Đề tài Nghiên cứu alkaloid và quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid

ời ta đã xác định được 4959 Alcaloid khác nhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học. Hiện nay đã phát hiện ra được rất nhiều số lượng Alcaloid và cũng đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng [5]. 2.2 Khái quát về Alkaloid [1][5][26]. 2.2.1 Khái niệm. Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là: - Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. - Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh. - Có hoạt tính sinh học rất quan trọng. - Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng. Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. 2.2.2 Cấu tạo hóa học. Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông tin về hóa học. Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi vì chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu. Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng. Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin, Hordenin, là các protoalkaloid. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiên cứu alkaloid. 2.2.3 Phân loại. Đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chất alkaloid trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét ra chưa đáp ứng nên ngày càng có xu hướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin, Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành các nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin… Bảng 1:Một số dạng cấu trúc nhóm Alkaloid Tên cấu trúc Công thức Hợp chất thí dụ Apocphin Stephanin, Apomocphin Erythrinan Erythratin Pyrolidin Nicotin, Stachydrin, Hygrin Indol Reserpin, Strychnin, Echitamin Mocphinan Mocphin, Codein Purin Cafein, Theophylin Pyridin Rixinin Pyroligidin Heliotridin Quinolin Dictamnin Steroit Solasodin, Tomatidin Tropan Hyosxinamin,Cocain 2.2.4. Phân bố alkaloid. Cromwell (1995) ước tính Alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thực vật có hoa. Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng Alkaloid có từ 12%-20% trong tổng số cây có nhựa. Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn 300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa Alkaloid. Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số cây có chứa Alkaloid là cây hai lá mầm. Chí có một số ít cây chứa Alkaloid là cây 1 lá mầm và nghành hạt trần. Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây bụi có nhiều Alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lương phân tử của Alkaloid trong cây gỗ thường bé hơn trọng lượng phân tử cây thuộc thảo. Cây một năm có nhiều Alkaloid hơn cây lưu niên (Levin, 1976). Alkaloid không có trong loài sống ở nước ngoại trừ họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943). Thực ra rất nhiều loài có Alkaloid nhưng chỉ ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có Alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% Alkaloid so với dược liệu khô. Mối liên quan giữa Alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã được nghiên cứu. Cây có chứa Alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại (Trelibs,1955) . Hiện tượng này đưa đến ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm hợp chất này đối với cây cỏ là giống nhau. Một vài nhận xét khác là sự có mặt của axit amin thông thường và 1 vài loại axit amin đặc biệt (tiền chất của Alkaloid) trong các loài với nồng độ song song với nồng độ Alkaloid (Michels – Nyomorkay, 1970; Paris và Girre, 1969). Điều này khẳng định thêm quá trình tổng hợp Alkaloid trong cây bắt nguồn từ các axit amin. 2.2.5. Sinh tổng hợp Alkaloid. Có rất nhiều sách và tổng quan đề cập đến vấn đề sinh tổng hợp Alkaloid trong cây ( Mothes và Schute, 1969; Robinson, 1968; Spenser, 1970). Nói chung cho đến nay người ta thừa nhận rằng đại đa số Alkaloid là dẫn xuất của Axit amin. Mối quan hệ giữa Alkaloid và các axit amin đã được biết đến từ đầu thế kỷ 20 và đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp Alkaloid từ axit amin. Có thể nói giai đoạn quan trọng đầu tiên trong sự chuyển hóa axit amin thành Alkaloid là sự khử Cacboxyl thành một amin và tiếp đến là sự oxy hóa amin này thành andehyt bởi men oxydaza amin. Việc ngưng tụ một nhóm amin bởi Andehyt dẫn đến tạo các vòng đặc trưng cho Alkaloid Mặc dù đại đa số Alkaloid dẫn xuất của axit amin nhưng một số Alkaloid khác lại bắt nguồn từ một số tiền chất riêng. Bằng phương pháp dùng axit amin có nguyên tố đồng đánh dấu người ta chứng minh rõ ràng về các tiền chất Alkaloid. 2.3. Tính chất của Alkaloid [1][26]. 2.3.1. Tính bazơ. Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhưng độ kiềm của Alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử N gây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác. Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự Amoni bậc 4, Amoni bậc 1, Amoni bậc 2, Amoni bậc 3. Tính bazơ phản ánh ở pKa khác nhau của các Alkaloid. Các bazơ yếu (trị số pKa thấp) sẽ cần môi trường axit mạnh hơn để tạo thành muối trong dung dịch nước. Vì vậy ở môi trường axit yếu một số Alkaloid bazơ mạnh có thể chuyển thành muối trong khi các bazơ yếu vẫn tồn tại trong dung dịch dưới dạng bazơ. Đặc tính này được ứng dụng trong việc tách các nhóm Alkaloid có trị số pKa khác nhau bởi hỗn hợp của chúng. Bảng 2: Giá trị pKa của một số Alkaloid ở cây thuốc lá. 2.3.2. Tính hòa tan. Hầu hết các Alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, ete và các ancol bậc thấp (MeOH, EtOH, PrOH, BuOH). Một số nhóm Alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tạo được một phần trong nước hoặc trong kiềm. Ví dụ: Mocphin, Cephalin, do có nhóm OH phenol nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thi gần như là không tan trong ete. Ngược lại với bazơ, các muối Alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn nhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: CHCl3. ete, benzene. Có một số trường hợp ngoại lệ như Ephedrin, Colchixin, Ecgovonin, các bazơ của chúng tan được trong nước nhưng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các muối của chúng thì ngược lại. *. Alkaloid có N – Bậc 4 và N – Oxit Bazơ của Alkaloid có N – Bậc 4 và N – Oxit khác tan trong nước và trong kiềm ít tan trong dung môi hữu cơ. Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhau tùy thuộc vào gốc axit tạo ra chúng. Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dưới dạng muối có độ hòa tan thấp nhất. Đối với các Alkaloid N – Oxit thì dùng phản ứng khử. Oxy bằng bột kẽm trong môi trường HCl để chúng chuyển thành Alkaloid dạng thường sau đó kết tủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ. 2.4. Cơ sở và nguyên tắc tách chiết Alkaloid [1][26].. 2.4.1 Cơ sở và nguyên tắc. - Dựa vào những định luật chi phối của quá trình chiết xuất là khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích, độ hòa tan. - Dựa vào khă năng hòa tan của các Alkaloid trong các dung môi hữu cơ, vô cơ và nước mà ta tiến hành tách chiết các Alkaloid ra khỏi nguyên luyện. - Dựa vào các tính chất lý hóa của các Alkaloid mà ta tiến hành tác chiết và tinh sạch chúng. 2.4.2. Một số đặc tính khác cần chú ý trong quá trình chiết xuất. Trong cây, Alkaloid tồn tại dưới dạng muối của các axit hữu cơ nhưng một số kết hợp với tanin (nhất là những cây có nhiều tanin) vì vậy đối với dược liệu có nhiều tanin thì cần dùng dung môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết nóng để tách Alkaloid ra khỏi tanin và hòa tan vào dung môi. Một số loại Alkaloid là các este như Atropin, Cocain, Heliotrin có thể bị thủy phân trong quá trình chiết xuất nên rất hạn chế sử dụng nhiệt độ cao. Ngược lại một số Alkaloid tồn tại trong cây dưới dạng Glycozit (Glycoancaloit) như Solamacgin, solasonin trong các loài Solanum. Để chiết các Alkaloid này cần có giai đoạn thủy phân. Nói chung, một số Alkaloid là một chất tương đối bền vững so với nhiều chất tự nhiên khác. Nhưng một số hợp chất thuộc nhóm indol rất dễ bị thủy phân hoặc biến chất bởi ánh sáng và các tác nhân oxy hóa – khử khác nên cần chú ý khống chế các yếu tố có thể làm hỏng Alkaloid trong quá trình chiết xuất trong khí quyển nitơ. Đại đa số các Alkaloid là chất kết tinh không màu và có điểm chảy xác định, chỉ có một số ít Alkaloid có màu vàng (Becberin, Palmatin, Secpentin…) có thể lợi dụng chúng trong quá trình chiết tách. 2.5. Chiết xuất Alkaloid [1][5][26]. Nói chung Alkaloid có thể chiết từ dược liệu khô tán bột. Để hạn chế khó khăn trong quá trình chiết tách, đối với dược liệu nhiều chất béo, chất màu nên có giai đoạn loại tạp. Có 2 cách : Ngâm bột dược liệu với ete dầu hoặc ete trong vài giờ hoặc 1 ngày. Chiết liên tục bằng Soxhlet hoặc hồi lưu với ete dầu trong 1 – 2 giờ. Bột loại tạp xong, để khô tự nhiên. Có 2 phương pháp chính để chiết xuất Alkaloid: Chiết bằng dung môi hữu cơ và chiết bằng dung dịch nước axit hoặc cồn. 2.5.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ. Để chiết Alkaloid bằng dung môi hữu cơ, trước hết bột dược liệu phải được tẩm dung dịch kiềm để chuyển Alkaloid muối trong dược liệu thành dạng bazơ. Kiềm thường dùng là vôi, NaOH, NH4OH. Dung môi có thể là clorofoc, ete, benzen, Etyl clorua. Clorofoc là dung môi thích hợp nhất cho hầu hết các loại Alkaloid bazơ (trừ Alkaloid có N – Bậc 4 và N – Oxit có cách xử lý riêng). Các bước tiến hành: - Bột dược liệu được tẩm dung dịch ammoniac 