùng một lượng lớn thức ăn tính acid như : thịt, cá, trứng uống một chút dấm có thể trung hòa phản ứng tính acid, từ đó duy trì cân đối acid kiềm trong môi trường cơ thể Giúp tiêu hóa, lợi cho hấp thụ : thức ăn chua có thể nâng cao độ acid dịch dạ dày, các chất trong dấm cũng như acid amin có thể kích thích trung khu thần kinh não của người làm cho bộ máy tiêu hóa tiết ra giúp tăng cường chức năng tiêu hóa của dạ dày. Đồng thời dấm có khả năng làm hòa tan các chất dinh dưỡng muối vô cơ phosphat, Fe, Ca trong thức ăn càng nhiều, nó có khả năng phòng chống sự phá hoại của vitamin C. Ở đây không những nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, lại có lợi cho tiêu hóa và hấp thụ Phòng già yếu : dấm có khả năng ức chế và hạ thấp trong cơ thể hình thành loại mỡ oxi hóa có tác dụng trì hoãn cơ thể già yếu Diệt khuẩn kháng độc : có tính diệt khuẩn mạnh, ức chế khả năng của vi trùng, ví dụ như vi trùng que bệnh thương hàn, vi trùng qua đại tràng gặp dấm điều bị tiêu diệt hoặc ngừng phát triển Phòng trị cao huyết áp và sơ cứng động mạch : Đông y có tác dụng tàn huyết làm cho mạch máu chảy bình thường, huyết áp ổn định. Tây y nơi dấm có thể xúc tiến bài tiến ion Na, ức chế sự dư thừa muối trong cơ thể, từ đó ổn định huyết áp. Nói chung dấm đối với huyết áp và sơ động mạch có tác dụng trị liệu rất tốt Tăng cường chức năng bài tiết của thận, phòng ngừa sỏi thận trong cơ thể. Nước tiểu của con người thường mang tính acid, dễ dàng làm muối trong nước tiểu kết tinh thành sỏi, dấm có thể làm nước tiểu biến thành kiềm tính, có thể phòng chống sỏi đồng thời làm hòa tan sỏi thận tính acid Phòng trị bệnh béo phì : theo nghiên cứu dấm chứa acid amoni, ngoài việc thúc đẩy mỡ chuyển hóa nhiều trong cơ thể người thành năng lượng tiêu hao của cơ thể còn có thể làm cho việc trao đổi chất của chất dinh dưỡng như protid, đường hấp thụ vào tiến hành thuận lợi, do đó có tác dụng phòng giảm béo phì tốt Diệt kí sinh trùng như giun đũa, giun kim Kháng ung thư Làm đẹp da : không những ức chế sắc tố da, giảm vết nhăn ở người già mà có thể tăng tuần hoàn máu cho da thay tế bào già, co rút lỗ chân lông lại, làm cho da vừa mịn vừa láng Làm tỉnh rượu : các chất acid trong dấm có thể cùng hấp thụ acid acetic cồn trong cơ thể người, phát sinh phản ứng hình thành acid acetic làm giảm độc tính cồn đối với thần kinh nhờ đó đạt được công hiệu làm tỉnh rượu Chương 2 :TÁC NHÂN VI SINH VẬT Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acetic nên còn được gọi là vi khuẩn acetic. Đây là những vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có trên bề mặt lá, quả, hoa, tạo acid acetic từ rượu etylic. Đặc điểm hình thái Vi khuẩn actic là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử. Về hình dạng tế bào vi khuẩn acetic là trực khuẩn hình que tới elip, kích thước tế bào 0.6-0.8 mm/ 1-3 mm. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, 1 số xếp 2 tế bào, 1 số khác xếp thành chuỗi dài. Một số loại đặc biệt có tế bào hình cầu, có loại hình chỉ. Tùy điều kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi 1 số loài có thể có dạng hình bán nguyệt. Nhiều loài vi khuẩn acetic khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hay môi trường đã nuôi cấy lâu (môi trường già) dễ sinh ra hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài ra) có thể phân nhánh. Vi khuẩn acetic có khả năng tạo bào tử và màng nhày, một số có khả năng di động nhờ tiên mao, 1 số không có khả năng này Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, đều đặn, đường kính trung bình 3 nm. Trên môi trường lỏng vi khuẩn actic chỉ phát triển trên môi trường tạo thành những lớp màng dày mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành màng dày như sứa (0.5mm), nhẵn và trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó 1 lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Khi nuôi cấy màng người ta thấy có sợi cellulose giống như ở trong sợi bông. Loại 2 có màng mỏng như giấy celophan, 1 số khác trên bề mặt của màng không nhẵn mà nhăn nheo, 1 số nữa tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong. Đặc điểm sinh trưởng Vi khuẩn acetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay manitol. Phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-30oC, pH 5,4-5,8. Tính chất đặc trưng của vi khuẩn acetic là khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic ở pH 4.5. Ngoài ra còn thực hiện quá trình oxy hóa acid acetic, oxy hóa lactate, chuyển glucose thành gluconate, oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất ketone, hay các acid hữu cơ tương ứng. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn C, N và chất sinh trưởng cũng rất đa dạng. Vi khuẩn acetic sử dụng đường, etylic và các acid hữu cơ làm nguồn C, muốâi amon làm nguồn N. Trong quá trình phát triển vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với 1 số acid amin như valin, alanin, prolin, isolosine Một số chất kích thích sinh trưởng như acid nicotine, acid amin, folic và biotin có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn acetic. Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp poly saccaride phân tử lớn như cellulose, tinh bột, dextran và người ta ứng dụng khả năng này trong sản xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông A. xylimum, acetigenum, viizingianum Phân loại Năm 1950 Frateur chính thức đưa ra khóa phân loại mới dựa trên tiêu chuẩn Khả năng tạo catalase Khả năng tổng hợp các keto từ các rượu bậc cao như glycerol,manitol, sorbitol Khả năng oxy hóa acetate thành CO2 và H2O Khả năng oxy hóa glucose thành acid gluconic Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ và sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon Tạo sắc tố nâu Tổng hợp cellulose Trên cơ sở này, Frateur chia vi khuẩn acetid làm 4 nhóm Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur Tên nhóm Vi khuẩn đại diện Đặc điểm Subosydans Acetobacter subosydaz, Acetobacter melanogennum Không co khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O Mezoxydans Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum, Acetobacter mezoxydan Có đầy đủ các đặc điểm trên Oxydans Acetobacter ascendans Acetobacter ransens Actobacter lovaniens Không có khả năng tạo các hợp cất keto Peroxydans Acetobacter peroxydans Acetobacter paradoxum Không chứa catalase, không oxy hóa glucose Một số vi khuẩn thường sử dụng trong lên men giấm Để quá trình lên men giấm đạt hiệu quả cao, lựa chọn những chủng vi khuẩn thỏa điều kiện Phải oxy hoá etylic tốt nhất Tạo giấm có nồng độ acid acetic cao, chịu được độ cồn và acid cao Các tính chất ban đầu được giữ nguyên trong suốt quá trình lên men Các điều kiện phân lập, nuôi cấy, bảo quản giống đơn giản không tốn kém nhiều phù hợp với điều kiện Việt Nam Người ta thường sử dụng những giống sau[3]: - A. aceti: Trực khuẩn ngắn có dạng hình que kích thước 0,4-0,8 và 1-1,2 mm, không di động thường xếp thành chuỗi dài. Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iod. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gellatin với dịch lên men chứa 10% đường saccharose, tạo thành màng dày nhẵn, không được nâng lên theo thành bình, có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu khá cao (11%), có khả năng tích lũy 6% acid acetic. Nhiệt độ thích hợp phát triển 34oC. Nếu nhiệt độ cao quá 43oC sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. Thường phát triển trên bia. - A. xylinum Trực khuẩn dạng hình que 2 mm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi không di động. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, tạo váng nhẵn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và H2SO4 (phản ứng của hemicellulose) vì váng có chứa hemicellulose, có thể oxy hóa rượu tạo 4.5% acid acetic trong môi trường, ngoài ra chúng còn có khả năng oxy hóa tiếp acid acetic thành CO2 và H2O - A. pasteurianum Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống A. aceti, nhưng khi ta nhuộm chúng với iot, tế bào sẽ cho màu xanh Khả năng chịu nổng độ cồn của chúng thấp hơn của A. aceti. Trong điều kiện môi trường phát triển thuận lợi, chúng có khả năng tạo được 5-6% axit axetic - A. orleaneuse Hình thái vi khuẩn này giống hai vi khuẩn trên, nhưng lại có kích thước nhỏ hơn nhiều. Đặc biệt hai đầu của tế bào thường nhỏ lại. Nhiều trường hợp người ta lẫn lộn vi khuẩn này với vi khuẩn kỵ khí Clostridium. Trong dịch nước cấy, chúng thường tạo ra một váng rất mỏng trên bề mặt. Váng vi khuẩn thường rất chắc, khi nhuộm với iot, tế bào sẽ chuyển sang màu vàng. Vi khuẩn này chịu đựng được lượng cồn đên12%V, và trong điều kiện lên men thích hợp, chúng có thể tạo ra được 9,5% axit axetic - A. Schiitzenbachii Vi khuẩn này thuộc vi khuẩn hình que, nhưng kích thước của chúng dài hơn các giống đã trình bày ở trên. Chúng không tạo bào tử, không có khả năng chuyển động và thuộc vi khuẩn gram (-) Khi phát triển ở môi trường lỏng, chúng tạo ra lớp màng dày nhưng không chắc. Ở các nước trên thế giới, người ta thường sử dụng chúng để sản xuất giấm theo phương pháp chìm Trong điều kiện môi trường thuận lợi, chúng có khả năng tạo được 11-12% axit axetic - A. curvum Về cơ bản vi khuẩn này giống A. Schiitzenbachii Trong môi trường lên men thuận lợi, vi khuẩn này có thể tạo ra được 10-11% axit axetic. Vi khuẩn A. curvum tạo váng rất chắc trên bề mặt môi trường. Nhiệt độ lên men tối ưu của vi khuẩn này là 35-37oC - A.suboxydans Vi khuẩn A.suboxydans được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất vitamin C. Chúng có khả năng chịu đựng được nồng độ cồn rất cao. Nếu trong môi trường, ta cho thêm một lượng nhỏ các chất dinh dưỡng cần thiết, ví dụ như glucose, vi khuẩn này có thể chuyển hóa hoàn toàn cồn thành axit axetic. Lượng axit axetic tạo được từ quá trình lên men có thể lên đến 13% Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này tiến hành lên men là 28-30oC. Thời gian lên men xảy ra rất nhanh, chỉ cần 48h, lượng axit axetic có thể đạt được đến 13% Trong quá trình lên men cần phải thông khí liên tục vì vi khuẩn này cần lượng oxy rất nhiều cho quá trình chuyển hóa cồn thành axit axetic và cho quá trình phát triển 2.5 Aûnh hưởng của các điều kiện môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men axetic 2.5.1 Aûnh hưởng của oxy Lượng oxy cần thiết lớn gấp 2 lần lượng oxy lý thuyết, càng thoáng khí năng suất càng cao. Ở phương pháp chậm do bề mặt tiếp xúc giữa tế bào và không khí bị hạn chế bở sự bao phủ bề mặt dịch lên men của lớp váng giấm và độ dày lớp dung dịch. Vì vậy mà quá trình lên men kéo dài 3-5 tuần, nồng độ giấm thu được 3-7% acetic. Phương pháp tuần hoàn tạo bề mặt tiếp xúc lớn, quá trình giảm 5-7 ngày, phương pháp chìm thời gian 72-96h, nồng độ giấm 7-14% 2.5.2 Aûnh hưởng nhiệt độ Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25-32oC. Nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm, nhiệt độ cao ức chế hoạt động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất của vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acetic và etylic. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất giấm 22-35oC, nhiệt độ tối ưu là 18-24oC, 27-32oC 2.5.3 Aûnh hưởng của các nguồn C, N, P và các nguyên tố vi lượng Sự acid hóa của dịch lên men Trong sản xuất giấm người ta thường cho vào cơ chất ban đầu 1 lượng giấm nhất định để axit hóa môi trường nhằm: Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật các loại Đưa vào dịch lên men một lượng tế bào nhất định Độ acid ban đầu 2-6%. Hàm lượng cao hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và giảm khả năng lên men. Nồng độ axit axetic 8% ức chế hoạt động của vi khuẩn rất lớn Hàm lượng etylic trong dịch lên men Etylic là chất sát khuẩn với vi khuẩn acetic, được sử dụng như cơ chất. Hàm lượng rượu 2-10% thể tích, cao hơn làm giảm năng suất lên men’ Để tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục acid acetic thành CO2 và H2O cần có 1 lượng rượu sót trong sản phẩm từ 0.2-0.5%, lượng rượu sót có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate Các chất C, N, P và nguyên tố vi lượng Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men cần bổ sung 1 số muối khoáng (NH4)2SO4, KH2PO4, CaHPO4, FeCl3 tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài Ngoài ra trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men Trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung sake, muối đậu nành, acid lactic, glycerine Chương 3: BẢN CHẤT SINH HÓA Lên men axetic là quá trình oxy hóa rượu thành axit axetic, nhờ vi khuẩn axetic, trong điều kiện hiếu khí. Phương trình tổng quát: C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 117 Kcal Phản ứng xảy ra trong tế bào của vi khuẩn. Muốn phản ứng được xảy ra, C2H5OH vaØ O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào. Khi đó các enzyme oxy hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa rượu tạo thành CH3COOH. CH3COOH được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan trong dung dịch môi trường. CH3COOH O2 C2H5OH CH3COOH Môi trường Tế bào Môi trường Hình 3.1 Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic Trong sự oxy hóa ethanol thành acid acetic, chuyển hóa thực chất là 1 sự sử dụng cơ chất. Ở đây NADPH2 xuất hiện được chuyển hóa qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng, song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn do vậy quá trình cũng còn được gọi là sự oxy hóa không hoàn toàn. Loại chuyển hóa này có thể trải qua nhiều bước Các đại diện của vi khuẩn acetic (Acetobacter, gluconobacter) oxy hóa không chỉ etanol mà cả 1 phổ rộng các rượu bậc 1, 2 cũng như các polyol. Người ta phân biệt các loài vi khuẩn mà sản phẩm của chúng được giữ lại được gọi là các loài oxy hóa thấp (suboxidant), thuộc về nhóm này có vi khuẩn acetic tạm thời sau đó lại bị oxy hóa tiếp được xếp vào nhóm oxy hóa cao (peroxidant) chẳng hạn A.peroxidans, A. pasteurianum, giữa 2 nhóm này có sự chuyển tiếp Sản xuất giấm Các phản ứng được dùng để sản xuất giấm ăn nhờ A. suboxidans Sau sự hydrate hóa acetaldehyde sẽ diễn ra 1 loại H2 lần thứ 2 Hidro được NADP nhận và qua các citochrome được chuyển đến O2 là chất nhận điện tử cuối cùng Chương 4: KỸ THUẬT SẢN XUẤT AXIT AXETIC Bản chất của quá trình lên men là lên men hiếu khí, vì thế phải tạo điều kiện tối đa để vi khuẩn tiếp xúc được với oxy và cồn Để giải quyết tốt vấn đề này có 4 phương pháp khác nhau: Phương pháp lên men chậm Phương pháp lên men nhanh Phương pháp lên men chìm Phương pháp kết hợp 4.1.Những yêu cầu kỹ thuật[2] 4.1.1.Nồng độ axetic Axit axetic sinh ra sẽ gây ảnh hưởng ức chế đến sinh lý của vi khuẩn axetic. Nếu nồng độ của axit axetic đạt 8% sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn và nếu nồng độ axit axetic 12-14% sẽ ức chế toàn bộ của vi khuẩn 4.1.2.Nồng độ rượu Tùy từng loại mà chúng có khả năng tồn tại ở những nồng độ rượu khác nhau. Thông thường người ta sử dụng nồng độ rượu từ 11-13%. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa axit axetic để thu nhận năng lượng dùng cho sự sống. Vì thế đây là một quá trình có hại. Trong sản xuất, người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là 0,3-0,5% 4.1.3.Nhiệt độ Tùy theo từng loài mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa. Nhưng trong sản xuất, người ta dùng những loài vi sinh vật thích ứng cho quá trình oxy hóa là 30-40oC 4.1.4.Độ thoáng khí Oxy là một yếu tố quan trọng cho quá trình lên men giấm. Quá trình oxy hóa chỉ xảy ra khi trong môi trường vi khuẩn được tiếp xúc với không khí. Càng được thoáng khí khả năng oxy hóa càng tốt Trong môi trường dinh dưỡng, ngoài rượu ra cần có các chất vô cơ, gluxit và các hợp chất hữu cơ chứa nito dễ hấp thụ. Khi sử dụng một hectolit rượu cần 25g supepphosphat, 25g sunphat amon, 0,9g K2CO3 và 500g glucose hoặc tinh bột được thủy phân 4.2 Qui trình làm giấm Rượu trắng Nước Đường Giống vi sinh vật Trộn đều Lão hóa Bảo quản Sản phẩm Lên men Đóng chai 4.3 Các phương pháp lên men[2,3] 4.3.1.Phương pháp lên men chậm Nước ép nho Thùng gỗ 250-300l Axit axetic Acetobacter orleaneuse Lên men Sản phẩm Phương pháp này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là phương pháp truyền thống của người Pháp Nguyên liệu dùng để sản xuất axit axetic là nước nho. Giống vi khuẩn axetic được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse Người ta thường cho vào thùng lên men bằng gỗ có dung tích 250-300 l bằng gỗ sồi hình tang trống 1/5 thể tích lượng axit axetic và sau đó cho vào thùng dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt ½ thể tích thùng lên men ( hoặc 2/3 thể tích thùng lên men). Sở dĩ người ta cho axit axetic trước để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị nhiễm Tiến hành quá trình lên men ở nhiệt độ thường. Sau một thời gian, trên bề mặt sẽ tạo thành váng chứa nhiều axit axetic. Vì thế mà quá trình oxy hóa xảy ra chậm và kết thúc sau vài tuần. Khi kiểm tra rượu còn lại 0.3-0.5% sẽ lấy giấm ra, cho dịch dinh dưỡng mới vào. Nếu để lâu, chất lượng giấm bị giảm nhanh do quá trình oxy hóa giấm xảy ra tiếp tục. Giấm thu đuợc thường có lượn axit 5-6%. Muốn để lâu phải đem thanh trùng Pasto 4.3.2. Phương pháp lên men nhanh Phương pháp này do người Đức thực hiện theo qui mô công nghiệp Thiết bị lên men là một thùng gỗ cao 2,5-6m, có đường kính 1,2-3m. Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất. Trong thùng được chất đầy phoi bào hay lõi bắp. Phoi bào hay lõi bắp được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men, nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị, người ta cho lắp một hệ thống phân phối, không khí đưa từ dưới lên. Môi trường được đưa vào từ trên xuống Đầu tiên, người ta dùng axit axetic có nồng độ 3-5% chảy qua lớp phoi bào hay lõi bắp để vừa có mục đích thanh trùng vừa có tác dụng axit hóa vật liệu chất mang để vi sinh vật giống dễ thích nghi trong quá trình lên men. Sau đó, dùng nước vô trùng rửa qua và nạp giống vi khuẩn axetic vào. Vi khuẩn axetic sẽ bám vào phoi bào hay lõi bắp. Tiếp đó người ta cho dòng môi trường từ trên xuống qua hệ thống phân phối như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi trường sẽ được phân phối đều khắp vật liệu phoi bào hay lõi bắp. Cùng lúc, người ta thổi khí từ dưới lên Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa các tế bào vi khuẩn. Cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn, không khí được đưa từ dưới đáy thiết bị lên trên, thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn tiến hành quá trình oxy hóa rượu thành CH3COOH sẽ thẩm thấu qua màng tế bào ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men. Người ta thu nhận từ đáy thiết bị lên men. Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24-37oC. Thời gian lên men kéo dài 8-10 ngày. Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa lượng axit axetic thấp, người ta tiến hành tái lên men bằng cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống Ngoài ra còn có những phương pháp lên men nhanh khác: + Phương pháp nhúng: người ta thiết kế thùng lên men hình trụ, bên trong lắp nhiều giỏ chứa đầy chất mang( mạt cưa, lõi bắp, than củi hay các vật liệu cellulose có khả năng giữ vi sinh vật trên đó). Các giỏ này có thể nâng lên hoặc hạ xuống được Người ta chuẩn bị môi trường và đổ môi trường váo thùng lên men. Vi sinh vật sẽ được làm bám dính vào các vật liệu đựng trong giỏ. Giỏ chứa vật liệu có vi sinh vật sẽ được nhúng xuống dung dịch lên men rồi lại nhấc chúng lên khỏi dung dịch. Khi chiếc giỏ chứa chất mang có vi sinh vật thấm đầy môi trường và được nhấc lên không khí, quá trình oxy hóa rượu được xảy ra. Thao tác này được lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ có tác dụng oxy hóa hết lượng cồn có trong dung dịch + Phương pháp hình trống quay: người ta thiết kế thiết bị lên men có hình trụ nằm ngang bên trong một thùng chứa dung dịch lên men hở nắp. Thiết bị hình trụ này được bọc một lớp vật liệu có khả năng thấm nước và có khả năng giữ vi sinh vật. Một nửa thiết bị này nằm trong lòng dung dịch lên men, một nửa nằm trên dung dịch lên men và được tiếp xúc với không khí. Khi vận hành, một nửa thiết bị luôn luôn được tiếp xúc với không khí. Người ta thiết kế hệ thống quay này với vận tốc rất chậm để đủ thời gian cho quá trình oxy hóa cồn thành axit axetic 4.3.3 Phương pháp lên men chìm Người ta thiết kế hệ thống lên men axetic được gọi là acetator. Người ta cho dung dịch lên men vào thiết bị và tiến hành thổi khí rất mạnh. Khi đó trong dung dịch lên men sẽ tạo ra thể huyền phù và dung dịch lên men. Hai thể này luôn luôn được trộn lẫn nhau và như vậy, quá trình oxy hóa xảy ra rất mãnh liệt 4.3.4 Phương pháp kết hợp: Người ta thiết kế hệ thống lên men bao gồm hai phần: phần trên là lớp đệm hay lớp chất mang chứa vi sinh vật ( giống phương pháp nhanh), lớp giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống. Dưới cùng là hệ thống thổi khí mạnh, khí sẽ được thổi qua phần dung dịch này rồi chuyển ngược lên phần trên( giống thiết bị lên men chìm) 4.4 Phương pháp nâng cao nồng độ axit axetic trong dịch lên men[3] Hàm lượng axit axetic có trong dịch lên men thường không cao, trong khoảng 5-10%. Axit axetic có trong dịch lên men thường lẫn với các chất khác, do đó, dịch sau lên men chỉ có thể sử dụng để chế biến thực phẩm. Trong nhiều nghành cần sử dụng axit axetic, người ta yêu cầu hàm lượng axit axetic trong dung dịch phải cao và có độ tinh khiết. Chính vì thế việc nâng cao hàm lượng axit axetic trong dung dịch lên men và làm sạch axit axetic là việc làm rất cần thiết Những phương pháp để nâng cao hàm lượng và tinh chế axit axetic 4.4.1 Phương pháp chưng cất:Mục đích sử dụng phương pháp này để nhận axit axetic có hàm lượng cao hơn. Phương pháp này rất đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này thường tiêu hao nhiều năng lượng và hàm lượng axit axetic thường không cao 4.4.2 Phương pháp chưng cất bằng muối:Người ta sử dụng một cấu tử có khả năng phân ly mạnh làm thay đổi trạng thái cân bằng lỏng-hơi. Trong chưng cấ