Đề tài Nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất vang cẩm

g trong gạo khác nhau. Nếp cẩm hay nếp than là loại gạo có vỏ màu tím đen hương thơm rất đặc biệt. Loại gạo này có thành phần hoá học về cơ bản giống với gạo trắng thường. Về thành phần tinh bột chứa 60 á 75%. Gạo cẩm có thành phần protein và một số các chất khoáng cao hơn so với gạo trắng. Đáng chú ý là hàm lượng lyzin, tryptophan, treonin, metionin, tiamin và riboflavin của chúng cao hơn các loại gạo khác. Gạo cẩm chứa nhiều photpho và canxi hơn gạo trắng [5] và [84]. Với lượng 150 gam gạo cẩm/ ngày, có thể cung cấp cho một người đủ nhu cầu về lyzin và tryptophan. Ngoài ra lớp vỏ hạt của gạo cẩm có chứa các anthoxyanin dễ hoà tan trong nước. Các anthoxyanin thường ở dạng hợp chất glucozit có tên là antoxyanoit mà phần đường là glucoza, ramonoza, phần aglucon của chúng gọi là anthoxyanidol. Các anthoxyanin có tính lưỡng tính, có thể thay đổi màu sắc theo pH hoặc khi nhóm đường bị tách ra do thuỷ phân. Các anthoxyanin có đặc tính kém nhạy với nhiệt và ánh sáng. Các anthoxyanin nói riêng và các flavonoit nói chung là những chất chống oxy hoá rất quý, có khả năng kết hợp với các gốc tự do chứa oxy (gốc alcoxy, peroxy) rất mạnh. Chúng cũng là những chất chống viêm nhiễm, chống virus và có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và chữa bệnh tiểu đường [45], [75] và [79]. Khoảng màu của anthoxyanin thay đổi rất rộng phụ thuộc vào nguồn gốc, điều kiện bảo quản và sự sử dụng chúng trong đồ uống. Nó cũng phụ thuộc vào giá trị pH của đồ uống lên men. Axit ascobic được dùng như là một chất chống oxy hoá để kéo dài sự tồn tại của màu sắc, nhưng ở mức cao hơn lại có thể gây ảnh hưởng bất lợi. Thành phần các chất tạo màu trong gạo đỏ thơm và rượu vang của nó chủ yếu được tạo bởi 7 cyanidin hoặc peoridin. Kết quả các phép thử hỗn hợp với các chất màu chuẩn, cho thấy tất cả các chất màu trong rượu vang gạo đỏ thuộc hai nhóm: nhóm giống như xyanidin gồm: 3,5-diglucosit, 3-sophorosit, 3-glucosit, 3-rutinosit và nhóm giống như ponidin gồm: 3-glucosit, 3-rutinosit. Trong đó 2 chất màu chiếm tỷ lệ lớn, quyết định chủ yếu đến màu của rượu vang là: xyanidin 3-glucoza chiếm 26,3%, ponidin 3- glucoza 15,7% [78]. Cám gạo là một phụ phẩm có giá trị của ngành xay xát thóc gạo. Ngay từ thời xa xưa người ta đã biết sử dụng cám gạo làm thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm. Sau này cùng với sự phát triển của xã hội và sự phát triển của khoa học kỹ thuật người ta khai thác sử dụng cám gạo vào những mục đích khác nhau. Cám gạo bao gồm những lớp vỏ hạt lớp alơron, một phần phôi hạt và một phần nhỏ tinh bột của nội nhũ hạt. Thành phần cám của gạo thay đổi theo giống lúa, độ sạch của nguyên lương, chế độ công nghệ xay xát và các kiểu thiết bị xay xát. Độ dày lớp cám vỏ hạt cũng làm thành phần của cám thay đổi khá lớn. Lớp vỏ hạt bao gồm: vỏ ngoài, vỏ trong và lớp alơron. Những hạt thóc ngắn (loại Japonica) thường có lớp alơron dày hơn loại thóc dài (loại Indica) và những loại lúa cạn có lớp alơron dày hơn loại lúa nước. Lớp alơron này chứa hạt alơron liên kết với chất béo có màu [95]. Gạo đỏ thơm có nhiều đặc điểm dinh dưỡng quý hơn các loại gạo khác, nó chứa chất màu anthoxyanin ở lớp vở cám và có mùi rất đặc trưng, có ảnh hưởng đến hương vị và màu sắc của sản phẩm rượu vang làm từ nguyên liệu này. Nhiều công trình khoa học đã nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu quý hiếm này cho sản xuất rượu vang gạo đỏ thơm [97] và [107]. 