Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện thuỷ phân bột ngô tới cơ cấu thành phần dịch thuỷ phân có sử dụng chế phẩm enzym

hóm này là enzym ngoại mạch (exoenzym) hay enzym đường hoá. Sản phẩm tạo thành sau thuỷ phân chủ yếu là glucoza. - amylaza có khả năng thuỷ phân liên kết -1,6–glucozit nhưng với hoạt lực yếu. Vì thế, dextrin tạo thành sau thuỷ phân sâu sắc cấu tử amilopectin có phân tử lượng nhỏ hơn nhiều so với - dextrin. Quá trình thuỷ phân của - amylaza là một quá trình đơn giai đoạn. Suốt trong quá trình thuỷ phân, độ ngọt của dịch thuỷ phân tăng đều đặn nhưng độ nhớt giảm chậm. Các chế phẩm - amylaza bán trên thị trường chủ yếu được sản xuất từ nấm mốc: AMG, Sansuper. Do đó, khả năng chịu nhiệt kém, chịu được axit. I.3.2.3. Vai trò của enzym và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân tinh bột Vai trò của enzym trong quá trình thuỷ phân tinh bột Thuỷ phân tinh bột tạo ra đường, từ đường có thể tạo ra những sản phẩm khác nhau là cơ sở chính để sử dụng tinh bột trong công nghiệp. Sự phân cắt tinh bột bởi enzym thường đặc hiệu hơn, có thể tạo ra được những sản phẩm rất đặc thù, không thể thu được bằng phương pháp axit, phản ứng nhanh hơn, công nghệ đơn giản hơn và ít gò bó hơn. Tinh bột của các loại ngũ cốc có màng tế bào bảo vệ nên enzym amylaza không thể tác dụng trực tiếp được. Khi nghiền nguyên liệu chỉ một phần rất ít màng tế bào bị phá vỡ, phần lớn màng tế bào còn lại sẽ ngăn cản sự tiếp xúc của enzym amylaza với tinh bột. Mặt khác, tinh bột sống ở trạng thái không hoà tan, amylaza tác dụng lên tinh bột rất chậm và kém hiệu quả. Vì vậy, mục đích của quá trình dịch hoá là phá vỡ tinh bột và biến tinh bột thành trạng thái hoà tan. Dịch hoá xong, tinh bột trong dịch đã chuyển sang trạng thái hoà tan nhưng chưa thể lên men trực tiếp được mà phải trải qua quá trình thuỷ phân do tác dụng của amylaza để biến thành đường. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân tinh bột Như đã biết, tốc độ thuỷ phân tinh bột phụ thuộc vào sự tạo thành liên kết “enzym- tinh bột”. Sự tạo thành liên kết này là do hấp thụ lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tinh bột và enzym như: -COOH, -CHO, -OH, -CO, -NH2, -SH. Các nhóm này khi tác dụng lẫn nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử amyloza và amylopectin, cuối cùng dẫn đến làm đứt các nối glucozit để tạo ra các sản phẩm và giải phóng enzym. Enzym được giải phóng lại tiếp tục tạo liên kết mới và thực hiện nhiều chu trình tiếp theo. Mỗi enzym chỉ có thể hoạt động tốt khi ở trạng thái nhất định. Trạng thái này phụ thuộc vào : nhiệt độ, pH và sản phẩm của môi trường phản ứng. ảnh hưởng của nhiệt độ Tốc độ phản ứng enzym cũng như các phản ứng hoá học khác đều tăng, giảm theo nhiệt độ. Tuy nhiên vì enzym có bản chất protein nên khi tăng nhiệt độ đến một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzym sẽ bị giảm do sự biến tính của protein-enzym. Trong khoảng nhiệt độ mà enzym chưa bị biến tính thì hệ số truyền nhiệt của đa số enzym vào khoảng 1,4-2 nghĩa là khi tăng nhiệt độ lên 100C thì vận tốc phản ứng tăng lên 1,4-2 lần. Khi bắt đầu có sự biến tính protein thì xảy ra hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự tăng nhiệt độ, mặt khác tốc độ biến tính protein cũng nhanh hơn. Kết qủa là vận tốc phản ứng giảm dần đến đình chỉ hoàn toàn. Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản ứng đạt cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu hay tối thích. Nhiệt độ mà tại đó enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn. Nhiệt độ tối ưu lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Trước hết, nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào nguồn gốc hệ amylaza. Ví dụ: - amylaza của vi khuẩn chịu nhiệt có nhiệt độ tối ưu cao và đạt 95-1050C; nhưng - amylaza của thóc mầm có nhiệt độ tối ưu chỉ 73-760C còn - amylaza của A.oryzae lại có nhiệt độ tối ưu 50-550C. Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào nồng độ cơ chất trong dung dịch. Ví dụ, với dung dịch 1% tinh bột, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của amylaza A. oryzae là 500C. Trong dung dịch 5% tinh bột nhiệt độ tối ưu của A. oryzae là 550C. Khi tăng nồng độ tinh bột đến 10% thì nhiệt độ tối ưu của amylaza A. oryzae vẫn chỉ là 550C. Như vậy hoạt độ của enzym sẽ được bảo vệ khi tăng nồng độ cơ chất trong dung dịch nhưng chỉ trong giới hạn nhiệt độ xác định đối với mỗi enzym. Nhiệt độ tối ưu còn phụ thuộc vào thời gian tác dụng. Thời gian tác dụng lâu sẽ làm giảm khả năng chịu nhiệt của enzym. Nhiệt độ tối ưu cũng phụ thuộc vào pH của môi trường phản ứng và tăng cùng với pH trong giới hạn nhất định. ảnh hưởng của pH Tất cả các protit đều lưỡng tính. Tính chất này phụ thuộc vào pH của môi trường. Các nhóm axit hoặc kiềm của enzym đều có khả năng ion hoá. Khi thay đổi pH của môi trường sẽ xảy ra liên kết với H+ hoặc OH-. Do đó, mức độ ion hoá của nhóm này hoặc nhóm khác trong phân tử enzym sẽ bị giảm. Nếu nhóm đó đóng vai trò trung tâm hoạt động của enzym thì sự tạo thành liên kết giữa enzym-cơ chất sẽ bị ức chế và do đó ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân. pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng enzym, mỗi một enzym chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối ưu của enzym. ảnh hưởng của nồng độ enzym Sự thuỷ phân tinh bột là tổng các tác dụng của một số enzym chứa trong thóc mầm, nấm mốc hoặc vi khuẩn. Mỗi hệ amylaza đều có số lượng và hoạt độ khác nhau của từng enzym. Khi tăng hoạt độ enzym thì tốc độ thuỷ phân tinh bột sẽ tăng và tỉ lệ với lượng enzym đưa vào nhưng chỉ trong giai đoạn đầu khi bậc phản ứng bằng 0. Tuỳ theo chất lượng của chế phẩm enzym amylaza, tỉ lệ này có thể khác nhau và dao động trong giới hạn khá lớn. Tỉ lệ này cũng không cố định mà giảm dần theo trình độ công nghệ đạt được trong sản xuất chế phẩm amylaza. I.3.2.4. Các loại dextrin Như vậy là dưới tác dụng của nhóm enzym amylaza, hai cấu tử của tinh bột là amyloza và amylopectin bị phân cắt thành nhiều loại sản phẩm: maltoza, dextrin bậc cao, dextrin bậc thấp (maltotrioza,maltotetraoza, maltopentaoza, maltohexaoza và maltoheptaoza), saccharoza, glucoza và fructoza. Tỉ lệ giữa các cấu tử này luôn luôn thay đổi, nó phụ thuộc vào loại nguyên liệu, chất lượng của nguyên liệu, chế độ thuỷ phân. Dextrin là hợp phần quan trọng của sản phẩm thuỷ phân tinh bột. Phụ thuộc vào số gốc glucozid hợp thành, các loại dextrin có những tính chất rất khác nhau, và do đó chúng cũng có vai trò và ý nghĩa khác nhau. Phân biệt bốn loại dextrin: maltodextrin, acrodextrin, eritodextrin, amylodextrin. Amylodextrin Amylodextrin có cấu tạo phân tử và tính chất gần giống như tinh bột hoà tan. Phân tử của chúng bao gồm 60-120 gốc glucozid, phân tử lượng khoảng 10.000 tới 20.000. Hoà tan trong nước nóng, không hoà tan trong nước lạnh. Hoà tan trong 25% và kết tủa trong 40% dung dịch etanol. Quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc + 1900 đến + 1960. Có tính khử không đáng kể, chiếm khoảng 0,2 tới 0,6% so với maltoza. Với dung dịch của iod, chúng chuyển thành màu xanh-tím. Sự thuỷ phân tinh bột đến amylodextrin là quá trình phản ứng không hoàn toàn và là một thiếu sót đáng kể của tự nhiên. Do tính kém bền vững chúng dễ bị kết tủa và thải ra ngoài theo bã, làm giảm hiệu suất thu hồi chất chiết. eritodextrin Eritodextrin có phân tử lượng bé hơn, khoảng 6200-7000. Phân tử của chúng bao gồm 40-45 gốc glucozid. Hoà tan trong nước nóng và nước lạnh để tạo thành dung dịch không bền vững (khi thay đổi điều kiện, chúng dễ chuyển thành trạng thái không hoà tan). Tan trong 55% và kết tủa trong 65% dung dịch etanol. Quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc + 1940. Khả năng khử của chúng tương đối yếu, bằng 1,0-3,0% so với maltoza. Với iod tạo thành màu cà phê đỏ. Sự tạo thành eritodextrin là một thiếu sót của quá trình thuỷ phân bởi vì tính bền vững của chúng kém-rất dễ gây ra sự vẩn đục cho sản phẩm. Acrodextrin Acrodextrin có phân tử lượng khoảng 3700. Phân tử của chúng bao gồm 20 gốc glucozid. Hoà tan trong 70% etanol. Hoà tan trong nước nóng và nước lạnh để tạo thành dung dịch bền vững. Trong dung dịch etanol ở nhiệt độ cao, nếu ta tăng nồng độ của dextrin này, sẽ tạo ra tinh thể hình cầu. Quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc + 1920. Khả năng khử tương đối cao, bằng 10-12% so với maltoza. Không làm biến đổi màu của iod. Nấm men không hấp thụ được loại dextrin này. Trong sản phẩm cần chứa một lượng nhất định để làm tăng thêm độ đậm đà. Maltodextrin Maltodextrin có cấu tạo phân tử và tính chất gần giống với đường maltoza. Là tập hợp các dextrin có phân tử bao gồm 3-7 gốc glucozid. Hoà tan dễ dàng trong nước nóng và nước lạnh để tạo thành dung dịch bền vững. Hoà tan trong dung dịch 88% etanol. Quay mặt phẳng ánh sáng phân cực một góc + 1790 đến + 1830. Có tính khử khá mạnh, bằng 36-43% so với maltoza. Không làm thay đổi màu của iod. Nấm men có thể hấp thụ một số một số trong nhóm dextrin này nhưng tốc độ lên men rất chậm so với maltoza. I.3.2.5. Một số chế phẩm enzym thương mại Chế phẩm Termamyl SC Termamyl SC là một enzym - amylaza, Termamyl là chế phẩm lỏng, chịu được nhiệt độ cao. Termamyl là một endo- amylaza, có tác dụng thuỷ phân mối nối -1,4 glucozit thành amyloza và amylopectin. Với cơ chất tinh bột, dưới tác dụng của Termamyl sẽ nhanh chóng