10% (hoặc dung dịch Na2CO3; NaOH; vôi) để yên 1 – 2 giờ. - Cho bột dược liệu đã tẩm vào binh Soxhlet. Cho CHCl3 vào ngập bột dược liệu, ngâm 1 – 2 giờ. - Tiến hành chiết nóng. Với lượn dược liệu bé thường thì từ 3 – 6 giờ là đủ. Nếu chiết trên 1 kg thì chiết bằng đun hồi lưu từ 6 – 10 giờ và chiết lại lần thứ 2 từ 2 – 4 giờ. - Dịch chiết clorofoc, cất thu hồi dung môi còn khoảng độ 1/2 hoặc 1/3. Sau đó lắc với dung dịch axit hữu cơ hoặc vô cơ 1 – 2 %. Các axit có thể dùng là : tactic, axetic, sunfuric, HCl. Như đã nói ở trên, cần xem xét pKa của các Alkaloid định chiết để cho đủ lượng axit cần thiết để chuyển Alkaloid bazơ trong dung dịch chiết CHCl3 thành muối hòa tan trong nước. Nếu không đủ axit Alkaloid sẽ nằm lại trong lớp CHCl3. Lượng dung dịch axit mỗi lần chiết không cần nhiều nhưng cần chiết nhiều lượt. Với 100 ml dung dịch CHCl3 thì lần đầu dùng 20 – 30 ml dung dịch axit và các lần sau (5 – 7 lần) chỉ cần dùng 15 ml. Theo dõi bằng thuốc thử Alkaloid trong quá trình tách chiết. Chú ý kỹ thuật chiết rất quan trọng. Phải chiết kiệt nhưng đồng thời không để dung dịch bị nhũ hóa. Thường mỗi lần chiết, lắc bình chiết qua lại 100 lần là đủ. Nếu bị nhũ hóa không nhiều ta có thể xử lý bằng cách ly tâm hoặc lọc qua lớp giấy lọc thô. Nếu nhũ hóa nhiều phải để một thời gian trong tủ lạnh. - Để loại tạp như Clorophyl, chất màu, nhựa thì lắc dung dịch axit Alkaloid với dung môi hữu cơ như ete, ete dầu, CHCl3 một vài lần. - Cho dung dịch axit Alkaloid vào bình gạn rót vào đó một lượng CHCl3 (hoặc ete) sau đó cho từ từ dung dịch NH4OH 10 % (hoặc loại kiềm khác) đến pH đã chọn tùy theo yêu cầu định chiết. - Nếu trong dung dịch axit có nhiều nhóm Alkaloid cần sơ bộ tách phân đoạn thì trước tiên cho dung dịch pH: 2 – 3 để chiết lấy riêng các Alkaloid bazơ yếu. Sau khi chiết lấy Alkaloid bazơ yếu xong, nâng pH dung dịch lên 6 – 7 để chiết lấy các Alkaloid bazơ trung bình. Sau cùng nâng dung dịch lên pH: 10 – 12 để chiết lấy các Alkaloid bazơ mạnh. - Nếu chỉ chiết lấy Alkaloid toàn phần thì kiềm hóa dung dịch axit đến pH : 10 – 12 và chiết với CHCl3 như trên. - Dịch chiết CHCl3 tách riêng, làm khan bằng Na2SO4 khan (thường dùng 1 – 2 g cho 60 ml CHCl3 hoặc 50 ml ete và lắc trong 15 phút ). Nếu có điều kiện để dung dịch CHCl3 này vào bình hút ẩm qua đêm, sau đó lọc và cất thu hồi dung môi, được Alkaloid. Bột dược liệu được tẩm kiềm chiết nóng CHCl3 Cất thu hồi CHCl3. Hòa cắn vào nước axit 1% Dịch chiết CHCl3 lắc với nước axit 1 – 2 % Dịch chiết axit lắc dung môi hữu cơ loại tạp Dung dịch axit kết tủa bằng kiềm pH= 10 – 12 Dịch chiết Alkaloid đã loại tạp + kiềm, chiết với CHCl3 Dung dịch axit lần lượt chiết CHCl3 ở pH khác nhau Dịch chiết CHCl3 cất dung môi pH2= Alkaloid bazơ yếu pH7= Alkaloid bazơ trung bình pH12 = Alkaloid bazơ mạnh Alkaloid toàn phần Hình 1: Sơ đồ chiết bằng dung môi hữu cơ 2.5.2. Chiết bằng dung dịch nước axit hoặc bazơ. Khác với phương pháp trên, phương pháp này dùng dung dịch axit vô cơ hoặc hữu cơ để chiết Alkaloid dưới dạng muối hòa tan. Axit thường dùng là: tactic, axetic, sunfuric, HCl, tùy theo loại Alkaloid. Cách chọn axit là