Đề tài Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam

ính kháng bền vững trong tương lai đối với từng vùng sinh thái nhất định. Ngoài ra việc xác định đúng thành phần chủng còn giúp công tác kiểm dịch thực vật ngăn chặn chủng ngoại xâm nhập vào và có thể mỗi chủng bị tiêu diệt bởi một số thuốc nhất định từ đó giúp nhà bảo vệ thực vật sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh một cách hợp lý. 2.3. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Xoo hiện nay trên thế giới Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D. Krishnaveni, A.P.K.Reddy và R.V.Sonti đã thu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995 trên 18 vùng của Ấn Độ. Sử dụng phương pháp DNA (RFLP) với hai mẫu dò (probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt: Probe dựa vào trình tự gen avrXa10 Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS1112 Kết quả, với Probe avrXa10 từ 67 Isolate tác giả đã phân ra 9 kiểu sai khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI. Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn EcoRI. Cuối cùng, các tác giả tổng hợp cả hai Probe avrXa10 và Probe IS 1112 thu được 15 kiểu sai khác phân tử. Năm 1999, Tika B.Adhikari, T.W.Mew, và Jan E. Leach sử dụng 2 phương pháp rep-PCR và IS-PCR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền đối với 171 Isolate phân lập được ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal. Trong đó tác giả sử dụng 3 mồi ERIC1R, ERIC2 (trong cùng một phản ứng) cho rep-PCR và mồi J3 cho IS-PCR. Mồi ERIC1R và ERIC2 được thiết kế trên cơ sở những các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp. Còn mồi J3 được thiết kế trên cơ sở hai đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113. Kết quả phân lập được 31 haplotype (kiểu sai khác phân tử) từ 171 Isolate nghiên cứu. ERIC1R: 5’ – ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC – 3’ ERIC2 : 5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’ J3: 5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’ Năm 2000, Edmilson R. Gonc: alves và Yoko B. Rosato sử dụng mồi BOXA1R với trình tự: 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’ cho phản ứng rep-PCR. Kết quả từ 55 Isolate thu thập được đã phân lập thành 16 species (loài) Xanthomonas and Pseudomonas syringae pv. Passiorae Tiếp nối thành công của Tika B.Adhikari(1999), tháng 6 năm 2007, Jiajian và cộng sự đã sử dụng phương pháp IS-PCR với mồi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xoo tồn tại tại Trung Quốc. Khi so sánh với DNA ladder và so sánh với trình tự genome của 2 chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018 (Nhật Bản), các tác giả đã phát hiện ra 3 locus mới trên trình tự chèn IS1112: (A) IS1112d GATATCGATATGGGT GGCGAATT…//…AAGCCGCC GGTGGATTCTTCCGGCG GATATCGATATGGGT GGATTCTTCCGGCG 405 (B) IS1112a TGAGCCAGTGTTTTG GGCGGCTT…//…AATTCGCC ACAGAAAACGCGGGT TGAGCCAGTGTTTTG ACAGAAAACGCGGGT (C) IS1112b GCTTCAACCGCCGATTCGACC GGCGGCTTCAACTCTGGAT…… GCTTCAACCGCCGATTCGACCTGAAACAGATGCTGCCGCG…… ISXo2 957 Hình 6: ba trình tự locus mới trên trình tự chèn IS1112 được phát hiện tại Trung Quốc (2007) 2.5. Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn Xoo tại Việt Nam. Những nghiên cứu rề đa dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho đến nay vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng lúa đẳng đơn gen (gen kháng bệnh bạc lá). Kết quả là có thể thiết lập được một phổ kháng nhiễm và dựa vào đây, các tác giả phân tích sự đa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những nhóm chủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dòng đẳng đơn gen. Còn những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thực thụ thì gần như chưa được tiến hành hoặc mới chỉ sử dụng chỉ thị phân tử để xác định vi khuẩn Xoo mà thôi. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh lý phổ biến ở miền Bắc nước ta (Nguyễn Văn Viết, 2005). Nhưng nghiên cứu gần đây của Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 thì trên các mẫu bệnh thu thập được ở các tỉnh miền Bắc phân biệt được 154 isolate trong đó 64 isolate thuộc 16 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Tuy trong kết quả nghiên cứu của tác giả có kết luận là tồn tại 2 chủng phổ biến kí hiệu là chủng 2 và chủng 3 ở vùng Đồng bằng sông Hồng. Song những chủng còn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm vì dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây bệnh với các giống lúa. Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn Xoo đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đó có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững. Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu sử dụng 11 mẫu vi khuẩn Xoo là các chủng vi khuẩn đã được Phan Hữu Tôn và cộng sự phân lập năm 2002 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo (Bảng 1). Bên cạnh đó còn sử dụng 9 mẫu vi khuẩn Xoo (kí hiệu bằng số 1,2,4,…) mới được tiến hành thu thập và phân lập ở một số huyện ngoại thành Hà Nội trong vụ mùa 2007 (Bảng 2). Các mẫu vi khuẩn đều được bảo quản tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử trực thuộc Khoa Công nghệ sinh học – trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội. Bảng 4. Danh sách và nguồn gốc của 11 chủng vi khuẩn phân lập năm 2002 (Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002) STT Kí hiệu Tên mẫu Tên giống thu thập Địa điểm thu thập 1 R1 HAU 01043 TN 13-4 Hà Nội 2 R2 HAU 020361 Nếp Tân Thuận Châu, Sơn La 3 R3 HAU 020083 Nhị ưu - 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An 4 R5 HAU 020131 Khang Dân Diễn Châu, Nghệ An 5 R6 HAU 020346 Nhị ưu – 838 Yên Bình, Yên Bái 6 R7 HAU 020191 Q5 Bình Giang, Hải Dương 7 R8 HAU 020201 Nếp Thơm Bình Giang, Hải Dương 8 R9 HAU 020371 IR 64 Thuận Châu, Sơn La 9 R10 HAU 020321 Hybrid rice Yên Bình, Yên Bái 10 R11 HAU 020081 Nhị ưu – 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An 11 R12 HAU 010081 Tẻ đỏ Hải Dương Dùng 9 dòng đẳng đơn gen (dòng chỉ thị) là: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB14, IRBB21 chứa lần lượt các gen kháng bệnh là: Xa-1, Xa-2, Xa-3, Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-10, Xa-14, Xa-21. Đối chứng là giống IR24 mẫn cảm với bệnh bạc lá (không chứa một gen kháng bệnh bạc lá nào). Bảng 5. Danh sách và địa điểm các mẫu bệnh thu thập STT Kí hiệu Tên giống thu thập Địa điểm thu thập Thời gian 1 1 Tẻ thơm (BT7) Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội 8/9/2007 2 2 Khang dân Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội 8/9/2007 3 4 Khang dân Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 8/9/2007 4 5 Tẻ thơm (BT7) Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 8/9/2007 5 8 Tẻ Thơm2 (BT7) Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 8/9/2007 6 12 Q5 An Bình, Nam Sách, Hải Dương 9/9/2007 7 15 Tẻ Thơm (BT7) Cộng Hoà, Chí Linh, Hải Dương 9/9/2007 8 36 Q5 Thanh Trì, Hà Nội 16/9/2007 9 70 TH3-3 Thanh Trì, Hà Nội 19/9/2007 3.4. Nội dung nghiên cứu - Thu thập, phân lập và xác định chính xác các chủng vi khuẩn Xoo từ một số mẫu vi khuẩn mới thu thập ở Hà Nội và lặp lại ở 11 mẫu vi khuẩn Xoo theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002. Phân chủng bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo dòng đẳng gen. - Xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA trên cơ sở sử dụng và phân tích những trình tự lặp lại và trình tự chèn IS1112, IS1113 của 20 mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu. - Thiết lập cây phân loại thể hiện mối tương quan về mặt di truyền giữa các mẫu vi khuẩn Xoo, xác định rồi phân nhóm ra các chủng. 