Đề tài Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm axit amin và enzym từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy mô bán công nghiệp

ng 27. Ảnh hưởng của nồng độ threonin lên sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng homoserin Lượng L-lysin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ threonin bổ sung trong môi trường lên men (mg/ml) Đột biến thể CM24 Đột biến thể CM25 0,1 12,0 2,2 0,2 13,0 4,2 0,3 15,5 6,5 0,4 18,8 12,2 0,5 27,5 22,0 0,6 28,6 24,0 0,7 30,0 26,0 0,8 30,7 28,0 0,9 30,2 27,0 1,0 29,3 27,0 1,1 14,5 6,5 1,2 5,5 3,7 Kết quả bảng 27 cho thấy nồng độ threonin thích hợp để sinh tổng hợp L-lysin tối đa là trong khoảng từ 0,5mg/ml đến 1,0mg/ml. Khi nồng độ threonin vượt quá 1,0 114 mg/ml, lượng L-lysin tạo ra giảm rất nhanh. Hiện tượng này là do threonin còn dư trong môi trường lên men sẽ kết hợp với L-lysin để ức chế ngược trở lại enzym aspastokinase. 2.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ L-methionin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng homoserin Bảng 28. Ảnh hưởng của L-methionin đến sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng homoserin Lượng L-lysin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ L-methionin bổ sung trong môi trường lên men (mg/ml) Đột biến thể CM24 Đột biến thể CM25 0,10 3,0 2,5 0,15 8,0 6,8 0,20 19,5 18,6 0,25 19,8 19,0 0,30 19,4 18,9 0,35 18,0 17,5 0,40 17,5 17,5 Kết quả bảng 28 cho thấy nồng độ L-methionin thích hợp để lượng L-lysin tích lũy tối đa là trong khoảng từ 0,2 ml/ml đến 0,3 mg/ml. Ở nồng độ L-methionin thấp, sự phát triển của các đột biến thể yếu kéo theo lượng L-lysin tạo ra sẽ giảm. Khi nồng độ L- methionin vượt quá 0,3 mg/ml chúng tôi không thấy có sự ức chế trong quá trình tổng hợp L-lysin. 2.1.2.4. Sự sinh tổng hợp L-lysin ở các đột biến thể dị dưỡng với axit amin threonin, homoserin Các đột biến thể của mỗi nhóm đột biến dị dưỡng với homoserin và threonin trên được xác định khả năng sinh tổng hợp L-lysin. Đột biến thể dị dưỡng với homoserin được lên men trên môi trường L3 có bổ sung threonin với nồng độ là 0,8mg/ml và L-methionin được bổ sung với nồng độ 0,25 mg/ml. Đột biến thể dị dưỡng với threonin được lên men trên môi trường L3 có bổ sung threonin với nồng độ 0,8 mg/ml. Chủng tự nhiên 115 C.glutamicum 3600 được lên men trên môi trường L3 và không bổ sung các axit amin nêu trên. Kết quả được trình bày ở bảng 29. Bảng 29. Sự sinh tổng hợp L-lysin ở các thể dị dưỡng với axit amin threonin, homoserin Chủng Nghiên cứu Kiểu hình Sản lượng L-lysin (g/l) C.g 3600 Chủng C. glutamicum tự nhiên 15 CM11 Dị dưỡng với threonin 28 CM24 Dị dưỡng với homoserin 30 Kết quả bảng 29 cho thấy, đột biến thể dị dưỡng với homoserin CM24 có khả năng sinh tổng hợp L-lysin cao, sản lượng đạt 30 g/l. Đột biến thể dị dưỡng với threonin với CM11 sinh tổng hợp được lượng L-lysin khá cao là 28 g/l. Trong khi đó chủng tự nhiên C. glutamicum 3600 (không được xử lý bằng nitrosoguanidine) sản lượng được 15 g/l L- lysin. Như vậy sau khi xử lý chủng C. glutamicum 3600 tự nhiên bằng nitrosoguanidine, các đột biến thể dị dưỡng với homoserin đã sản sinh được lượng L-lysin cao gấp 2 lần so với chủng C.glutamicum 3600 bố mẹ, các chủng dị dưỡng với threonin đã tích lũy được lượng Lysin cao gấp 1, 86 lần so với chủng C. glutamicum 3600 tự nhiên. 