1.4.2. Hệ vi sinh vật trong sản xuất rượu vang gạo * Hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc: Hệ vi sinh vật có trong bánh men được truyền lại từ bánh men cũ. Do vậy các giống vi sinh vật trong bánh men cũng có nguồn gốc địa phương và thường không thuần khiết. Hệ vi sinh vật trong bánh men rất phong phú bao gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc phân lập được từ bánh men là R. oryzae, M. circinilloides, Penicillium và Amylomyces rouxii, nấm menlàSaccharomycescerevisiae,Hyphopichiaburtonii,Saccharomycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candida sp, và các chủng vi khuẩn lên men lactic và axetic [55], [57] và [65]. Khi sử dụng bánh men thuốc bắc để sản xuất rượu, các vi sinh vật trong bánh men sẽ phát triển nhanh chóng và sinh tổng hợp phức hệ enzim đường hoá tinh bột và lên men rượu. Các chủng giả nấm men, nấm mốc đều có khả năng sinh tổng hợp enzim a-amylaza và glucoamylaza. Quá trình chuyển hoá đường thành rượu do nấm men đảm nhiệm. Các chủng vi khuẩn có ý nghĩa tạo hương cho sản phẩm. Các vị thuốc bắc đóng vai trò quan trọng trong việc kháng khuẩn, tạo hương vị đặc trưng của sản phẩm và là thành phần không thể thiếu được của bánh men thuốc bắc [17]. 1.4.2.1. Nấm mốc Có khoảng vài trăm giống và hàng nghìn loài mốc (ít nhất 80.000) được miêu tả. Chỉ vài giống xuất hiện và có thể dễ dàng nhận ra trong đó giống thường xuất hiện là Mucor, Rhyzopus, Cephalothecium (Trichothecium),Geotrichum,Aspergillus, Penicillium, Cladosporium và Alternaria [37], [62] và [65]. + Rhyzopus: Tản phát triển bằng cách bò lan. Các loài này thường phân biệt với Mucor bởi sự có mặt của rễ giả, hình dạng của bào tử có cột hình bán cầu không tròn hoặc hình trụ, sinh sản và sinh trưởng nhanh hơn Mucor. Có nhiều loài: R. japonicoccus, R. oryzae, R. peka II, R. stokinensis có rễ giả sinh trưởng bằng cách lan rộng trên bề mặt môi trường[37] và [65]; rễ giả mọc thành chùm, tản bò phát triển và sinh ra các cuống bào tử nang chứa nhiều bào tử. Bào tử sinh ra từ nang trụ ở đầu cuống. Lúc còn non, bào tử nang trắng, lúc già màu đen, bên trong có nếp nhăn, kích thước 5-8 mm. Nhiệt độ phát triển thích hợp 32-340C. Sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp nhưng ít gặp. Chủ yếu sinh sản sinh dưỡng bằng hậu bào tử, khuẩn ty và sinh sản vô tính bằng bào tử nội sinh. Mắt thường có thể nhìn thấy khuẩn ty của chúng như những mạng nhện, bào tử nang lúc non màu trắng, khi già màu đen nhạt có chấm nhỏ. Bào tử dễ bay trong không khí, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nẩy mầm. Có khả năng sinh tổng hợp hệ amylaza và được dùng nhiều trong sản xuất rượu. Giống có 15 loài, trong đó 3 loài thường gặp và quan trọng là [37]: 1. R. oligosporus: Bào tử nhẵn, cuống bọc bào tử không quá 1mm. Có hậu bào tử . 