3.5. Phương pháp nghiên cứu Nội dung và phương pháp nghiên cứu của đề tài được tóm tắt như sau: Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn Xác định vi khuẩn Xoo bằng PCR Nghiên cứu đa dạng di truyền các mẫu vi khuẩn bằng phương pháp rep-PCR và IS-PCR Nghiên cứu đa hình các mẫu vi khuẩn bằng lây nhiễm nhân tạo 3.5.1. Phân lập và nuôi cấy các mẫu vi khuẩn. - Phương pháp tiến hành theo N. Furuya và cộng sự, 2003: Các mẫu vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy đơn tế bào trên môi trường đặc hiệu Wakimoto. Công việc được thực hiện trên đĩa petri trong điều kiên vô trùng trong buồng cấy sau đó mẫu vi khuẩn được lưu giữ trong ống nghiệm. - Chuẩn bị môi trường Wakimoto: Thành phần môi trường (tính trên 500ml môi trường): + Khoai tây gọt vỏ 150g + Đường Saccarose 7,5g + NaHPO4.12H2O 1g + Agar 7,5g + Ca(NO3)2.4H2O 0,25g + Nước cất 500ml + Peptone 2,5g + pH 7,0 (Công thức môi trường theo Wakimoto,1995) + Khoai tây gọt vỏ, cho vào nồi, thêm 700ml nước cất và đun sôi trong 15-20 phút sau đó thu lấy dịch. + Hòa tan dịch khoai tây với đầy đủ hóa chất và thêm nước cất cho đủ 500ml, dùng khuấy từ khuấy đều và chuẩn độ cho pH = 7,0 + Đem hấp khử trùng ở 121oC; 1,5atm; trong vòng 20’. - Phân lập bằng phương pháp đơn tế bào: + Từ mẫu bệnh thu được cắt thành những đoạn nhỏ 5 x 5 mm phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khoẻ của vết bệnh đang phát triển. + Ngâm các đoạn cắt trong cồn 70% trong 10 giây. + Chuyển sang ngâm trong nước Javen trong 5 phút. + Rửa sạch trong nước vô trùng 2 – 3 lần. + Thực hiện cắt nhỏ và dùng chày nghiền mẫu với 1 ml nước cất vô trùng đến khi được dung dịch đồng nhất. + Hút 1ml dung dịch thu đựơc cho vào 9 ml nước cất, thực hiện 3 lần. + Hút 1 ml từ dung dich đã pha loãng ở cả 3 nồng độ pha loãng 10, 100, 1000 lần trải đều trên mặt các đĩa petri. + Sau 2 – 3 ngày xuất hiện khuẩn lạc. Quan sát và chọn các khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, màu vàng chanh nổi trên bề mặt thạch. Dùng que cấy vô trùng tách 4 đơn khuẩn lạc riêng rẽ ra 1 đĩa môi trường, cấy theo đường ziczăc. Sau đó cho vào tủ định ôn ở nhiệt độ 25.5oC khoảng 1-2 ngày. Nuôi cấy và được bảo quản trong môi trường Skim milk - Môi trường bảo quản vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn sau phân lập được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ là – 80oC trong môi trường Skim milk. Thành phần môi trường Skim milk: + Skim-milk:10 g + L-glutamic:1.5 g + Nước cất :100ml 3.5.2. Sử dụng PCR để xác định chính xác vi khuẩn Xoo Trong một vết bệnh bạc lá đang phát triển, bên cạnh vi khuẩn Xoo có thể tồn tại nhiều loại vi khuẩn khác. Những loại vi khuẩn này có thể cũng có khả năng tạo khuẩn lạc màu vàng, nhẵn bóng giống như vi khuẩn Xoo khi nuôi cấy, do đó khi phân lập chúng ta khó có thể phân biệt được chúng. Chúng tôi đã tiến hành phương pháp sử dụng PCR được đề xuất bởi Adachi, 1990 để nhận biết các vi khuẩn Xoo dựa trên trình tự bảo thủ giữa 2 đoạn tổng hợp rDNA 16s và 23s của chúng. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng dung dịch protease K để tiến hành chiết tách DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn đã phân lập. Sau khi đã kiểm tra kết quả chiết tách trên gel agarose 1%, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi XOR-R2, XOR-F với thành phần phản ứng PCR và chu kì nhiệt độ thích hợp. Sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với DNA ladder 1kb để đưa ra kết luận cuối cùng. - Chiết tách DNA tổng số của vi khuẩn Xoo + Hòa tan 1-2 vòng que cấy vi khuẩn trong 200µl hỗn hợp dung dịch Protease K và giữ ở 56oC trong 15 phút. + Đột ngột tăng nhiệt độ lên 800C trong 15 phút để làm biến tính Protease K sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút + Cuối cùng hút lớp dịch lỏng phía trên (DNA) và loại bỏ phần cặn phía dưới sang một ống eppendoff mới và bảo quản ở 4oC. - Điện di kiểm tra kết quả chiết tách: + Tiến hành điện di điện di sản phẩm chiết tách trên gel agarose 1%, sử dụng nguồn điện 1 chiều có U = 65V, trong khoảng 45 à 60 phút. + Nhuộm bản gel trong dung dịch ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV. Những mẫu chiết tách thành công sẽ xuất hiện vạch màu sang, rõ nét trên bản gel. - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi XOR-R2, XOR-F: + Các mẫu DNA chiết tách thành công sẽ được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR. Cặp mồi sử dụng: Tên mồi Trình tự mồi XOR – R2 5’ – CTCGGAGCTATATGCCGTGC – 3’ XOR – F 5’ – GCATGACGTCATCGTCCTGT – 3’ + Thành phần phản ứng PCR: 1x Taq buffer; 2.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM Primer XOR – R2 và Primer XOR – F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA khuôn còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl. + Tiến hành chạy PCR theo chu trình nhiệt: nâng lên 94oC trong 30s, hoàn thành 30 chu kì với 94oC trong 1 phút – 60oC trong 30s – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC. - Điện di kiểm tra kết quả PCR: + Tiến hành điện di điện di sản phẩm PCR có kèm DNA ladder 1Kb để so sánh kích thước trên gel agarose 2%, sử dụng nguồn điện 1 chiều có U = 80V, trong khoảng 60 à 90 phút. + Nhuộm bản gel trong dung dịch ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV. Những mẫu chính xác là vi khuẩn Xoo sẽ cho hiện 1 vạch băng sáng có kích thước 470 bp trên bản gel. Những mẫu không phải là Xoo sẽ không cho hiện vạch băng hoặc vạch băng không đúng kích thước. 3.5.3. Xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng pháp rep PCR và IS-PCR - Phương pháp rep-PCR (repetitive sequence-based PCR): + Theo Tika B. Adhikari và cộng sự,1999 rep-PCR là phương pháp sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên sự đa hình về các trình tự lặp lại trong bộ genome của vi khuẩn nghiên cứu, những trình tự này là bảo thủ giữa các chủng vi khuẩn nên có thể sử dụng chúng để nghiên cứu sự đa dạng của các chủng trong cùng một loài. Sử dụng mồi đơn ERIC2F (Vera Cruz, 2003) và mồi BOXA1RF (Adhikari, 1999) với trình tự như sau: Tên mồi Trình tự ERIC2F 5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’ BOXA1RF 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3’ + Thành phần phản ứng PCR : : 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM primer ERIC2F ( và primer BOXA1RF); 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA tempale solution còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl. + Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95oC trong 7phút, hoàn thành 35 chu kì với 94oC trong 1 phút – 48oC (với ERIC2F) và 53oC (với mồi BOXA1RF) trong 2 phút – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu được thống kê dưới dạng nhị thức và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích, đánh giá sự đa dạng của các mẫu vi khuẩn. - Phương pháp IS-PCR (insertiton sequence-based PCR) + Cũng theo nghiên cứu của Adhikari, 1999 thì