2.2. Nâng cao sản lượng L-methionin bằng kỹ thuật đột biến nitroguanidine có chọn lọc bằng L-methionin sulfoxide 2.2.1. Kết quả phân lập các đột biến thể C. acetoglutamicum xử lý bằng nitrosoguonidine bằng chất đồng đẳng L-methionin sulfoxide Sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1 % và 0,5 % để gây đột biến, chúng tôi tiến hành phân lập các đột biến thể đề kháng với L-methionin sulfoxide bằng cách tăng dần nồng độ L-methionin sulfoxide từ 0,1 mg/ml đến 100 mg/ml. 116 Bảng 30: Ảnh hưởng của nồng độ L-methionin sulfoxide đến số lượng khuẩn lạc của các đột biến thể đề kháng với L-methionin sulfoxide Số lượng khuẩn lạc đề kháng với L-methionin sulfoxide/đĩa petri Nồng độ L-methionin sulfoxide trong môi trường nuôi cấy (mg/ml) Thời gian nuôi cấy (giờ) Xử lý với nitrosoguanidine nồng độ 0,1% Xử lý với nitrosoguanidine nồng độ 0,5% 0,1 24 48 72 Mọc nhiều, không thấy tạo khuẩn lạc vệ tinh. Mọc nhiều, không thấy tạo khuẩn lạc vệ tinh 1,0 24 48 72 14 14 14 12 12 12 10,0 24 48 72 - 6 6 - 9 9 20,0 24 48 72 - 4 4 - 8 8 40,0 24 48 72 - - 4 - - 4 60,0 24 48 72 - - 4 - - 3 80,0 24 48 72 96 - - - 2 - - - 6 100,0 24 48 72 96 - - - - - - - - Ký hiệu : - chưa xuất hiện khuẩn lạc. 117 Từ kết quả ở bảng 30 chúng tôi thấy rằng nồng độ L-methionin sulfoxide tăng lên thì thời gian xuất hiện khuẩn lạc càng chậm và số lượng khuẩn lạc đề kháng với methionin sulfoxide giảm dần. Cùng với sự tăng nồng độ methionin sulfoxide, số lượng khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1% lớn hơn số lượng khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bằng bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,5%. Tại nồng độ methionin sulfoxide bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 100mg/ml không thấy sự xuất hiện các khuẩn lạc. Do vậy, các khuẩn lạc phân lập được ở nồng độ methionin sulfoxide 50mg/ml sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 31. Nhu cầu dinh dưỡng của các đột biến thể dị dưỡng và đề kháng với methionin sulfoxide ở nồng độ 80mg/ml Các đột biến thể Thời gian nuôi cấy (giờ) Không bổ sung axit amin bổ sung cystein Bổ sung threonin M1 24 72 - - + + + + M2 24 72 - - + + + + M3 24 72 - - + + - - M4 24 72 - - + + + + M5 24 72 - - + + + + M6 24 72 - - + + - - M7 24 72 - - + + - - M8 24 72 - - + + - - Để phân loại được các đột biến thể, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng của các đột biến thể dị dưỡng. Chúng tôi đã sử dụng các đột biến thể phân lập được trên môi trường MT3 có bổ sung methionin sulfoxide ở nồng độ 50mg/ml. Hai đột biến thể thu được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1 % ký hiệu là M1 và 118 M2. Bốn đột biến thể phân lập được sau khi xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,5% được ký hiệu là M3, M4, M5, M6. Kết quả bảng 31 cho thấy sau khi xử lý chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1% rồi chọn lọc bằng methionin sulfoxide nồng độ 50 mg/ml chúng tôi thu được kết quả như sau: Chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,1 % chỉ thu được các loại đột biến dị dưỡng với cystein bao gồm chủng M1 và M2. Chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên xử lý bằng nitrosoguanidine nồng độ 0,5 % thu được các loại đột biến dị dưỡng với threonin gồm các đột biến thể M3, M4, M5, M6. 