2. R. stolonifer: Bào tử có vân, cuống bọc bào tử có thể đạt 4 mm. Hậu bào tử có hoặc không. Thân bò, không có hậu bào tử. Cuống bọc bào tử 1,5 á 4 mm. 3. R. oryzae: Tản bò với hậu bào tử, cuống bọc bào tử 1á1,5 mm. Sinh trưởng ở 370C. Tản màu nâu nhạt 1á3cm. Cuống bọc bào tử riêng hay thành 2á3 bó. Rễ giả màu nâu vàng ít phân nhánh. Bọc bào tử hình cầu với thành có gai nhỏ (50á100) x(150á200) mm. Trục giữa hình cầu hay trứng, bào tử không đều thường có góc màu xám hay màu nâu. Hậu bào tử hình cầu. Phân bố phổ biến ở đất, ở hạt, nguyên liệu thực vật đang phân giải. + Mucor. Đây là giống lớn nhất của Bộ Mucorales, thường gặp trong đất, trong phân bón và trên bề mặt hoa quả, rau, bánh mỳ và thức ăn giàu tinh bột. Hệ sợi dinh dưỡng lan sâu vào môi trường thức ăn và kéo dài lên trên không khí gọi là sợi khí sinh. Hệ sợi thường có màu trắng. Vách ngăn thường được tạo ra từ phần gần đỉnh của mỗi một sợi nấm, đầu tận cùng tế bào của sợi phồng ra một mấu tròn, hình trụ hoặc hình quả lê gọi là cột. Túi bào tử màu đen. Thành của túi bào tử khi chín dễ dàng bị vỡ, giải phóng nhiều bào tử. Mỗi một bào tử có khả năng lập lại chu kỳ phát triển của sợi nấm. Dưới một số điều kiện thuận lợi cho phép thì hai tế bào của hai sợi khác nhau có thể tiếp hợp với nhau cho ra một bào tử tiếp hợp. Bào tử tiếp hợp tiếp tục phát triển thành túi bào tử tại đỉnh. Mucor và Rhizopus rất giống nhau. Song có thể phân biệt bởi một số đặc điểm sau: Mucor không có rễ giả, cuống bọc bào tử nang có thể sinh ra ở bất kỳ chỗ nào và nang trụ không có hình bán cầu, không sát với vách bào tử nang. Khuẩn ty có hai loại (+) và (-) màu trắng, phân nhánh, giống nhau về hình thái, khác nhau về sinh lý. Từ một loại khuẩn ty có thể sinh sản vô tính. Từ hai loại khuẩn ty có thể sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp cho ra bào tử nang đa hạch, về sau là các bào tử nội sinh. Trong sản xuất người ta hay gặp các loài: M. rouxii, M. mucedo, M. javanicus, M. hydrophilus Nhưng ở nước ta thường gặp M. rouxii. M. rouxii phát triển mạnh trên môi trường thạch Czapek, khuẩn ty phân nhánh nhiều, không có vách ngăn, đa hạch, khuẩn lạc cao, không nếp nhăn, bám vào nắp hộp Petri. Cuống bào tử nang thường tròn, đường kính 60á80mm. Nang trụ 20á25mm. Bào tử tròn, đường kính 6á7mm. Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt. Bào tử nang từ màu trắng chuyển dần sang màu vàng nhạt, đỏ xám, đen, làm cho khuẩn lạc xám đen dần. Mặt dưới khuẩn lạc không có nếp nhăn, không màu. - Ngoài khả năng sinh tổng hợp amylaza còn có khả năng lên men rượu trong điều kiện thiếu khí. Hiện tượng này thường hay gặp trong quá trình sản xuất nấm mốc theo phương pháp bề mặt trên môi trường chất rắn có tinh bột, ở nhiệt độ cao 39 á 400C. Là một trong giống quan trọng của Mucorales bởi số lượng loài lớn (gần 50 loài ). Trong đó có một vài loài thường gặp là : - M. mucedo: Cuống bọc bào tử có thể mọc dài trên cơ chất tự nhiên, không phân nhánh hoặc có phân nhánh với chân phân nhánh kết thúc bởi một bọc bào tử. - M. racemosus: Hậu bào tử thường nhiều trong cuống bọc bào tử. Cuống bọc bào tử nhỏ hơn và phân nhánh - M. fuscus bainier: Tản thường có màu xám đậm. Cuống bọc bào tử phân nhánh, gốc