Đề tài Nghiên cứu đa đạng di truyền của một số giống bưởi bằng kỹ thuật RAPD

ệ số đồng dạng di truyền dựa trên kết quả phản ứng RAPD cho thấy phần lớn các dòng nghiên cứu là đồng nhất hay giống đến hơn 92% so với cây mẹ, ngoại trừ CL2 và CL9 (66%) đã thể hiện mức độ thay đổi di truyền lớn nhất với sự có mặt của 2 band RAPD mà không có ở cây mẹ [25]. Năm 2005, Chadha và Gopalakrishna đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa ở Ấn Độ bằng phương pháp RADP. Nghiên cứu nhằm xác định mối quan hệ di truyền và khả năng biến đổi di truyền trong những chủng nấm đạo ôn. Tổng cộng có171 band đa hình được tạo ra khi khuếch đại với 33 primer chọn lọc ngẫu nhiên trên 20 chủng nấm đạo ôn (chiếm khoảng 64%). Kích thước của sản phẩm khuếch đại thay đổi từ 0,2-3,0 kb. Số lượng sản phẩm khuếch đại thu được là đặc trưng cho từng primer và thay đổi từ 3 (OPF03) đến 14 (OPG10 và OPG17), trung bình 8,2. Hệ số tương đồng trong các chủng từ 0,76-0,92. Sự đa hình cao có thể được giải thích do kết quả của sự tiến hóa từ tự nhiên, sự hoán vị gen do stress gây ra và sự chuyển gen ngang giữa nấm đạo ôn và vật chủ của nó. Sự hiểu biết về nguyên nhân của đa dạng nguồn bệnh sẽ giúp cải thiện những phương pháp quản lý lúa bị bệnh [29]. Trà là loại thức uống không cồn tốt cho sức khỏe phổ biến nhất trên thế giới. Cây trà (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) thuộc nhóm (section) Thea, chi Camellia, họ Theaceace, có nguồn gốc từ Tây Nam Trung Quốc. Sự đa dạng di truyền, mối quan hệ và đặc điểm phân tử của 15 nguồn vật liệu di truyền phổ biến ở tỉnh Zhejiang, Trung Quốc đã được Chen và cs (2005) xác định bằng kỹ thuật RAPD. Các tác giả đã sử dụng 100 primer khác nhau, trong đó 20 primer tạo ra các sản phẩm đa hình và có tính lặp lại đã được chọn lọc. Có tổng cộng 1.050 band được tạo thành, trung bình là 52,5 band trên mỗi primer hay 70 band đối với mỗi nguồn vật liệu di truyền được nghiên cứu. Kích thước của các sản phẩm khuếch đại thay đổi từ 0,4 đến 3,0 kb. Trong số 137 sản phẩm khuếch đại có 129 band là đa hình, tương ứng với 92,4%. Khoảng cách di truyền giữa các giống nghiên cứu thay đổi từ 0,16 đến 0,62; giá trị trung bình là 0,37. Mười lăm mẫu nghiên cứu đã được xếp vào 3 nhóm theo thuật toán UPGMA dựa trên các dữ liệu RAPD. Ngoài ra, tất cả 15 mẫu có thể được phân biệt dễ dàng bởi sự có mặt của 20 chỉ thị RAPD và sự vắng mặt của 11 chỉ thị [30]. Chuối được xem là một loài cây ăn quả có giá trị kinh tế và là một loại thực phẩm ăn kiêng rất tốt. Jain và cs (2007) đã phân tích mối quan hệ di truyền của 4 giống chuối khác nhau được trồng ở miền Nam Ấn Độ (Grand Naine, Red Banana, Nendran và Rasthali) bằng kỹ thuật RAPD với 3 primer (OPA19, OPB18, OPD16). Kết quả có 43,47% sản phẩm khuếch đại là band đơn hình, chung cho tất cả các kiểu gen, trong khi đó có 30,43% là band duy nhất, nhưng chỉ có 26,08% thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gene này. Trong số các primer đã chọn, primer OPB18 tạo ra số lượng band đa hình cao nhất (4 band), tiếp theo là primer OPA19 và primer OPD16 (1 band). Các ma trận khác nhau đã được tính toán bằng cách sử dụng chỉ số SED (squard euclidean distance) để ước đoán sự khác nhau của tất cả các cặp trong sản phẩm khuếch đại, chương trình được xây dựng bởi phương pháp của Ward sử dụng thuật toán phương sai nhỏ nhất. Sự phân tích cụm thể hiện 4 kiểu gen được xác định bằng chương trình của Grandnaine và Rasthali. Giá trị sai khác về mặt di truyền từ 2,82%-3,6%, sự sai khác lớn nhất là 3,6% được