2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cystein đến sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột biến thể dị dưỡng với cystein Để tìm được nồng độ cystein tối ưu cho sự sinh tổng hợp L-methionin ở đột biến thể dị dưỡng cystein chúng tôi tiến hành lên men 2 đột biến thể M1 và M2 trên môi trường MT3 có bổ sung cystein với các nồng độ từ 0,1 đến 1,2mg/ml. Kết quả ở bảng 32 cho thấy nồng độ cystein thích hợp cho sinh tổng hợp L- methionin tối đa là trong khoảng từ 0,9mg/ml đến 1,0mg/ml. Khi nồng độ cystein vượt quá 1,0 mg/ml thì lượng L-methionin sinh ra giảm rất nhanh. Bảng 32. Ảnh hưởng của nồng độ cystein lên sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột biến thể dị dưỡng với cystein Lượng L-methionin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ cystein bổ sung trong môi trường lên men (mg/ml) Đột biến thể M1 Đột biến thể M2 0,1 1,5 1,4 0,2 9,0 9,2 0,3 12,0 12,4 0,4 16,0 15,8 0,5 18,5 17,9 0,6 21,0 20,6 0,7 22,8 22,2 0,8 25,2 24,8 0,9 26,6 26,1 1,0 28,4 28,0 1,1 26,4 26,3 1,2 24,2 24,0 119 2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ threonin đến sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột biến thể dị dưỡng threonin Để tìm được nồng độ threonin tối ưu cho sự sinh tổng hợp L-methionin ở đột biến thể dị dưỡng threonin chúng tôi tiến hành lên men 2 đột biến thể M1 và M2 trên môi trường MT3 có bổ sung threonin với các nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 1,2 mg/ml. Bảng 33. Ảnh hưởng của nồng độ threonin lên sự sinh tổng hợp L-methionin ở đột biến thể dị dưỡng threonin Lượng L-methionin sinh tổng hợp (g/l) Nồng độ threonin bổ sung trong môi trường lên men (mg/ml) Đột biến thể M1 Đột biến thể M2 0,1 2,5 2,1 0,2 3,6 3,2 0,3 6,5 5,5 0,4 9,8 9,2 0,5 19,5 18,0 0,6 21,6 19,5 0,7 23,0 22,4 0,8 24,8 24,2 0,9 26,0 25,4 1,0 22,3 22,0 1,1 7,0 3,5 1,2 3,5 2,5 Kết quả ở bảng 33 cho thấy nồng độ threonin thích hợp để sinh tổng hợp L- methionin tối đa là trong khoảng 0,6 mg/ml đến 1,0 mg/ml. Khi nồng độ threonin vượt quá 1,0 mg/ml, lượng L-methionin tạo ra giảm rất nhanh. Hiện tượng này là do threonin 120 còn dư trong môi trường lên men sẽ kết hợp với L-methionin để ức chế ngược trở lại enzym aspastokinaza. 2.2.4. Sự sinh tổng hợp L-methionin ở các đột biến thể dị dưỡng với axit amin cystein và threonin Các đột biến thể của mỗi nhóm đột biến thể dị dưỡng với cystein và threonin được xác định khả năng sinh tổng hợp L-methionin. Đột biến thể dị dưỡng với cystein được lên men trong môi trường MT3 có bổ sung cystein với nồng độ 1,0mg/ml. Đột biến thể dị dưỡng với threonin được lên men trên môi trường MT3 có bổ sung threonin với nồng độ 0,9 mg/ml. Chủng tự nhiên C.acetoglutamicum 