ghép với sự phân nhánh tạo ra khoảng cách ngắn của một bọc bào tử và dựng đứng song song với trục. Trục giữa hình quả lê, đạt tới 50á80 mm. Bào tử có hình cầu 8á11mm màu nâu xám nhạt. ít hậu bào tử. - M. racemusus fresenius: Tản trắng trở nên xám, dạng bông. Cuống bọc bào tử có kích thước thay đổi, phân nhánh gốc ghép hay trục chính. Bọc bào tử hình cầu, có cuống bọc bào tử. Chúng có thể gây lên men cồn trong môi trường thiếu khí [36]. Một số loài Mucor có khả năng lên men trực tiếp tinh bột thành rượu. Loài nấm mốc sinh tổng hợp ra cả hai loại amylaza (diastaza) và zymaza. Amylaza là enzim thuỷ phân tinh bột thành đường, còn zymaza là nhóm enzim và coenzim biến đổi đường thành rượu. Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số giống khác và thường được sử dụng nhiều hơn trong sản xuất rượu. + Aspergillus: Aspergillus có thể tìm thấy dễ dàng ở khắp mọi nơi trong không khí, trên cơ chất. Loài mốc được tìm thấy trên bề mặt hoa quả thối, gạo, bánh mỳ và các thực phẩm khác. Aspergillus thường tìm thấy trên môi trường nuôi cấy thanh trùng chưa đảm bảo; Màu sắc rất thay đổi có thể xuất hiện màu xanh, màu vàng, màu da cam, màu đen hoặc màu nâu. Hệ sợi phân nhánh và có vách ngăn. Hệ sợi phình ra tại một điểm để tạo ra cuống bào tử đính. Cuống bào tử đính không phân nhánh, đa số cuống ngắn gọi là cuống đính bào tử (cuống nhỏ) phát triển từ đỉnh hoặc ở phần cuối của túi bào tử. Có hai loại khuẩn ty ký sinh phát triển trên mặt môi trường và khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường. Khuẩn ty phân nhiều nhánh, có nhiều vách ngăn tế bào, mỗi tế bào có một hạch nhân. Nang và nang bào tử là quả thể màu vàng kim. Khi Aspergillus hình thành bào tử dễ phân biệt với các nấm mốc khác [17] và [18]. - Aspergillus niger: Có màu đen, cuống đính bào tử thường nhẵn. Từ năm 1877, ở Nhật Bản người ta đã phát hiện và sử dụng Aspergillus vào việc sản xuất rượu, phân giải protit... ngoài việc sử dụng Aspergillus niger trong sản xuất axit citric. Nhưng gần đây, thành tựu khoa học lại chứng minh rằng một số nấm mốc bên cạnh khả năng sinh tổng hợp enzim có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất lại sinh độc tố gây không ít nguy hiểm cho người sử dụng, trong đó có một số là A. nige, A. flavus và nhiều chủng thuộc loại này tiết ra [10] và[19]. Các công trình nghiên cứu dịch tễ học ở các vùng khác nhau trên thế giới cho biết khẩu phần ăn hàng ngày có nhiều aflatoxin đã đẫn đến tỷ lệ dân số bị ung thư gan cao hơn các vùng khác [10]. WHO đã qui định thức ăn, thức uống cho người không được có quá 30 mg aflatoxin trong 1kg sản phẩm ăn uống, và không được có quá 0,3ppm aflatoxin trong thức ăn bổ xung cho trẻ em [10]. Từ năm 1960, các nhà khoa học đã chú ý đến vấn đề độc tố của nấm mốc và nấm mốc độc. Hiện nay trên 100 độc tố với trên 100 loài vi nấm tương ứng đã được phát hiện, trong đó chi Penicillium và chi Aspegillus chiếm nhiều nhất, đặc biệt một số Aspergillus niger sinh độc tố aflatoxin gây ung thư gan và nhiều chủng thuộc loài này tiết ra [10]. Chính vì thế khi sử dụng Aspergillus niger bên cạnh ưu thế hoạt lực thuỷ phân tinh bột cao, thì khả năng sinh axit làm rượu chua do pH của