dựa vào độ hòa tan của muối Alkaloid trong nước. Ví dụ : - Stricnin bazơ có độ hòa tan trong nước ở 250c là 0.016% . - Stricnin sunfat có độ hòa tan trong nước ở 250c là 3.2 %. - Stricnin nitrat có độ hòa tan trong nước ở 250c là 2.3 %. Như vậy để chiết Stricnin trong hạt mã tiền nên dùng axit sunfuric. Nồng độ axit thường là 0.5 – 1 %. Dung dịch nước axit là dung môi rẻ tiền và thích hợp cho sản xuất Alkaloid hiện nay. Nhưng có một nhược điểm cơ bản là nước khó bốc hơi vì vậy khi cần cô đặc dung dịch để kết tủa dung dịch Alkaloid dạng bazơ được triệt để thì vệc thực hiện sẽ khó khăn nhất là trong điều kiện chưa có đủ trang thiết bị hệ thống cô bằng áp suất giảm. Vì vậy điều kiện cho phép thì thay nước axit bằng cồn axit. Cồn có thể dùng là cồn metylic, etylic, hoặc propylic. Cồn axit có khả năng hòa tan Alkaloid mạnh hơn nước axit đồng thời ít hòa tan tạp chất ( protein thực vật, hydratcarbon…) hơn nước. Ưu điểm cơ bản của cồn là dễ bốc hơi nên dễ dàng cô đặc để kết tủa triệt để Alkaloid vì vậy hiệu suất thu được bằng chiết cồn axit bao giờ cũng cao hơn chiết bằng nước axit. Phương pháp chiết tốt nhất đối với dung môi nước hoặc cồn axit là chiết ngâm kiệt và áp dụng kỹ thuật chiết ngược dòng, lấy một phần dịch chiết đầu để riêng, phần dịch chiết sau làm dung môi để chiết mẻ mới. Dịch chiết thu được tiến hành các giai đoạn tiếp theo như sau: - Nếu là dịch chiết nước : Để yên 1 – 3 ngày (có điều kiện nên để lạnh) để lắng tạp. Sau đó gạn lọc, nếu hàm lượng Alkaloid trong dung dịch quá thấp, cần cô đặc thì chuyển pH dung dịch bằng 7 – 8 trước khi cô đặc, vì môi trường axit Alkaloid dễ bị hỏng bởi nhiệt độ hơn là môi trường trung tính hoặc kiềm. - Nếu là dịch chiết cồn axit : trung hòa axit (pH =7) rồi cất thu hồi cồn. Sau đó hòa cặn vào dung dịch axit 1%. Để yên 1 – 3 ngày như trên. - Cách loại tạp (nhựa, clorophyl, protein, hydrat cacbon) đơn giản nhưng đòi hỏi thời gian, là để dung dịch axit ở lạnh 1 đêm sau đó đưa ra để ở nhiệt độ thường 1 ngày, lại để lạnh một đêm… lập lại nhiều lần như vậy, sau đó lắng gạn lọc lấy dung dịch trong. - Dịch lọc xong tiếp tục tiến hành như mục e, f, g của phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ. Trong sản xuât hiện nay do chưa có đủ dung môi hữu cơ để chiết Alkaloid bazơ thì phương pháp thích hợp nhất là kết tủa dung dịch chiết bằng cồn. Lọc lấy tủa. Lại hòa tan Alkaloid bazơ vào dung dịch axit, lại kết tủa bằng kiềm. Lập đi lập lại nhiều lần như vậy sẽ thu được Alkaloid thô. Cuối cùng tinh chế và kết tinh trong cồn. Một kỹ thuật nhỏ cần lưu ý là để kết tủa được tốt hơn và dễ lắng nên tủa ở nhiệt độ 60 – 700. Kết tủa xong không lọc ngay mà đển yên 1 – 2 ngày. Alkaloid sẽ tiếp tục kết tủa trong quá trình này. Khi lọc lấy tủa, dùng dung dịch ammoniac hoặc kiềm loãng để rửa tủa và cuối cùng rửa bằng nước. Hiện nay trong quá trình sản xuất Alkaloid tại nhiều nước người ta dùng nhựa trao đổi ion để tách các Alkaloid ra khỏi dung dịch chiết. Dược liệu chiết cồn hoặc nước axit Nếu chiết cồn, cất thu hồi cồn Cô còn 1/3 – 1/5 thể tích Nếu chiết cồn, cất thu hồi cồn Hoàn tan tủa vào dung dịch axit, lại tủa với kiềm Rửa cột bằng cồn Dịch chiết CHCl3 cất thu hồi Dung dịch loc kiềm hóa pH 12 Dịch lọc + kiềm chiết CHCl3 Kiềm hóa cột bằng NH4OH Dung dịch axit để lạnh loại tạp Dung dịch axit qua cột cationt Dung dịch cô(axit) để yên 1 – 3 ngày. Lọc Alkaloid toàn phần Hình 2: Sơ đồ tách chiết bằng dung dịch axit CHƯƠNG II. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ BẢN CHẤT LÀ ALKALOID TỪ THỰC VẬT I. Tách chiết, tinh sạch Salanin từ nhân hạt cây xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A. juss) trồng tại Việt Nam [2]. Cây xoan Ấn Độ còn gọi là cây neem (Azadirachta indica A. juss) họ Meliaceae được sử dụng là thuốc trừ sâu rất có hiệu quả ở nhiều nơi trên thế giới [15][16][22]. Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập hơn 60 chất limonoid có khả năng gây ngán ăn và xua đuổi côn trùng từ hạt và lá neem [7][8] [15] [30] [31][39] Ở nước ta, cây neem đang được trồng nhiều tại các tỉnh Nam Trung Bộ như Ninh Thuận, Bình Thuận để phủ xanh vùng đất cát cằn cỗi và cải tạo đất bị hoang hóa nhờ khả năng chịu hạn cao của cây. Hình 3: Cây xoan Ấn Độ Dưới đây là quy trình phân lập và xác định cấu trúc Salanin từ nhân hạt cây neem. Hạt cây neem Loại vỏ, thịt quả Sấy khô, nghiền Dịch thô Bột neem Cặn dầu Ete dầu hỏa Loại ete dầu hỏa Dịch chứa Salanin Methanol Sắc ký cột Sắc ký bản mỏng Salanin Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ khối lượng Phổ hồng ngoại Điểm nóng chảy Sắc ký cột Hình 4: Quy trình phân lập và xác định cấu trúc Salanin 1.1 Tách chiết, phân lập. Hạt neem thu được, sau khi lạo bỏ hết vỏ và phần thịt quả, được sấy khô ở 500C. 5kg nhân hạt đem đi trích ly với ete dầu hỏa (40-600C) bằng bộ chiết Soxhlet. Sau khi loại dung môi ete dầu hỏa, thu được 970g cặn dầu sệt, màu vàng nâu. Hỗn hợp dầu được tiếp tục hòa tan trong methanol(MeOH). Loại dung môi thu được 230g cặn sệt màu vàng sậm. Cặn tan trong methanol cho chạy sắc ký cột nhanh với hệ dung môi ete dầu hỏa và chloroform với độ phân cực tăng dần. Kiểm tra các phân đoạn thu được sau sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng để gom các phân đoạn có Rf giống nhau. Tiếp tục sắc ký cột lần 2 với các phân đoạn giàu Salanin thu được ở trên thu được 120mg tinh thể hình lăng trụ không màu, kí hiệu MS. 1.2 Xác định cấu trúc MS có các đặc tính sau : Điểm nóng chảy: Mp = 156oC (Hexan - Ete etilic) Phổ hồng ngoại: Vmax (cm-1): 2953, 1727, 1701, 1650, 1483, 1264, 1141, 1054. Phổ khối lượng: 619 [M + Na]+. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được đo trong dung môi CDCL3 và độ dịch chuyển hóa học được trình bày ở bảng 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều 1H-1H-COSY và HMBC được trình bày ở bảng 4, hình 5 và hình 6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HMBC cho thấy sự tương tác xa của H1 với C9-C10, đặc biệt ở vị trí H5 tương tác với các cacbon ở vị trí 19,29,10,4,1,3 và 7. Bảng 3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được đo trong dung môi CDCL3 Bảng 4: Sự tương tác chiều 1H-1H-COSY và HMBC Kết quả nhận được cho thấy : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR cho thấy các proton của vòng furan có δppm là 7,32; 6,29 và 7,26 tương ứng với vị trí H-21, H-22 và H-23, một nhóm CH3- có mũi đôi ở vị trí 4’. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều COSY cho thấy rõ sự tương tác của H1 – H2, H2 –H3, H5 – H6… Hình 5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều 1H-1H-COSY của MS Hình 6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC của MS Dựa và sự phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều và so sánh với các tài liệu đã công bố [15][27], chất được xác định chính là Salanin có cấu trúc như sau: II. Tách alkaloid từ quả quất (Citrus japonica Thumb.)[4]. Vỏ các loài cây loài Citrus như cam, chanh đã dược sử dụng từ lâu để sản xuất tinh dầu ở nhiều nước công nghiệp trên thế giới như Ý, Mỹ. Tinh dầu Citrus có mùi thơm dễ chịu, hàm lượng Limonene cao được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm. Các kết quả khoa học gần đây cho thấy Limonene còn có tác dụng tán sỏi, phá khối u… Ơ nước ta một loài cây thuộc loài Citrus, họ Rutaceae (họ Cam) khác là cây Quất, phổ biến là loại Citrus japonica Thumb. (Fortunella jabonica Swing) được trồng khắp nơi. Quả Quất được thu hái quanh năm, vỏ có thể ở dạng vỏ khô, tươi hoặc vỏ đông lạnh để tách lấy tinh dầu là một thuận lợi lớn trong nghiên cứu và trong sản xuất đại trà thu tinh dầu Citrus. Ngoài ra, qua khảo sát sơ bộ thành phần của nước quả Quất đã cô lại thành cao Quất có chứa flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, carotenoid, acid hữu cơ, đường khử. Bên cạnh quá trình tách chiết tinh dầu, việc nghiên cứu tách chiết alcaloid có dược tính cao từ nước quả Quất cũng là vấn đề khá mới mẻ góp phần tìm ra những chất có dược tính từ thiên nhiên. Hình 7: Cây quất được trồng tại Việt Nam Sau đây là quy trình tách alkaloid từ nước quả quất: Hình 8: Sơ đồ tách chiết Alkaloid từ nước quất. 2.1.Phương pháp nghiên cứu và tách chiết alkaloid trong nước quả Quất: -Phương pháp tách chiết: chiết tận trích với dung môi CHCl3 trong môi trường kiềm. -Phương pháp xác định hợp chất: phương pháp phân tích sơ bộ hóa thực vật. -Phương pháp nhận danh alkaloid: đo điểm chảy, phương pháp tạo tủa và màu với các thuốc thử đặc trưng, sắc ký lớp mỏng (SKLM), xác định phổ UV trên máy UV- Vis Spectrophotometer Jenway 6505. 2.2 Quy trình: Nước quả Quất đem cô đặc trong chân không thảnh cao Quất, trích ly với ete dầu hỏa để loại tạp. Kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH 25% đến pH = 9 trong 60 phút. Chiết hồi lưu bằng dung dịch chloroform khoảng 3 giờ. Nhiệt độ chiết khoảng 50 –60oC. Dịch chiết được cô còn khoảng 1/3 thể tích, sau đó acid hóa bằng H2SO4 2%. Dịch acid được kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10% đến pH=10. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất. Đem sấy khô ở 50- 600, được tủa alkaloid A dạng tinh thể trắng, khá sạch (1,49% tính trên khối lượng cao Quất). Dịch kiềm được đem chiết với CHCl3, rửa loại kiềm bằng nước cất. Cô thu hồi CHCl3, kết tinh alkaloid thô trong cồn 900. Lọc và sấy khô được alkaloid B. 2.3 Khảo sát thành phần hóa học trong nước quả Quất và tách chiết alcaloid * Phân tích các thành phần hóa học có trong cao của dịch quả Quất: Dịch nước quả Quất sau khi lọc để loại bỏ hột, chất nhày, tạp rồi được hòa tan bằng cồn 900, đem cô chân không ở 600, 3 giờ được cao Quất với hàm lượng là tính trên nước quả sử dụng. Phân tích sơ bộ hóa thực vật kết quả cho thấy trong cao quả Quất chứa flavonoid, alkcaloid, phytosterol, steroid, acid hữu cơ, đường khử, carotenoid, saponin. * Các thông số ảnh hưởng đến quá trình tách chiết alkaloid Với dung môi chloroform ở tỷ lệ mcao/Vdm = 1:3 đạt hiệu quả trích ly cao nhất. -Thời gian chiết hồi lưu tối ưu là 3 giờ Khi chiết bằng dung dịch CHCl3 xảy ra chủ yếu 2 quá trình: +Quá trình thẩm thấu dung môi vào cao đã kiềm hóa. +Quá trình các hợp chất có trong cao khuếch tán vào dịch chiết. Dưới tác động của dung dịch NH4OH25%, alkaloid dạng muối trong cao chuyển thành dạng base hòa tan được trong chloroform. * Nhận danh alkaloid Alkaloid A Lựa chọn bước sóng l = 285 nm để đo A (trong chi Citrus có nhiều alkaloid thuộc cấu trúc benzylisoquinolin, isoquinolin chủ yếu có lmax = 250-350 nm). a) Đo điểm chảy: mẫu, mp = 157-1590C. Theo tài liệu (Merck Index I), điểm chảy Codein = 154 –157oC. b) Định tính bằng phương pháp hiện màu, phương pháp tủa: -Thuốc thử Dragerdroff sẽ xuất hiện tủa màu cam hay đỏ cam. -1ml H2SO4 đđ và 0,05 ml dung dịch FeCl3 13% xuất hiện màu xanh lam, thêm 0,05 ml HNO3 màu sẽ chuyển sang đỏ. c) Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng silicagel Merck 60 F254. Hệ dung môi khai triển: chloroform- methanol- amoniac (20:4:1) - Chất chuẩn: lấy 2 viên thuốc Neo-Cordion (trị ho) chứa Codein, nghiền nhỏ, hòa 1ml dung dịch CHCl3, chấm ở vị trí 1. - Mẫu: lấy mẫu thử khoảng 10 mg, hòa vào 0,5 ml CHCl3 chấm ở vị trí 2. - Hiện vết : hơi iod cho vết màu nâu; bằng thuốc thử Dragendorff cho vết màu vàng cam. +Chất chuẩn: cho 1 vết có Rf1=0,736. +Mẫu: cho 1 vết có Rf2=0,736 (trùng với chuẩn). Alkaloid B a) Nhận diện alkaloid bằng các phản ứng tủa: Thuốc thử Mayer cho tủa trắng; thuốc thử Dragendorff xuất hiện tủa vàng cam; thuốc thử Bouchardat cho tủa nâu. b) Nhận diện alkaloid bằng phổ hồng ngoại IR: Phổ hồng ngoại có những mũi đặc trưng: 3625, 2900, 1451, 1365, 715, 412 cm-1 c) Nhận diện alkaloid bằng sắc ký lớp mỏng: Hệ dung môi khai triển: chloroform-methanol-amoniac (20:4:1). + Chất mẫu: lấy mẫu thử khoảng 10 mg, hòa vào 0,5 ml CHCl3. + Hiện vết : hơi iod cho vết màu nâu có Rf2 =0,824. Kết luận: Alkaloid thu được từ nước quả Quất gồm alkaloid A và alkaloid B với hiệu suất là 6,68% (so với lượng cao khô). Bước đầu nhận danh alkaloid A là Codein. Alkaloid B thì chỉ định tính sơ bộ, cần được nhận danh chính xác và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS, NMR. III. Tách chiết và tinh sạch các alkaloid từ thảo mộc Trung Quốc [28]. Hình 9: Hình ảnh cây và hạt Wu-zhu-yu Wu-zhu-yu, một loại trái cây nổi tiếng của Trung Quốc và chính thức được liệt kê trong Dược điển Trung Quốc [9], và đã được sử dụng trong một thời gian dài trong việc điều trị bệnh ở Trung Quốc. Wu-zhu yu-được sử dụng như một phương thuốc cho chứng rối loạn tiêu hóa (đau bụng, kiết