309 được lên men trên môi trường MT3 và không bổ sung các axit amin nêu trên. Kết quả được thể hiện ở bảng 34. Bảng 34. Sự tổng hợp L-methionin ở đột biến thể dị dưỡng với cystein và threonin Chủng nghiên cứu Kiểu hình L-methionin (g/l) C.acetoglutamicum 309 Chủng C.acetoglutamicum 15 Đột biến thể M1 Dị dưỡng với cystein 30 Đột biến thể M2 Dị dưỡng với threonin 29 Kết quả ở bảng 34 cho thấy đột biến thể dị dưỡng với cystein M1 sinh tổng hợp được một lượng L-methionin cao nhất là 28 g/l. Đột biến thể dị dưỡng với threonin M2 sinh tổng hợp được lượng L-methionin khá cao đạt 26 g/l. Trong khi đó chủng C.acetoglutamicum 309 (không được xử lý bằng nitrosoguanidine) sản sinh được 15 g/l L-methionin. Như vậy sau khi xử lý chủng C.acetoglutamicum 309 tự nhiên bằng nitrosoguanidine, các đột biến thể dị dưỡng với cystein đã sản sinh được lượng L- methionin cao gấp 2 lần so với chủng C.acetoglutamicum309 bố mẹ, các chủng dị dưỡng với threonin đã tích lũy được lượng L-methionin gấp 1,93 lần so với chủng c.acetoglutamicum 309 tự nhiên. 121 2.3. T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen dihydrodipicolinate synthase (dap A) tõ chñng C. glutamicum HN30 vµ CCM 3600(2) Gen Dap A là gen mã hóa cho enzym dihydrodipicolinate synthase, biến đổi aspartat semialdehyde thành dihydrodipicolinate ở điểm nhánh của quá trình trao đổi aspartat. Việc tách dòng gen Dap A là cơ sở quan trọng trong việc tiến tới tạo chủng tái tổ hợp nhằm nâng cao sản lượng L-lysin lysin. Chúng tôi đã tiến hành tách dòng gen Dap A từ chủng C. glutamicum HN30 phân lập vµ CCM 3600(2) của Trung tâm giữ giống quốc gia Cộng Hòa Séc. 2.3.1. KÕt qu¶ t¸ch ADN tæng sè: Chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch ADN tæng sè theo ph−¬ng ph¸p ®· ®−îc tr×nh bµy ë phÇn vËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p. S¶n phÈm t¸ch ADN tæng sè ®−îckiÓm tra trªn gel agaroza 1%. Qua ¶nh 2 chóng t«i nhËn thÊy b¨ng ADN cña c¶ 7 chñng ®Òu râ vµ t−¬ng ®èi s¹ch. C¸c mÉu ®Òu cã tû sè A260/A280 ≥ 1,8. V× vËy cã thÓ sö dông cho c¸c giai ®o¹n tiÕp theo. ¶nh 2: KÕt qu¶ ®iÖn di ADN tæng sè trªn gel agaroza 1% Chó thÝch: 1 2 3 4 122 Kªnh 1-5: ADN tæng sè cña chñng C. glutamicum HN89, C.glutamicumHN30 C. glutamicum N§24, C. glutamicum NH15, C. glutamicum NB32 2.3.2: . Nh©n b¶n gen Dap A cña chñng C. glutamicum HN30 vµ CCM 3600(2) b»ng kü thuËt PCR Dùa vµo tr×nh tù gen Dap A cña Bonnassie,S., Oreglia,J. and Sicard, A. M [10] ®· ®¨ng ký trong Ng©n hµng D÷ liÖu gen Quèc tÕ, chóng t«i sö dông phÇn mÒm PC/GENE ®Ó thiÕt kÕ cÆp måi Dap AP8 vµ Dap AM4. Chóng t«i tiÕn hµnh sö dông cÆp måi gåm hai ®o¹n måi Dap AP8 vµ Dap AM4 lµ: Dap AP8 (5'-TGTGGCTTGGGCGATTGTTATGC-3') vµ DapAM4(5'-ATTGTCGTTTCCGGCGGTCTCAGC-3') KÕt qu¶ ë ¶nh 3 cho thÊy: s¶n phÈm PCR thu ®−îcrÊt ®Æc hiÖu. S¶n phÈm PCR cña chñng C. glutamicum ph©n lËp ®Æc hiÖu vµo kho¶ng 1341 bp theo lý thuyÕt gièng víi s¶n phÈm PCR cña chñng C. glutamicum CCM 3600(2) chuÈn cña Céng hßa SÐc. Nh vËy chñng C. glutamicum ph©n lËp ký hiÖu HN30 ®· mang gen Dap A. ¶nh 3: §iÖn di trªn gel agaroza 1% kiÓm tra s¶n phÈm PCR cña chñng HN30 C. glutamicum ph©n lËp vµ chñng C. glutamicum CCM 3600(2) cña Céng hßa SÐc Chó thÝch: Kªnh 1: ChØ thÞ ph©n tö (ADN λ c¾t b»ng Hind III vµ EcoR I) tõ trªn xuèng (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp). 