rượu giảm dẫn đến sắc tố màu anthoxyanin bị oxy hoá làm giảm cường độ màu của rượu. Đây là một trong những lý do cơ bản nhất của việc không dùng Aspergillus niger vào hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc sản xuất rượu vang cẩm của đề tài. Nấm mốc là đối tượng quan trọng của nhiều ngành sản xuất trong công nghiệp vi sinh vật: Làm bánh mỳ, làm rượu, làm bia, sản xuất các axit hữu cơ như axit citrric, axit gluconic, axit axetic..., sản xuất các chế phẩm enzim, các chất kháng sinh, sản xuất protein cho thức ăn gia súc, chế biến các phụ phẩm dầu hoả v.v... ở một số nước trên thế giới, loài mốc được sử dụng trong việc sản xuất đồ uống có cồn từ gạo. Tỷ lệ glucoza bị phân giải theo các con đường khác nhau ở các loài mốc là không giống nhau (bảng 1.8). Bảng 1.8. Khả năng phân giải glucoza bởi một số loài nấm mốc [63] Loài nấm mốc Tỷ lê (%) Glucoza bị phân giải theo các con đường khác nhau EMP* HMP* ED* Aspergillus niger 78 - - Rhizopus MX 100 - - Penicillium chrysogenum 56-70 46-30 - Trong đó : EMP là con đường Embden -Meyerhof- Parnas HMP là con đường Hexose Mono Phosphate ED Là con đường Entner- Doudoroff Nấm mốc là những vi sinh vật hiếu khí tham gia vào chuỗi hô hấp và sự thu nhận năng lượng thông qua chuỗi hô hấp năng lượng hoá học được giải phóng ra và được tích luỹ lại trong các liên kết cao năng của hợp chất ATP trong chu trình TCA và chu trình glyoxilic. Nấm mốc là những cơ thể dị dưỡng cacbon điển hình. Chúng đồng hoá các thức ăn hữu cơ có sẵn trong môi trường bằng cách chuyển hoá chúng thành đường đơn rồi hấp thụ vào tế bào. 1.4.2.2. Endomycopsis Giống Endomycopsis có cơ thể trưởng thành là hệ sợi cùng với bào tử đính nhiều chồi, bào tử phấn. Sự nhân đôi bằng cách phân cắt ngang và sự nẩy chồi nhiều phía. Nang bào tử có hình bán cầu, ô van, lưỡi liềm, nhẵn, sần sùi, hoặc có hình phóng xạ ở xung quanh, và sinh ra bằng tiếp hợp đẳng giao hoặc sinh sản vô tính. Để phân loại nấm men người ta dựa vào những đặc điểm hình thái và sinh lý. Họ Saccharomycetaceae là một họ thuộc các nấm men có bào tử nang. Các giống trong họ này có bào tử, sinh sản bằng nảy chồi. Nang thường chứa 1- 4 bào tử. Nang bào tử được hình thành bằng hình thức đẳng giao hoặc dị giao hoặc bằng hình thức sinh sản vô tính. Sinh sản sinh dưỡng bởi nẩy chồi hoặc phân đôi. Hệ sợi phong phú. Có nhiều hình thức tạo nang và bào tử có nhiều hình dạng: Bào tử có thể hình sao thổ, dạng mũ hoặc hình liềm, hình tròn hoặc hình ovan, có khoảng 11 loài. Tuy nhiên một số tác giả không đồng ý với sự phân loại trên và đã chuyển các loài tới các giống Hansenula, Pichia, Guiliermondella, và Schwanniomyces. Nhưng đến năm 1971, Van der Walt và Scott đã thay đổi tên của giống tới Saccharomycopsis. Đến năm 1972, chính tác giả và Von Arx đã chuyển nhiều loài Endomycopsis đến các giống mới. Giống Endomycopsis là giống duy nhất trong họ Saccharomycetaceae có thể sợi nấm thật và nấm giả [34] và [59]. - Từ năm 1940 Wiekerman đã nghiên cứu nhiều chủng và kết luận: Endomycopsis có khả năng sinh tổng hợp amilaza. Đó là hỗn hợp của nhiều amylaza tham gia quá trình thuỷ phân tinh bột (a- amylaza), và khả năng sinh tổng hợp glucoamylaza cao nên có khả năng dextrin hoá cao. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh được Endomycopsis sp có hoạt lực amylaza cao [61]. ở Việt Nam nhiều tác giả đã phân lập tuyển chọn được Endomycopsis fibuliger có hoạt lực sinh amilaza cao [4] và [34]. Năm 1977, một số tác giả phân lập được từ bánh men thuốc bắc, chọn được chủng Endomycopsos fibuliger 119 có khả năng phân giải tinh bột cao. Tác giả đã so sánh chủng này với 9 chủng Endomycopsis nhận từ nước ngoài và thấy rằng chủng Endomycopsis fibuliger 119 có khẳ năng sinh tổng hợp glucoamilaza cao [4], [34] và[61]. Một số công trình nghiên cứu của Nhật Bản (1997) đã phân lập Endomycopsis fibuliger từ bánh men thuốc bắc và xác định được hoạt lực glucoamylaza của chúng [68]. Endomycopsis fibuliger được nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi [4] và [34]. Từ các kết quả đó, chúng ta có thể khẳng định Endomycopsis có khả năng sinh tổng hợp glucoamylaza. Chúng ưu việt hơn nấm mốc là không chứa nhiều transglucozidaza. Đó là ưu điểm nổi bật cho phép sử dụng chế phẩm glucoamylaza của Endomycopsis sẽ không có mùi lạ từ nấm mốc tạo hương vị thơm ngon [4], [76] và [77]. 1.4.2.3. Nấm men Nấm men dùng trong sản xuất rượu thuộc giống Saccharomyces có tính lịch sử nhất của thế giới vi sinh vật. Những đặc tính sinh học: Tế bào nấm men Saccharomyces có hình tròn, ovan hay hình trụ và sinh sản theo lối nẩy chồi. Chúng thường phân bố rộng trong tự nhiên, được tìm thấy trong đất, không khí, nước, trên bề mặt quả, và lá của nhiều loại thực vật. Đặc biệt chúng có trong đất của vườn trồng cây ăn quả và vườn trồng nho. Nấm men có mặt trên bề mặt hoặc lớp dưới cặn dày của nước hoa qủa ép, dịch malt, và dịch đường trong sản xuất đường. Đặc tính sinh lý quan trọng nhất của Saccharomyces là khả năng lên men để sản sinh ra etanol và CO2 [1], [3], [4], [59] và [105]. Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân chuẩn, kích thước tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Ví dụ: S. cerevisiae có kích thước thay đổi trong khoảng 2,5 á 10 mm x 4,5 á 21 mm. Tuỳ loại nấm men mà tế bào có hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình quả chanh, hình elip, hình mũ phớt, hình sao thổ, hình cái liềm, hình thuôn, hình thoi, hình ong, hình cung nhọn, hình kéo dài, hình bán cầu, hình thận, hình quả lê, hình elip dài v.v... Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào có chứa các enzim thuỷ phân, poly photphat, lipit, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian. Ngoài tác dụng là một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu. Nảy chồi là phương pháp sinh sản vô tính phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện thuận lợi hầu hết tế bào nấm men đều có khả năng nảy chồi. Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipit nấm men, các enzim như amylaza, invertaza, lactaza, uricaza, polygalacturonaza, sản xuất ergosterol, axit ribonucleic, riboflavin (vitamin B2), các axit amin như lizin, metionin... S. cerervisiae hiện đang được sử dụng phổ biến trong việc sản xuất ra những sản phẩm thế hệ mới bằng phương pháp sinh học phân tử. Nấm men là một điển hình của vi sinh vật hiếu khí nhưng có thể lên men ở điều kiện thiếu khí . Trong điều kiện đủ oxy, nấm men sẽ sinh sản và sinh trưởng để tăng sinh khối là chủ yếu, còn rượu không tạo thành hoặc tạo thành rất ít [8]. C6 H12O6 + 6O2 đ 6CO2 + 6H2O +Q Khi không đủ oxy, nấm men lên men sinh rượu là chủ yếu, theo con đường EMP, rượu sinh ra từ quá trình khử axetaldehit. C6H12O6 đ 2C2H5OH + 2CO2+Q Trong quá trình trao đổi chất, nấm men đồng hoá các monosacarit ở điều kiện thiếu khí, sản phẩm của quá trình dị hoá là rượu etylic và CO2 được thải ra môi trường. Tế bào nấm men có khả năng tạo ra các enzim nội bào nghĩa là những enzim xúc tác ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 được tạo thành sẽ đi ra khỏi tế bào và tích tụ ở môi trường [4]. Dựa vào những đặc điểm trên trong sản xuất rượu vang bằng phương pháp cấy giống thuần chủng, người ta phải thực hiện hai giai đoạn: Nhân giống và lên men. ở giai đoạn nhân giống, cần tạo điều kiện về thành phần dinh dưỡng, đủ oxy... cho nấm men tăng sinh khối để có một lượng tế bào cần thiết đang ở thời kỳ hoạt động sinh lý mạnh đưa vào lên men. Giai đoạn lên men, thời kỳ đầu nấm men phát triển tăng sinh khối, thời kỳ sau là quá trình lên men thực sự để chuyển đường thành rượu. Nồng độ rượu sinh ra sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và các hoạt động khác của nấm men. Khả năng chịu nồng độ cồn cao tuỳ thuộc vào từng chủng nấm men. Khi các nguồn cơ chất trong môi trường lên men cạn dần và sản phẩm rượu của quá trình lên men sinh ra cao sẽ ức chế hoạt động của nấm men. + S. cerevisiae được dùng trong công nghệ lên men chế biến thực phẩm và đồ uống lên men như: bánh mỳ, bia, rượu, Sake của Nhật, rượu nếp cái hoa vàng, rượu vang cẩm... [1], [3], [4], [6], [18] và [96]. Tuy nhiên bên cạnh các nấm men có ích cũng có không ít các nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc các thực phẩm chế biến. Có khoảng 13 - 15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người và gia xúc. Đáng chú ý nhất là loài : Candida albicans, Cryptococcus neoformans ... Các yêu cầu để chọn chủng nấm men trong sản xuất rượu vang gạo: Để chọn được chủng có khả năng thích hợp với điều kiện và mục đích sản xuất, người ta cấy chủng đó trên môi trường thích hợp và đánh giá theo một số chỉ tiêu sau: - Có khả năng lên men tốt trong môi trường có nồng độ đường cao, cho độ cồn cao. - Có thể lên men triệt để, chịu được nồng độ cồn cao - Có thể lên men tốt trong những khoảng pH nhất định. - Có khả năng kết lắng tốt, làm trong rượu nhanh. - Góp phần tạo hương thơm ngon đặc trưng cho rượu. 1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzim của vi sinh vật 1.4.3.1. Chủng giống vi sinh vật Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu. Muốn nhận được chế phẩm có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, tìm những chủng có khả năng sinh tổng hợp và tích tụ nhiều enzim có hoạt động lên men mạnh, tạo ra sản phẩm có độ rượu cao và có hương vị đặc trưng, thơm ngon mà ta mong muốn, người ta phải luôn tìm cách tạo ra những giống tốt hơn bằng nhiều phương pháp: Phương pháp lai tạo, gây đột biến... 1.4.3.2. Môi trường dinh dưỡng Khi nuôi cấy có thể sử dụng nhiều