tạo thành dextrin và oligosaccharit tan trong nước. Enzym Termamyl dễ dàng tan trong nước ở mọi nồng độ trong điều kiện thường dùng. Độ vẩn đục có thể xảy ra trong chế phẩm enzym nhưng không ảnh hưởng tới hoạt tính chung hoặc tính năng của sản phẩm. Termamyl được dùng để dịch hoá tinh bột thành dextrin theo phương pháp enzym. Cầu nối - 1,4 của phân tử tinh bột bị thuỷ giải một cách rải rác, đưa đến kết quả làm giảm độ nhớt của dịch bột và gia tăng lượng đường DE. Các điều kiện công nghệ tối ưu: Nồng độ tinh bột: 30-40% độ khô (DS). pH: 6,0 – 6,5. Nhiệt độ: 95 – 105oC. Lượng enzym sử dụng: 0,5 kg Termamyl/1tấn tinh bột khô. Độ đường đạt được: 8 – 12. Chế phẩm AMG 240L của hãng Novo - Đan Mạch AMG- Amylogucosidase Novo- là một chất exo-D-glucosidase-1,4- (gluco- amylaza) được sản xuất từ một chủng loại vi sinh vật chọn lọc tên là Aspergillus niger bằng sự lên men chìm. Tên theo hệ thống là 1,4--D- glucan glucohydrolase. Enzym này thuỷ phân các cầu nối -1,4 và -1,6 trong tinh bột. Trong khi thuỷ phân, các đơn vị glucoza bị tách rời theo thứ tự từ đầu không khử của phân tử cơ chất. Mức độ thuỷ phân tuỳ thuộc vào loại mối nối cũng như chiều dài chuỗi các mối nối; -1,4 dễ dàng bị thuỷ phân hơn các mối nối -1,6 trong khi đó maltotrioza và đặc biệt maltoza bị thuỷ phân ở mức độ thấp hơn là các phân tử lớn của oligosaccharit. Tất cả sản phẩm AMG đều không nhiễm hoạt tính transglucosidaza bằng cách chuyển các phân tử của glucoza từ vị trí -1,4 qua -1,6 (có thể tạo thành panose và isomaltose). Các sản phẩm lỏng (L) là những chế phẩm màu nâu trong, có tỷ trọng 1,2g/ml. Điều kiện công nghệ tối ưu của AMG: Nồng độ tinh bột: 30-40% độ khô (DS). pH: 4,5. Nhiệt độ: 55 - 60oC. Lượng enzym sử dụng: 1,5 kg Termamyl/1tấn cơ chất. Độ đường đạt được: 97 – 98%. I.3.3. Hệ enzym proteaza Enzym thuộc hệ này xúc tác chuyển hoá các peptit và protein theo cơ chế thuỷ phân các liên kết peptit. I.3.3.1. Cơ chế xúc tác của enzym proteaza Cho dù là trung tâm hoạt động của enzym proteaza có cấu tạo khác nhau thế nào đi chăng nữa thì enzym xúc tác thuỷ phân protein luôn luôn theo một cơ chế chung như sau: S + E ES P1 + EP2 E + P2 Trong đó : P1: là đoạn mạch peptit có chứa nhóm amin vừa được giải phóng (-NH2). P2: là đoạn mạch peptit có chứa nhóm cacboxyl vừa được giải phóng (-COOH). I.3.3.2. Phân loại Proteaza Trong công nghiệp thực phẩm, người ta phân loại theo 2 cách: Dựa theo cơ chế xúc tác, nhóm chức quyết định quá trình xúc tác của trung tâm hoạt động enzym và vùng pH hoạt động thích hợp, người ta phân nó thành 4 nhóm Nhóm enzym Trung tâm hoạt động pH hoạt động Proteaza – serin Axit amin serin Kiềm Proteaza – tiol -SH 7 – 7,5 Proteaza – kim loại M2+ Trung tính Proteaza – axit - COOH Axit * Một số đặc tính: Trong 4 nhóm trên thì nhóm proteaza – serin có độ bền hoạt lực lớn hơn cả. Dải pH hoạt động của nó tương đối rộng, thường kéo từ pH = 5-12 và nhiệt độ hoạt động của nó là dưới 500C. Còn proteaza – tiol có độ bền hoạt lực trung bình. Nhưng mà tính đặc hiệu xúc tác của nó rất chặt chẽ bởi vì các hình thể không gian của trung tâm hoạt động enzym được giữ bởi cầu disunfit (khó