1 2 3 1341b 123 Kªnh 2: chñng HN30 C. glutamicum ph©n lËp. Kªnh 3: chñng chuÈn C. glutamicum CCM cña Céng hßa SÐc. 2.3.3.T¸ch dßng gen Dap A §o¹n gen Dap A ®−îcghÐp nèi víi vect¬ t¸ch dßng pCRTM 2.1. S¶n phÈm cña qu¸ tr×nh ghÐp nèi ®−îcbiÕn n¹p vµo tÕ bµo E.Coli DH5α , sau ®ã tÕ bµo biÕn n¹p ®−îctr¶i trªn m«i trêng LB chän läc cã bæ sung Ampicillin + IPTG+ X-gal vµ ñ ë 370C qua ®ªm. Plasmid ®−îct¸ch chiÕt tõ vi khuÈn theo ph¬ng ph¸p Minipreps. §Ó chän läc c¸c dßng tÕ bµo chøa plasmit cã ®Ýnh ®o¹n ADN ngo¹i lai ®Æc hiÖu cña gen Dap A, chóng t«i lÊy ngÉu nhiªn ë mÉu biÕn n¹p 11 khuÈn l¹c riªng rÏ mµu tr¾ng vµ 1 khuÈn l¹c mµu xanh lµ ®èi chøng ®Ó t¸ch chiÕt plasmit . KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë ¶nh 4. ¶nh 4: §iÖn di trªn gel agaroza 1% ®Ó chän c¸c plasmid t¸i tæ hîp mang gen Dap A. 1-11: Plasmid t¸ch tõ c¸c khuÈn l¹c tr¾ng. X: Plasmid t¸ch tõ c¸c khuÈn l¹c xanh. Tõ 4 plasmid cã kh¶ n¨ng mang gen DapA (t¸ch tõ c¸c dßng sè 1, 6, 7, 9, 11) chóng t«i ®· tiÕn hµnh c¾t b»ng enzym giíi h¹n EcoR I, khi c¾t b»ng enzym nµy ®o¹n AND ngo¹i lai sÏ ®−îct¸ch ra khái vect¬. KÕt qu¶ ë ¶nh 5 cho thÊy ®o¹n AND t¸ch ra khái vect¬ t¸ch tõ c¸c dßng1, 6 vµ 9 cã ®é dµi t−¬ng øng víi gen m· hãa cho Dap A theo lý thuyÕt lµ 1341 bp. Nh− vËy trong sè 124 c¸c khuÈn l¹c ®−îckiÓm tra, chóng t«i chän ®−îc4 dßng cã ®Ýnh s¶n phÈm PCR ®Æc hiÖu cã kh¶ n¨ng mang gen Dap A ®Ó ®äc tr×nh tù. Chó thÝch: 1, 6, 7, 9: Plasmid c¾t b»ng EcoR I. PCR: S¶n phÈm PCR ®o¹n ADN ®Æc hiÖu gen cña Dap A. M: ChØ thÞ ph©n tö (ADN λ c¾t b»ng Hind III vµ EcoR I , tõ trªn xuèng 21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp). 2.3.4. X¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap a tõ chñng C. glutamicum HN 30 ph©n lËp ë ViÖt Nam. §Ó cã thÓ kh¼ng ®Þnh ®o¹n ADN ®· t¸ch dßng ®óng lµ ®o¹n ®Æc hiÖu cña gen Dap A, chóng t«i tiÕn hµnh nu«i lîng lín, t¸ch plassmid, tinh s¹ch, sö dông hai måi xu«i vµ ngîc cã vÞ trÝ b¸m ®Æc hiÖu trong vect¬ pCR®2.1 vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù theo ph¬ng ph¸p tæng hîp cña Sanger vµ céng sù víi bé kit x¸c ®Þnh tr×nh tù BigDye Terminator 3.1 t¹i ViÖn C«ng nghÖ sinh häc - Trung t©m Khoa häc tù nhiªn vµ C«ng nghÖ Quèc gia. X¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A . Gtcgacggat cgcaaatggc aacaagcccg tatgtcatgg acttttaacg caaagctcac 60 acccacgagc taaaaattca tatagttaag acaacatttt tggctgtaaa agacagccgt 120 aaaaacctct tgctcgtgtc aattgttctt atcggaatgt ggcttgggcg attgttatgc 180 aaaagttgtt aggttttttg cggggttgtt taacccccaa atgagggaag aaggtaacct 240 tgaactctat gagcacaggt ttaacagcta agaccggagt agagcacttc ggcaccgttg 300 gagtagcaat ggttactcca ttcacggaat ccggagacat cgatatcgct gctggccgcg 360 ¶nh 5: §iÖn di trªn gel agaroza 1% ®Ó kiÓm tra c¸c plasmid t¸i tæ hîp mang s¶n phÈm PCR ®Æc hiÖu cña gen Dap A c¾t b»ng EcoR I. 125 aagtcgcggc ttatttggtt gataagggct tggattcttt ggttctcgcg ggcaccactg 