trong bộ genome của vi khuẩn Xoo có nhiều nhóm các trình tự chèn với kích thước, số lượng khác nhau. Ông đã chỉ ra rằng 2 trình tự IS1112 và IS1113 sẽ thể hiện tốt nhất sự đa dạng giữa các chủng Xoo. Sử dụng kỹ thuật IS-PCR với mồi đơn J3F [5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’] cho phép nghiên cứu 2 trình tự đó. + Thành phần phản ứng PCR: 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM primer J3F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA tempale solution còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl. + Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95oC trong 7phút, hoàn thành 30 chu kì tại 94oC trong 1 phút – 48oC trong 2 phút – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu cũng được thống kê dưới dạng nhị thức và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích, đánh giá sự đa dạng của các mẫu vi khuẩn. 3.5.4. Nghiên cứu đa hình các mẫu vi khuẩn bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo Phương pháp tiến hành theo đề xuất của Taura và cộng sự, 2000: - Chọn thời điểm lây nhiễm: Lây nhiễm lúc trên mặt lá lúa không đọng sương hay nước mưa, thời tiết thoáng mát, khô ráo. Đảm bảo sau khi lây nhiễm ít nhất 3h trời không mưa to. Tiến hành lây nhiễm vào cuối của giai đoạn đẻ nhánh đến giai đoạn lúa bắt đầu phân hóa đòng. - Cách thức tiến hành lây nhiễm: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto trong khoảng từ 72 – 96 tiếng (3 - 4 ngày). Trộn đều 4 que cấy vi khuẩn trong 10ml nước cất đã được hấp khử trùng, sau đó dùng kéo đã được rửa sạch bằng cồn và hấp khử trùng ở 121oC; 1,5atm; 20’ tiến hành lây nhiễm. Mỗi mẫu vi khuẩn dùng một kéo khác nhau. Cắt 2–3 cm đầu lá, cắt ít nhất 5/mẫu vi khuẩn/dòng đẳng đơn gen. - Kiểm tra kết quả lây nhiễm: Sau 18 ngày kể từ ngày lây nhiễm, tiến hành đo chiều dài vết. Dùng thước đo chiều dài vết bệnh tính từ vết cắt lây nhiễm cho đến vị trí giữa vết chết hoại và vết lan. Ghi chép số liệu, xử lí số liệu, lập bảng kháng nhiễm và phân tích sự đa hình các mẫu vi khuẩn cần phân lập dựa vào bảng kháng nhiễm theo chương trình NTSYSpc2.0. 3.5.5. Cách thức phân tích số liệu Số liệu được phân tích, đánh giá bằng phần mềm NTSYSpc2.0, xây dựng theo công thức tính hệ số đồng dạng di truyền của M.Nei và Li, 1979: Sij = 2Nij/(Ni + Nj) Trong đó: Ni: vạch của giống i Nj: vạch của giống j Nij: vạch chung của hai giống i và j. Kết quả số vạch nhân lên trong rep-PCR, IS-PCR sẽ được chuyển sang dạng nhị thức. Cách đánh giá: có vạch = 1, không có vạch = 0. Sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 sẽ thu được hệ số tương đồng giữa các mẫu vi khuẩn, xây dựng được cây phân loại và xác định được hệ số tương đồng có ý nghĩa (kí hiệu r) để phân loại các mẫu vi khuẩn vào các chủng khác nhau. Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và Nuôi cấy các mẫu vi khuẩn Chúng tôi đã nuôi cấy thành công 20/20 mẫu vi khuẩn trên môi trường nhân tạo Wakimoto. Sau 2 ngày nuôi cấy, các mẫu vi khuẩn đều tạo khuẩn lạc màu vàng, nhẵn, bóng, ăn lan 2/3 diện tích bề mặt môi trường nuôi cấy đặc nghiêng. Sau khi phân lập, các mẫu vi khuẩn được cấy chuyển sang ống nghiệm để bảo quản mẫu phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Hình 7. Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trong ống nghiệm Như vậy có thể khằng định mẫu vi khuẩn bảo quản tại phòng thí nghiệm vẫn có khả năng sống tốt và phương pháp dùng môi trường Wakimoto là phù hợp với nuôi cấy vi khuẩn Xoo. 4.2. Sử dụng PCR để xác định chính xác vi khuẩn Xoo. - Kết quả chiết tách DNA: chúng tôi đã tiến hành chiết tách DNA tổng số đối với tất cả 20 mẫu vi khuẩn Xoo, điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách, kết quả các mẫu vi khuẩn đều cho hiện 1 vạch băng sáng, rõ nét trên bản gel agarose. Điều này chứng tỏ 20 mẫu vi khuẩn đều đã được chiết tách DNA thành công (Hình 8). Chúng tôi nhận thấy tiến hành chiết tách DNA theo phương pháp của N. Furuya và cộng sự, 2003 cho kết quả thành công cao khi áp dụng với vi khuẩn Xoo (thành công 20/20 mẫu vi khuẩn tiến hành chiết tách). - Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằngPCR: Những mẫu DNA đã được kiểm tra là chiết tách thành công sẽ được sử dụng tham gia vào phản ứng PCR với cặp mồi XOR-R2 và XOR-F để xác định chính xác vi khuẩn Xoo. Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% và sử dụng DNA ladder 1kb để so sánh kích thước, chúng tôi đã thu được 17/20 mẫu vi khuẩn (với mẫu DNA tương ứng) cho hiện vạch băng sáng, rõ nét có kích thước 470 bp trên bản gel, những mẫu còn lại không cho hiện vạch băng (Hình 9). Như vậy, đã xác định được chính xác 17/20 mẫu vi khuẩn nghiên cứu là vi khuẩn Xoo. Những mẫu này sẽ được tiếp tục sử dụng trong những nghiên cứu tiếp theo của đề tài, những mẫu không phải là vi khuẩn Xoo sẽ được loại bỏ. Hình 8. Kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 1%. Giếng 1-7 lần lượt là các mẫu 2, 4, 5, 8, 12, R1, R2 Hình 9. Xác định Xoo bằng PCR với mồi XOR. Giếng 1 : DNA ladder. Giếng 2 : R1 Giếng 3: R2 Giếng 4: mẫu 1 Giếng 5: mẫu 36 Giếng 6: mẫu 4 Giếng 7: mẫu 5 Giếng 8: mẫu 12 Trong hình 9, các mẫu R1, R2, 4, 5, 12 cho hiện vạch băng sáng, rõ nét kích thước 470 bp trên bản gel điện di chứng tỏ các mẫu này chính xác là vi khuẩn Xoo (kích thước được so sánh với DNA ladder ở giếng 1). Các mẫu 1 và mẫu 36 không cho hiện vạch băng có kích thước 470 bp nên chúng tôi kết luận không phải là vi khuẩn Xoo. Những mẫu này có thể là một loại vi khuẩn xanthomonas nào đó sống cộng sinh với vi khuẩn Xoo trong cùng vết bệnh hoặc thậm trí là các loài khác trong cùng họ vi khuẩn Xanthomonas như X. campestris pv. citri, pv, incanae và pv. zinniae. Bảng 6. Kết quả phân lập và xác định vi khuẩn bạc lá bằng kỹ thuật PCR STT Mẫu Phân lập Kiểm tra bằng PCR STT Mẫu Phân lập Kiểm tra bằng PCR 1 R1 + + 11 R12 + + 2 R2 + + 12 1 + - 3 R3 + + 13 2 + + 4 R5 + + 14 4 + + 5 R6 + + 15 5 + + 6 R7 + + 16 8 + + 7 R8 + + 17 12 + + 8 R9 + + 18 15 + + 9 R10 + + 19 36 + - 10 R11 + + 20 70 + - Chú thích: (+) Phân lập thành công hoặc kiểm tra PCR đúng là vi khuẩn Xoo (-) Phân lập không thành công hoặc kiểm tra PCR không phải là vi khuẩn Xoo. 4.3. Kết quả xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp rep PCR và IS-PCR Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng rep-PCR và IS-PCR đối với 17 mẫu vi khuẩn đã được kiểm tra chính xác là Xoo bằng kĩ thuật PCR. Khi nhuộm bản gel điện di và kiểm tra trong buồng chụp UV, chúng tôi đã thu được số vạch băng nhân lên khá cao đối với 3 mồi đơn ở cả 2 phương pháp nghiên cứu được trình bầy ở các hình 10, 11 và 12. + Rep-PCR nhân lên được 14 vạch băng có kích thước khác nhau với mồi ERIC2F và 12 vạch băng có kích thước khác nhau với mồi BOXA1RF. + IS-PCR nhân lên được 22 vạch băng có kích thước khác nhau với mồi J3F. Như vậy khi sử dụng 3 mồi với 2 phương pháp rep-PCR và IS-PCR chúng tôi đã nhân lên được tổng cộng 48 vạch với kích thước khác nhau hiện lên trên bản gel điện di tương ứng với 48 vùng gen khác nhau trên bộ genome của vi khuẩn Xoo. Mặt khác những vùng gen này lại phân bố rải rác khắp bộ genome của vi khuẩn Xoo do đó việc phân tích đa dạng các mẫu vi khuẩn đã phủ được một vùng DNA genom rộng lớn, đây có thể là cơ sỏ phân tử để xác định và phân nhóm các mẫu vi khuẩn