phá vỡ) chứ không phải các lực liên kết khác. Proteaza – axit thường trung tâm hoạt động của nó là axit aspactic. Dạng chế phẩm enzym proteaza này để sản xuất pho mat trong công đoạn đông tụ sữa. Proteaza- kim loại có độ bền hoạt lực thấp nhất. Thường là proteaza– kim loại của vi sinh vật thì mất hoạt lực ngay từ khi tách chiết môi trường mà trên thị trường chúng ta chỉ gặp được những chế phẩm proteaza – kim loại từ thực vật. Kim loại ở đây thường là các cation Zn2+. Phân loại theo tính đặc hiệu xúc tác Có 4 nhóm: Nhóm aminopeptidaza: Enzym thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân các liên kết peptit ở đầu chuỗi mạch có chứa nguyên tử nitơ và tách tuần tự từng axit amin một ra khỏi chuỗi mạch. Nhóm cacboxypeptidaza: Các enzym thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân các liên kết ở đầu có chứa nhóm cacboxy ở chuỗi mạch và tách tuần tự từng axit amin một ra khỏi chuỗi mạch. Nhóm dipeptidaza: Enzym thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân các liên kết dipeptit thành các axit amin. Nhóm peptidin peptithydrolaza: Enzym thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân các liên kết peptit nội mạch của chuỗi mạch polipeptit thành các đoạn peptit. I.3.3.3. Vai trò của enzym và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân Vai trò của enzym trong quá trình thuỷ phân protein Nói đến cơ cấu sản phẩm thuỷ phân protein tức là nói đến tỷ lệ về khối lượng giữa các pha sản phẩm: thấp phân tử, phân tử lượng trung bình và cao phân tử. Mỗi một loại sản phẩm cụ thể yêu cầu tỷ số này phải nằm trong một phạm vi xác định. Tác nhân để tạo ra tỷ số này là hệ enzym. Các yếu tố ảnh hưởng đến cơ cấu sản phẩm thuỷ phân protein Các yếu tố gây ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzym cũng chính là những yếu tố ảnh hưởng đến cơ cấu sản phẩm, đó là nhiệt độ, pH của môi trường và thời gian tác dụng. Khi tăng độ chua đến pH=5,0 thì hàm lượng các hợp chất hoà tan bền vững chứa nitơ bao gồm các axit amin, peptid, pepton (pha đạm amin) cùng albumoza (pha kết tủa với MgSO4) cũng tăng. ở một pH xác định, việc tăng nhiệt độ đến 600C sẽ dẫn đến sự gia tăng các sản phẩm hoà tan chứa nitơ, kết tủa với MgSO4. Hàm lượng đạm amin tạo thành nhiều nhất ở nhiệt độ 500C. I.3.3.4. Chế phẩm proteaza thương mại: Neutrase Neutrase Novo là enzym proteaza được sản xuất từ vi khuẩn Bacillius subtilis. Neutrase dạng lỏng có kí hiệu là Neutrase 0,5L. Neutrase 0,5L là chất lỏng màu nâu, có tỉ trọng là 1,25 g/ml. Neutrase chỉ chứa proteaza dạng trung tính của Bacillius subtilis, trong khi đó hầu hết các chế phẩm thương mại khác còn chứa cả proteaza kiềm. Neutrase là một proteaza kim loại, chứa Zn trong cấu trúc của nó. Enzym này được ổn định bởi Ca2+, bị ức chế bởi EDTA. Chế phẩm này hoạt động thích hợp ở: pH: 5,5 – 7,5. Nhiệt độ: 45 - 55oC. Phần II: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu II.1. Nguyên liệu II.1.1. Bột ngô Ngô hạt được mua ngoài chợ và có nguồn gốc từ Gia Lâm. ở đây, chúng tôi chọn loại ngô răng ngựa. Hạt ngô đem nghiền sẽ thu được bột ngô sử dụng trong nghiên cứu. Để đánh giá chất lượng của