420 gtgaatcccc aacgacaacc gccgctgaaa aactagaact gctcaaggcc gttcgtgagg 480 aagttgggga tcgggcgaag ctcatcgccg gtgtcggaac caacaacacg cggacatctg 540 tggaacttgc ggaagctgct gcttctgctg gcgcagacgg ccttttagtt gtaactcctt 600 attactccaa gccgagccaa gagggattgc tggcgcactt cggtgcaatt gctgcagcaa 660 cagaggttcc aatttgtctc tatgacattc ctggtcggtc aggtattcca attgagtctg 720 ataccatgag acgcctgagt gaattaccta cgattttggc ggtcaaggac gccaagggtg 780 acctcgttgc agccacgtca ttgatcaaag aaacgggact tgcctggtat tcaggcgatg 840 acccactaaa ccttgtttgg cttgctttgg gcggatcagg tttcatttcc gtaattggac 900 atgcagcccc cacagcatta cgtgagttgt acacaagctt cgaggaaggc gacctcgtcc 960 gtgcgcggga aatcaacgcc aaactatcac cgctggtagc tgcccaaggt cgcttgggtg 1020 gagtcagctt ggcaaaagct gcttcgcgtc tgcagggcat caacgtagga gatcctcgac 1080 ttccaattat ggctccaaat gagcaggaac ttgaggctct ccgagaagac atgaaaaaag 1140 ctggagttct ataaatatga atgattcccg aaatcgcggc cggaaggtta cccgcaaggc 1200 ggcccaccag aagctggtca ggaaaaccat ctggataccc ctgtctttca ggcaccagat 1260 gcttcctcta accagagcgc tgtaaaagct gagaccgccg gaaacgacaa tcgggatgct 1320 gcgcaaggtg ctcaaggatc c 1341 Tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C. glutamicum ph©n lËp, ®o¹n ADN nµy dµi 1341 cÆp baz¬. KÕt qu¶ Tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C. glutamicum ph©n lËp, ®o¹n ADN nµy dµi 1341 cÆp baz¬ cho thÊy: tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C. glutamicum HN 30 ®−îcx¸c ®Þnh cã chiÒu dµi 1341 cÆp baz¬ bao gåm sè lîng c¸c nucleotit nh sau: 340 A, 329 C, 358 G, 314 T ®· ®−îc®¨ng ký trong Ng©n hµng D÷ liÖu Gen Quèc tÕ víi sè ®¨ng ký AJ584662. So s¸nh tr×nh tù nucleotit ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen dap A tõ chñng ph©n lËp ë ViÖt Nam víi tr×nh tù cña thÕ giíi ®∙ c«ng bè Chóng t«i ®· tiÕn hµnh so s¸nh víi tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A ®· ®−îcBonnassie vµ c¸c céng sù [10] c«ng bè n¨m 1990 trong Ng©n hµng d÷ liÖu gen Quèc tÕ m· sè X53993. KÕt qu¶ ®−îcthÓ hiÖn nh− sau . DAPAVN - GTCGACGGATCGCAAATGGCAACAAGCCCGTATGTCATGGACTTTTAACG -50 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GTCGACGGATCGCAAATGGCAACAAGCCCGTATGTCATGGACTTTTAACG -50 DAPAVN - CAAAGCTCACACCCACGAGCTAAAAATTCATATAGTTAAGACAACATTTT -100 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CAAAGCTCACACCCACGAGCTAAAAATTCATATAGTTAAGACAACATTTT -100 126 DAPAVN - TGGCTGTAAAAGACAGCCGTAAAAACCTCTTGCTCGTGTCAATTGTTCTT -150 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - TGGCTGTAAAAGACAGCCGTAAAAACCTCTTGCTCGTGTCAATTGTTCTT -150 DAPAVN - ATCGGAATGTGGCTTGGGCGATTGTTATGCAAAAGTTGTTAGGTTTTTTG -200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATCGGAATGTGGCTTGGGCGATTGTTATGCAAAAGTTGTTAGGTTTTTTG -200 DAPAVN - CGGGGTTGTTTAACCCCCAAATGAGGGAAGAAGGTAACCTTGAACTCTAT -250 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CGGGGTTGTTTAACCCCCAAATGAGGGAAGAAGGTAACCTTGAACTCTAT -250 DAPAVN - GAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTG -300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTG -300 DAPAVN - GAGTAGCAATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCT -350 