chất khác nhau để chuẩn bị môi trường dinh dưỡng. Sử dụng chất này hay chất khác là tuỳ thuộc điều kiện thực tế sản xuất. Có nhiều loại môi trường là môi trường rắn và môi trường lỏng thường được sử dụng để nuôi mốc, nhưng chỉ một vài loại được dùng. Rau quả và nước chiết rau quả thường được dùng làm môi trường nuôi cấy. Có thể hoặc không bổ sung thêm đường. Môi trường rắn có thể là hợp chất của chất rắn như khoai tây, cà rốt và đậu hoặc môi trường rắn làm từ chất lỏng rồi bổ sung thêm thạch hoặc gelatin. Mốc có thể chịu được môi trường axit cao hơn vi khuẩn, trong sản xuất thường dùng môi trường có độ axit cao (pH 2á5). Môi trường rắn thường được dùng là môi trường Sabouraud bao gồm: glucoza 2%, pepton 1%, thạch 2%, pH=5,6. Chọn nguyên liệu để nuôi cấy vi sinh vật còn phải chú ý tới tính chất cảm ứng của enzim mà ta muốn thu nhận. Mặt khác phải tính đến khả năng cung cấp và hiệu quả kinh tế [64]. Trong sản xuất chế phẩm amylaza theo phương pháp bề mặt người ta hay dùng nhất là cám lúa mỳ. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp nhiều chế phẩm enzim khác nhau. ở nước ta thường dùng bột ngô, cám gạo và trấu trộn lẫn với các tỷ lệ khác nhau. Kết quả đã cho phép nhận được chế phẩm amylaza cao nhất là cám gạo. Song về chất lượng cám gạo ở thị trường có thành phần không ổn định nên gây nhiều khó khăn cho sản xuất. Nếu cám có hàm lượng trên 30% tinh bột thì có thể trộn theo tỷ lệ 85 á 90% cám cùng với 15 á 10% trấu nhỏ. Nếu hàm lượng tinh bột là 25 á 30% thì không cần trộn. Ngược lại nếu hàm lượng tinh bột trong cám chỉ 15 á 20% thì nên dùng 70 á 80% cám cộng với 20 á 30% bột ngô. Ngoài tinh bột môi trường cần chứa maltoza và dextrin. Sự có mặt của glucoza, fructoza và saccaroza có tác dụng giúp cho phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ amylaza. Ngược lại khi thêm lactoza và MgO vào môi trường thì nấm mốc phát triển kém hơn nhưng lại tích tụ nhiều amylaza [71] và [72] Nitơ vô cơ cũng có ảnh hưởng đến khả năng tạo ra enzim. Ví dụ: với A. awamorii có thể phát triển tốt trên môi trường chứa 0,05% nitơ vô cơ nhưng để tạo a-amylaza thì phải tăng lên 0,15%, để tạo glucoamylaza thì cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn nitơ hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng lại ít hiệu quả về phương diện tích tụ enzim. Nguồn nitơ là axit amin tham gia trực tiếp vào quá trình tạo thành các enzim và một số vitamin. Ví dụ: một trong những axit amin quan trọng trong việc tạo thành amylaza là axit glutamic. Sự tạo thành và tích tụ amylaza còn gắn liền với sự có mặt của một số ion Mg2+, Ca2+ và photpho đặc biệt là Mg. Trong môi trường thiếu sunphát magiê amylaza hầu như không được tạo thành, tuy nhiên hàm lượng sunphát magiê chỉ vào khoảng 0,05% . Sau Mg là phốtpho, ion này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành axit nuclêic. Hàm lượng của muối phốtphát axit kalium (KH2PO4) vào khoảng 0,1 á 0,2% [39] và [54]. Ion Ca+2 quyết định tính chịu nhiệt của enzim a-amylaza. Ngoài ra một số nguyên tố khác như lưu huỳnh và các nguyên tố vi lượng như Cu, Mn, Mo, Fe... cũng làm tăng hoạt độ của nhiều enzim 1.4.3.3. Điều kiện nuôi cấy Chủng giống và m