bột ngô, chúng tôi tiến hành xác định một số chỉ tiêu. Kết quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 2.1. Thành phần của bột ngô Thành phần Độ ẩm Tinh bột Protein Bột ngô vàng 11,18% 68,65% 3,47% Theo nhiều tài liệu, nhiệt độ hồ hoá của tinh bột ngô là 65-750C. Chính vì thế, chúng tôi sẽ khảo sát dịch hoá ở nhiệt độ xung quanh nhiệt độ hồ hoá này. II.1.2. enzym II.1.2.1. Enzym dùng để thuỷ phân tinh bột Enzym dịch hoá: Termamyl SC- Novo- Đan Mạch. Enzym đường hoá: AMG- Novo- Đan Mạch. II.1.2.2. Enzym dùng để thuỷ phân protein Neutrase- Novo- Đan Mạch. II.2. Phương pháp phân tích: II.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy: II.2.1.1. Nguyên tắc: Tách ẩm ra khỏi nguyên liệu bằng cách sấy ở nhiệt độ 100-1050C đến trọng lượng không đổi (3-4 giờ). II.2.1.2. Tiến hành: Cân khoảng 5 gam bột ngô đã nghiền nhỏ trong hộp nhôm đã biết trước trọng lượng. Mở nắp hộp và đặt hộp nhôm vào tủ sấy có nhiệt độ 1050C, sau 3 giờ sấy đậy nắp và đem làm nguội trong bình hút ẩm. Sau đó đem cân lại, ghi số cân rồi đặt lại hộp nhôm vào tủ sấy, sấy tiếp 30-60 phút. Sau đó đem làm nguội và cân lại lần 2. Nếu sai số giữa hai lần không quá 0,001 gam thì xem như quá trình tách nước kết thúc. II.2.1.3. Kết quả: Độ ẩm của nguyên liệu (%) được tính theo công thức: W= Trong đó: : trọng lượng của hộp nhôm và bột ngô trước khi sấy. : trọng lượng của hộp nhôm và bột ngô sau khi sấy. : trọng lượng của hộp nhôm trước khi sấy. II.2.2. Xác định nồng độ chất khô bằng chiết quang kế: II.2.2.1. Nguyên tắc: Dựa vào chiết suất để suy ra nồng độ dung dịch, khi nồng độ dung dịch tăng chiết suất tăng. II.2.2.2. Tiến hành: Xác định chất khô bằng chiết quang kế cầm tay rất đơn giản: cho 1 giọt dung dịch vào lăng kính, đậy lại rồi nhìn vào ống nhìn và hướng ra phía ánh sáng rồi đọc kết quả. * Chú ý: Trước và sau khi đo chiết suất phải dùng bông tẩm rượu hoặc ete lau lăng kính đựng dung dịch thật sạch. Thường xuyên kiểm tra điểm “0” của chiết quang kế bằng cách lấy 2-3 giọt nước cất cho vào máy đo và thước đo sẽ chỉ nồng độ=0. Nếu thấy sai số phải dùng khoá điều chỉnh. Chiết quang kế chỉ cho ta nồng độ chất khô hoà tan mà thôi. II.2.3. Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kendal (Kjeldahl): Lượng nitơ (azot) tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được xác định bằng phương pháp Kendal. Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu. II.2.3.1. Nguyên tắc: Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị ôxi hoá. Cacbon và hidrô tạo thành CO2 và H2O còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: R- CH- COOH NH2 + H2SO4 NH3 + SO2 + H2O 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu nó bằng một lượng dư axit boric H3BO3: (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 chuẩn, qua đó dễ dàng tính được lượng nitơ có trong mẫu vật. (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 4H3BO3 II.2.3.2. Hoá chất cần dùng: H2SO4 đậm đặc NaOH 30 – 40% K2SO4 tinh thể CuSO4 tinh thể Dung dịch H3BO3 3% Chỉ thị Taxiro: hỗn hợp (2:1) của hai dung dịch metyl đỏ 0,1% trong rượu và metylen xanh 0,1% trong rượu etylic. Dung