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAGTAGCAATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCT -350 DAPAVN - GCTGGCCGCGAAGTCGCGGCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTT -400 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GCTGGCCGCGAAGTCGCGGCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTT -400 DAPAVN - GGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCCCCAACGACAACCGCCGCTGAAA -450 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCCCCAACGACAACCGCCGCTGAAA -450 DAPAVN - AACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGGGATCGGGCGAAG -500 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - AACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGGGATCGGGCGAAG -500 DAPAVN - CTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTTGC -550 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTTGC -550 DAPAVN - GGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTT -600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTT -600 DAPAVN - ATTACTCCAAGCCGAGCCAAGAGGGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATT -650 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATTACTCCAAGCCGAGCCAAGAGGGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATT -650 DAPAVN - GCTGCAGCAACAGAGGTTCCAATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTC -700 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GCTGCAGCAACAGAGGTTCCAATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTC -700 DAPAVN - AGGTATTCCAATTGAGTCTGATACCATGAGACGCCTGAGTGAATTACCTA -750 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - AGGTATTCCAATTGAGTCTGATACCATGAGACGCCTGAGTGAATTACCTA -750 DAPAVN - CGATTTTGGCGGTCAAGGACGCCAAGGGTGACCTCGTTGCAGCCACGTCA -800 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CGATTTTGGCGGTCAAGGACGCCAAGGGTGACCTCGTTGCAGCCACGTCA -800 DAPAVN - TTGATCAAAGAAACGGGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTAAA -850 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - TTGATCAAAGAAACGGGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACCCACTAAA -850 DAPAVN - CCTTGTTTGGCTTGCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGAC -900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - CCTTGTTTGGCTTGCTTTGGGCGGATCAGGTTTCATTTCCGTAATTGGAC -900 DAPAVN - ATGCAGCCCCCACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGC -950 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATGCAGCCCCCACAGCATTACGTGAGTTGTACACAAGCTTCGAGGAAGGC -950 DAPAVN - GACCTCGTCCGTGCGCGGGAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGC -1000 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GACCTCGTCCGTGCGCGGGAAATCAACGCCAAACTATCACCGCTGGTAGC -1000 DAPAVN - TGCCCAAGGTCGCTTGGGTGGAGTCAGCTTGGCAAAAGCTGCTTCGCGTC -1050 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - TGCCCAAGGTCGCTTGGGTGGAGTCAGCTTGGCAAAAGCTGCTTCGCGTC -1050 127 DAPAVN - TGCAGGGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATTATGGCTCCAAAT -1100 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - TGCAGGGCATCAACGTAGGAGATCCTCGACTTCCAATTATGGCTCCAAAT -1100 DAPAVN - GAGCAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTTCT -1150 