một các chính xác hơn. R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm rep-PCR với mồi ERIC2F (12 vạch) R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm rep-PCR với mồi BOXA1RF (14 vạch) R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 Hình 12. Ảnh điện di sản phẩm IS-PCR với mồi J3F (22 vạch) Từ những kết quả điện di sản phẩm rep-PCR và IS-PCR, chúng tôi đã tiến hành thống kê số vạch nhân lên của từng mẫu vi khuẩn đối với từng loại mồi dưới dạng nhị thức. Kết quả được biểu diễn ở các bảng 1, 2 và 3 trong phần phụ lục bảng. Khi đã có được những thống kê trên, chúng tôi đã sử dụng phần mềm chuyên dụng NTSYSpc2.0 để xác định hệ số đồng dạng về mặt di truyền giữa các mẫu vi khẩn nghiên cứu (bảng 4, phần phụ lục bảng). Đồng thời chúng tôi cũng đã xây dựng được cây phân loại biểu diễn mỗi quan hệ về mặt di truyền giữa các mẫu vi khuẩn. (Hình 13). 0.95 Hình 13. Cây phân loại của mồi BOXA1RF, J3 và ERIC2F theo chương trình NTSYSpc2.0 Phần mềm NTSYSpc2.0 được xây dựng dựa trên công thức tính hệ số tương quan về mặt di truyền của M.Nei và Li, 1979. Phần mềm này cho phép chúng tôi xác định được hệ số tương đồng di truyền có ý nghĩa là r = 0,95 và trong đề tài này chúng tôi đã chọn hệ số tương đồng di truyền 0,95 để phân loại các mẫu vi khuẩn Xoo vào các nhóm chủng khác nhau. Từ cây phân loại với thước đo hệ số đồng dạng phía dưới, chúng tôi nhận thấy các mẫu R2 với R3; mẫu 5 và 15; mẫu R6 với các mẫu R7, R8 có hệ số đồng dạng về mặt di truyền cao ( > 0,95) nên chúng tôi đã xếp các mẫu vi khuẩn này thuộc vào cùng một nhóm chủng. Những mẫu còn lại có hệ số tương đồng di truyền < 0,95 sẽ được phân vào những nhóm chủng riêng biệt. Như vậy, bằng phương pháp rep-PCR và IS-PCR, từ 17 mẫu vi khuẩn nghiên cứu chúng tôi đã phân lập được 13 chủng khác nhau tại hệ số tương đồng có ý nghĩa về mặt di truyền là r = 0,95. Các nhóm đó là: - Nhóm 1: mẫu R1. - Nhóm 6: mẫu R6, R7, R8. - Nhóm 11:mẫu 2 - Nhóm 2: mẫu R2, R3. - Nhóm 7: mẫu 8. - Nhóm 12: mẫu 4 - Nhóm 3: mẫu R11. - Nhóm 8: mẫu R9. - Nhóm 13: mẫu 12 - Nhóm 4: mẫu R5, 15. - Nhóm 9: mẫu R12 - Nhóm 5: mẫu 10 - Nhóm 10: mẫu 5 4.4. Kết quả xác định đa dạng các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng đơn gen Quá trình bảo quản và cấy chuyển các mẫu vi khuẩn có thể làm cho hoạt tính của các mẫu vi khuẩn bị giảm hoặc mất đi. Điều này sẽ ảnh hưởng đến kết quả của phương pháp. Để kiểm nghiệm, chúng tôi đã tiến hành lây nhiễm các mẫu vi khuẩn trên cả giống đối chứng mẫn cảm IR24 và các dòng đẳng đơn gen. Những mẫu Xoo cho kết quả nhiễm với IR24 thì được xác định là độc tính vẫn ổn định. Kết quả lây nhiễm được biểu diễn ở bảng 5, phần phụ lục bảng. Với d (cm) là chiều dài trung bình của vết bệnh thì: d < 8 = kháng, kí hiệu R 8 < d < 12 = kháng TB hoặc nhiễm TB, kí hiệu M. d > 12 = nhiễm S Bảng 7. kết quả đánh giá lây nhiễm nhân tạo – phổ kháng nhiễm BB1 BB2 BB3 BB4 BB5 BB7 BB10 BB14 BB21 IR24 R 1 S S R S R R S S R S 4R/6S R 2 R R R R R R R R R S 9R/1S R 3 R R R R R R R R R S 9R/1S R 5 S M R S R R S M R S 4R/2M/4S R 6 S M M M R R M R R S 4R/4M/2S R 7 S S R M R R S S R S 4R/1M/5S R 8 S S R M R R S M R S 4R/2M/4S R 9 S S S S R S S S M S 1R/1M/8S R 10 S S R S R R S S R S 4R/6S R 11 S S S S R R S S R S 3R/7S R 12 R M R R R R S R R S 7R/1M/2S 2 S S R S R R S S R S 4R/6S 4 S R R R R R R R R S 8R/2S 5 S S R S R R S S R S 4R/6S 8 S S R R R R S S R S 5R/5S 12 R R R R R R R R R S 9R/1S 15 S S R S R R S S R S 4R/6S 4R/13S 4R/3M/10S 14R/1M/2S 6R/3M/8S 17R 16R/1S 4R/1M/12S 6R/2M/9S 16R/1M 17S Trong đó: S: Nhiễm M: kháng TB R: kháng Từ kết quả đánh giá ở phổ kháng nhiễm (bảng 7), chúng tôi nhận