dịch H2SO4 0,1N H2O2 30%. II.2.3.3. Tiến hành: Chuẩn bị và phá mẫu: Lấy một lượng chính xác mẫu cần phân tích, chuyển vào bình Kendal, thêm vào đó 10ml H2SO4 đậm đặc và 0,5 gam hỗn hợp xúc tác. Sau đó, đậy bình bằng phễu thuỷ tinh và tiến hành phá mẫu trên thiết bị (theo chương trình định sẵn). Quá trình phá mẫu kết thúc khi dung dịch trong bình màu xanh hoàn toàn trong suốt, để nguội. Tráng sạch phễu và cổ bình bằng 10-15ml nước cất. Chưng cất thu NH3: Đặt bình Kendal và đúng vị trí trong bộ cất đạm. Hút 10ml dung dịch H3BO3 3% cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào đó vài giọt chỉ thị Taxiro và đặt vào đúng vị trí hứng dịch chưng cất trong bộ cất đạm. Kiểm tra cẩn thận đường cấp nước cất, NaOH 40% và đường nước làm lạnh. Tiến hành cất đạm theo chương trình đã cài sẵn. Quá trình cất kết thúc khi xuất hiện mầu nâu trong bình Kendal. Chuẩn độ tetraborat amôn: Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. II.2.3.4. Tính kết quả: X = Trong đó: X – Hàm lượng nitơ tổng số (% hay g/l). – Lượng H2SO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm. – Lượng mẫu vật đem vô cơ hoá (gam hay ml). – Số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N. – Hệ số chuyển thành %. II.2.4. Xác định đường khử bằng phương pháp Axit Dinitro Salicylic (DNS): II.2.4.1. Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên cứu với thuốc thử DNS, dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh khiết với thuốc thử này, ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường khử của mẫu vật nghiên cứu. II.2.4.2. Hoá chất và thiết bị: Thuốc thử DNS: Hỗn hợp: Nước cất 1416 ml 3,5 axit Dinitrosalicylic 10,6 g NaOH 19,8 g. Hoà tan trước ba chất trên sau thêm: Muối K-Na tactrat kép 306 g Phenol (nóng chảy ở 500C) 7,6 ml Natri metabi sulfit (Na2S2O5) 8,3 g. Chuẩn 3ml thuốc thử bằng HCl 0,1N với chỉ thị phenolphtalein hết 5-6 ml là được. Thêm NaOH nếu cần. Máy so màu quang điện. II.2.4.3. Cách tiến hành: Xây dựng đồ thị đường chuẩn glucoza: Dải glucoza pha trong khoảng 0,2-0,5 mg glucoza trong 1 ml. Tiến hành: Lấy 1- 2ml mẫu vào một ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi mẫu đúng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0,2- 0,8. Đường chuẩn glucoza cũng được tiến hành và pha loãng như mẫu thí nghiệm. Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với mẫu trắng là nước cất. Vẽ đường chuẩn glucoza với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucoza. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0,04mg glucoza do bị ôxi hoá. Đối với những mẫu có nồng độ đường khử thấp, thêm 0,1mg glucoza vào mỗi mẫu. Cứ 3ml thuốc thử DNS này sẽ phản ứng hết với khoảng 10mg glucoza. Do vậy những dung dịch đường đậm đặc phải được pha loãng sao cho mẫu đem phân tích chỉ chứa 5mg đường khử hoặc ít hơn. II.2.4.4. Kết quả: Từ mật độ quang đo được, ta nội suy để thu được hàm lượng đường khử đã pha loãng. HLĐK = (g/100ml). Trong đó: HLĐK: hàm lượng đường khử của mẫu phân tích chưa pha loãng (g/100 ml). : hàm lượng đường khử của mẫu phân tích đã pha loãng (g/l). : hệ số ph loãng. : hệ số quy đổi ra đơn vị g/100 ml II.2.5. Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp hoá học: II.2.5.1. Nguyên tắc: Thuỷ phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 2% ở điều kiện đun sôi trong bình cách thuỷ trong thời gian 2 giờ. Dịch đã thuỷ phân được làm nguội và trung hoà bằng NaOH với chỉ thị methyl da cam. Hàm lượng đường trong dung dịch được xác định theo phương pháp DNS. II.2.5.2. Hoá chất: axit clohydric đặc. Hydroxyt natri dung dịch 10%. Metyl da cam. II.2.5.3. Tiến hành: Cân khoảng 2 gam bột ngô trên cân phân tích, sau đó chuyển toàn bộ vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 250 ml. Tiếp theo cho thêm 100 ml HCl 2% (100 ml nước cất cộng 6 ml HCl 35%), đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí. Lắc nhẹ rồi đặt nồi vào đun cách thuỷ, đun tới sôi và cho sôi khoảng 2 giờ. Mức nước ở nồi cách thuỷ phải luôn cao hơn mức nước trong bình thuỷ phân. Muốn vậy phải chuẩn bị nước sôi để bổ sung vào. Sau 2 giờ thuỷ phân, toàn bộ lượng tinh bột đã chuyển hoá thành glucoza, làm nguội đến đến nhiệt độ phòng rồi thêm vào 4-5 giọt methyl da cam, dùng NaOH 10% trung hoà axit tới đổi màu. Chú ý chỉ trung hoà khi đã làm nguội đến nhiệt độ 300C, vì ở nhiệt độ cao và kiềm cục bộ thì glucoza sẽ bị phân huỷ, và dẫn đến kém chính xác. Trung hoà xong ta chuyển toàn bộ dung dịch vào bình dịnh mức 250 ml, tráng bình rồi thêm nước cất tới ngấn bình và đem lọc. Dịch đường thu được xác định theo phương pháp DNS. II.2.5.5. Kết quả: Hàm lượng tinh bột trong bột ngô được tính theo công thức sau: TB = [đường khử] x 0,9 Trong đó: TB: hàm lượng tinh bột [đường khử]: hàm lượng đường khử. II.2.6. Xác định hàm lượng dextrin bằng phương pháp kết tủa với cồn: II.2.6.1. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào tính chất dextrin có khả năng kết tủa trong cồn với các nồng độ khác nhau. Toàn bộ amylodextrin và eritodextrin kết tủa trong dung dịch 50% etanol. II.2.6.2. Cách tiến hành: Ta tiến hành kết tủa dextrin trong dung dịch 50% etanol. Dựa vào nguyên tắc đường chéo tính được tỉ lệ dung dịch cồn 96%/ dịch thuỷ phân. Hút 4,6 ml dịch thuỷ phân sau khi lọc vào ống falcol đã biết trước trọng lượng, thêm vào đó 5 ml cồn 96% rồi lắc đều. Để yên 30 phút cho kết tủa trắng lắng xuống. Sau đó đem li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Li tâm xong, ta đổ dịch đi và đem sấy kết tủa cùng với ống falcol ở 650C đến khối lượng không đổi. II.2.6.3. Kết quả: Hàm lượng dextrin được tính theo công thức: X= Trong đó: X: hàm lượng dextrin trong dịch thuỷ phân (g/100 ml) : khối lượng của ống falcol và kết tủa sau khi sấy (g) : khối lượng của ống falcol trước khi sấy (g). : thể tích dịch thuỷ phân đem kết tủa (ml). II.2.7. Xác định đạm amin tự do bằng phương pháp - amino nitrogen: II.2.7.1. Nguyên tắc: Mẫu đã pha loãng được đun nóng với Ninhydrin tại pH=6,7 và sản phẩm màu thu được đo độ hấp thụ tại bước sóng 570nm. Ninhydrin là một tác nhân ôxi hoá và dẫn đến sự decacboxy hoá bởi oxi của các - aminoaxit, sản phẩm là CO2, NH3 và một loạt các aminoaxit. Sau đó, Ninhydrin đã bị khử sẽ phản ứng với Ninhydrin chưa bị khử và giải phóng ra amoniac, tạo thà