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAGCAGGAACTTGAGGCTCTCCGAGAAGACATGAAAAAAGCTGGAGTTCT -1150 DAPAVN - ATAAATATGAATGATTCCCGAAATCGCGGCCGGAAGGTTACCCGCAAGGC -1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - ATAAATATGAATGATTCCCGAAATCGCGGCCGGAAGGTTACCCGCAAGGC -1200 DAPAVN - GGCCCACCAGAAGCTGGTCAGGAAAACCATCTGGATACCCCTGTCTTTCA -1250 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGCCCACCAGAAGCTGGTCAGGAAAACCATCTGGATACCCCTGTCTTTCA -1250 DAPAVN - GGCACCAGATGCTTCCTCTAACCAGAGCGCTGTAAAAGCTGAGACCGCCG -1300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GGCACCAGATGCTTCCTCTAACCAGAGCGCTGTAAAAGCTGAGACCGCCG -1300 DAPAVN - GAAACGACAATCGGGATGCTGCGCAAGGTGCTCAAGGATCC -1341 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| DAPAFR - GAAACGACAATCGGGATGCTGCGCAAGGTGCTCAAGGATCC -1341 So s¸nh tr×nh tù nucleotit gi÷a ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A tõ chñng C. glutamicum HN30 ph©n lËp ë ViÖt Nam vµ ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A do Bonnassie vµ céng sù c«ng bè trong Ng©n hµng d÷ liÖu gen Quèc tÕ . Tõ kÕt qu¶ cho thÊy tr×nh tù ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A t¸ch dßng tõ chñng C. glutamicum HN30 ph©n lËp cña ViÖt Nam cã ®é t¬ng ®ång cao so víi ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A do Bonnassie vµ c¸c céng sù c«ng bè. §é t−¬ng ®ång ®¹t 100%. KÕt qu¶ dÞch m· ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap a. Chóng t«i còng ®· tiÕn hµnh dÞch m· ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cña gen Dap A sang protein nhê ch−¬ng tr×nh phÇn mÒm PC/Gene. 250 260 270 280 290 300 | | | | | | ATGAGCACAGGTTTAACAGCTAAGACCGGAGTAGAGCACTTCGGCACCGTTGGAGTAGCA METSerThrGlyLeuThrAlaLysThrGlyValGluHisPheGlyThrValGlyValAla 310 320 330 340 350 360 | | | | | | ATGGTTACTCCATTCACGGAATCCGGAGACATCGATATCGCTGCTGGCCGCGAAGTCGCG METValThrProPheThrGluSerGlyAspIleAspIleAlaAlaGlyArgGluValAla 128 370 380 390 400 410 420 | | | | | | GCTTATTTGGTTGATAAGGGCTTGGATTCTTTGGTTCTCGCGGGCACCACTGGTGAATCC AlaTyrLeuValAspLysGlyLeuAspSerLeuValLeuAlaGlyThrThrGlyGluSer 430 440 450 460 470 480 | | | | | | CCAACGACAACCGCCGCTGAAAAACTAGAACTGCTCAAGGCCGTTCGTGAGGAAGTTGGG ProThrThrThrAlaAlaGluLysLeuGluLeuLeuLysAlaValArgGluGluValGly 490 500 510 520 530 540 | | | | | | GATCGGGCGAAGCTCATCGCCGGTGTCGGAACCAACAACACGCGGACATCTGTGGAACTT AspArgAlaLysLeuIleAlaGlyValGlyThrAsnAsnThrArgThrSerValGluLeu 550 560 570 580 590 600 | | | | | | GCGGAAGCTGCTGCTTCTGCTGGCGCAGACGGCCTTTTAGTTGTAACTCCTTATTACTCC AlaGluAlaAlaAlaSerAlaGlyAlaAspGlyLeuLeuValValThrProTyrTyrSer 610 620 630 640 650 660 | | | | | | AAGCCGAGCCAAGAGGGATTGCTGGCGCACTTCGGTGCAATTGCTGCAGCAACAGAGGTT LysProSerGlnGluGlyLeuLeuAlaHisPheGlyAlaIleAlaAlaAlaThrGluVal 670 680 690 700 710 720 | | | | | | CCAATTTGTCTCTATGACATTCCTGGTCGGTCAGGTATTCCAATTGAGTCTGATACCATG ProIleCysLeuTyrAspIleProGlyArgSerGlyIleProIleGluSerAspThrMET 730 740 750 760 770 780 | | | | | | AGACGCCTGAGTGAATTACCTACGATTTTGGCGGTCAAGGACGCCAAGGGTGACCTCGTT ArgArgLeuSerGluLeuProThrIleLeuAlaValLysAspAlaLysGlyAspLeuVal 790 800 810 820 830 840 129 | | | | | | GCAGCCACGTCATTGATCAAAGAAACGGGACTTGCCTGGTATTCAGGCGATGACC