phát hiện giữa hai giống Red banana và Rasthali, và thấp nhất là ở hai giống Nendran và Rashali (2,23%) [43]. Santos và cs (2010) đã sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm xác định đặc điểm phân tử của 7 mẫu chuối (Borneo, Grand Naine, 1304-06, 4249-05, 0337-02, 0323-03 và 4279-06) với khả năng kháng giun tròn Radopholus similis. Có tổng cộng 521 chỉ thị RAPD tạo thành từ 36 primer, tương ứng với 14,5 chỉ thị trên mỗi primer, trong đó 420 (81%) là đa hình, bao gồm cả 140 (27%) chỉ thị có tiềm năng cho ứng dụng trong các nghiên cứu lập bản đồ di truyền về khả năng đề kháng R. similis. Trong số các primer sử dụng, chỉ có 2 primer (OPH-04 và OPF-20) không tạo ra các band có ở các mẫu đề kháng và vắng mặt ở tất cả các mẫu mẫn cảm. Do đó, có đến 96% primer có khả năng tạo thành ít nhất 1 band triển vọng cho việc lập bản đồ di truyền. OPE-15, OPH-17 và OPG- 09 là những primer tạo ra số band tiềm năng lớn nhất (theo thứ tự là 12, 8 và 8). Khoảng cách di truyền giữa những mẫu nghiên cứu thay đổi từ 0,106 đến 0,455 với khoảng cách lớn nhất là giữa mẫu Borneo và kiểu gen 4279-06, được đánh giá tương ứng với mẫu nhạy cảm nhất và mẫu đề kháng cao nhất đối với giun tròn tùy thuộc yếu tố sinh sản. Thuật toán sắp nhóm dựa trên khoảng cách di truyền đã xếp 7 mẫu nghiên cứu vào ít nhất 3 nhóm, trong đó các kiểu gen có khả năng đề kháng cao nhất được xếp vào cùng một nhóm [59]. Đối với quả lê Nhật (Pyrus pyrifolia Nakai), màu sắc của vỏ quả là một đặc điểm rất quan trọng đối với cây trồng bởi vì vỏ màu nâu đỏ giúp bảo vệ quả chống lại những tác động từ bên ngoài như dịch bệnh, côn trùng, ảnh hưởng của thời tiết... Inoue và cs (2006) đã sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm xác định chỉ thị có liên quan đến các gen có vai trò quyết định màu sắc của vỏ quả. Các dạng cây con F1 của hai phép lai của ‘Kousui’ - ‘Kinchaku’ (KK) và ‘Niitaka’ - ‘Chikusui’ (NC) được phân biệt bởi màu sắc vỏ quả đã được sử dụng cho phép phân tích. Bốn dạng khác nhau của DNA tổng số, KK với vỏ quả màu nâu đỏ (KK-R) và KK với vỏ quả màu xanh (KK-G), tương tự là NC-R và NC-G, đã được sử dụng cho phân tích RAPD với 200 primer ngẫu nhiên. Sau hai phép phân tích độc lập, có tổng cộng 893 band đã được xác định, số lượng band trung bình trên mỗi primer là 4,5. Kết quả thu được cho thấy, các band đặc hiệu có liên quan đến đặc tính vỏ màu nâu đỏ đã không thu được trong thí nghiệm này, chỉ có duy nhất band OPH19425 có liên quan với tính trạng vỏ quả màu xanh (KK-G và NC-G). Mặc dù chỉ có 86,4% DNA các cây có vỏ quả màu xanh tạo ra band này khi thực hiện phản ứng RAPD nhưng có đến 94,3% các cây có vỏ quả màu nâu đỏ không tạo ra sản phẩm khuếch đại này. Chỉ thị RAPD OPH19425 có thể phân biệt được các cây có vỏ quả màu xanh với tỉ lệ lên đến 92% [41]. 2. Các kỹ thuật khác Bên cạnh kỹ thuật RAPD, có rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác được sử dụng để xác định sự khác nhau giữa các dạng thuộc chi Citrus, bắt đầu từ những nghiên cứu isozyme vào cuối những năm 1970 (Torres và cs, 1978), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP) vào những năm 1980 và đầu những năm 1990, và gần đây nhất là các marker AFLP, SSR, ISSR (Fang và Roose,1997; Bretó và cs, 2001; Sankar và Moore, 2001). Bức tranh tổng thể được dựng lên từ những nghiên cứu này là sự đa dạng rất lớn từ các nhóm loài tổ tiên thuộc chi Citrus, đặc biệt là quýt và bưởi [58]. RFLP (Restriction fragment length polymorphism-đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn) thể hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Phân tích RFLP đã được sử dụng thành công khi nghiên cứu đa dạng di truyền ở rất nhiều loài cây ăn quả như Prunus (Badenes và Parfitt, 1995), Diospyros (Yonemori và cs, 1998) và Mangifera (Eiadthong và cs, 1999) [19]. SSR (simple sequence repeat) là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế primer. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. SSR primer sau đó được sử dụng tương tự như các RAPD primer. SSR là một marker đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy vì vậy đã được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây trồng như cam chanh (Nunes và cs, 2002; Golein và cs, 2005), táo (Guilford và cs, 1997) và nho (Tomas và Scott, 1993) [37], [38]. Mười lăm cặp primer SSR đã được sử dụng để đánh giá mức độ đa hình trong 23 kiểu gen Citrus và 4 dạng lai tự nhiên hay đột biến chồi mà đã được chọn lọc từ Kotra Germplasm Bank (Iran). Tất cả 15 locus thí nghiệm ở thực vật có múi đều có mức độ đa hình cao, với số lượng allele trên mỗi locus thay đổi từ 4 ở TAA41 đến 12 ở CAT01, ATC09, AG14 (trung bình 8,27 allele trên mỗi locus). Thuật toán phân tích nhóm với chỉ thị SSR đã xếp các mẫu nghiên cứu vào trong 2 nhóm: nhóm A gồm Yuzo và Poncirus; nhóm B bao gồm 3 phân nhóm riêng biệt: (i) giống Fortunella sp; (ii) phân nhóm quýt: Citrus reticulate (C. clemantin), C. sinensis (Pineapple, Washington Navel), các dạng tự nhiên (Siahvaraz, Shalmahaleh, Moallemkoh và 4 dạng lai Kotra), và (iii) C. limon (Amol lemon - pear, Eureka, Rough Lemon), C. aurantifolia, C. aurantium, C. medica và C. grandis [44]. Sự đa dạng di truyền của 122 mẫu bưởi (Citrus grandis Osbeck) và các giống họ hàng của chúng đã được xác định bằng chỉ thị SSR. Yong và cs (2006) đã sử dụng 31 cặp primer SSR, kết quả tạo thành tổng cộng 34 locus và 335 band (90-335 bp), trong đó 332 band là đa hình, trung bình 10,81 band trên mỗi primer và 9,85 allele trên mỗi locus. Tỷ lệ của các locus đa hình là 99,1%. Trong tất cả các locus xác định, giá trị thông tin đa hình allele (PIC) thay đổi từ 0,1939 đến 0,9073; trung bình 0,7085 trên mỗi primer. Phân tích cây phả hệ UPGMA cho thấy các mẫu nghiên cứu có thể được xếp vào 7 nhóm trong đó nhóm 1 bao gồm các mẫu bưởi chùm (110 mẫu); nhóm 2 là C. hongheensis (3 mẫu); nhóm 3 là C. macroptera (1 mẫu); nhóm 4 tạo thành từ C. yichangensis (2 mẫu); nhóm 5 bao gồm C. reticulate, C. daoxianensis 1, C. daoxianensis 2 and C. tachibana; nhóm 6 là C. indica và nhóm 7 có C. mangshanensis. Trong số đó, các mẫu bưởi chùm có thể được chia vào 7 phân nhóm với hệ số tương đồng là 0,712 [48]. ISSR (inter-simple sequence repeats) là kỹ thuật đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu đa dạng di truyền (Kantety và cs, 1995; Charters và cs, 1996), và đã được dùng để phân biệt giữa các giống cây Citrus khó thực hiện bởi các marker phân tử khác (Fang và Rose, 1997). Mối quan hệ di truyền giữa các giống chanh thương mại (C. limon) đã được Capparelli và cs (2004) phân tích bằng kỹ thuật ISSR và phân tích dòng chuỗi (flow cytometry). Hai giống với các đặc điểm khá giống nhau đã được phân biệt bằng cách sàng lọc với 10 SSR primers và xác định hàm lượng DNA trong nhân trước khi nhuộm [27]. Shahsavar và cs (2007) đã sử dụng chỉ thị ISSR để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa 33 cây thuộc chi Citrus ở tỉnh Fars, Iran. Cây phát sinh loài đã được xây dựng dựa trên 234 đoạn ISSR (209 đoạn đa hình) bằng thuật toán phân tích nhóm UPGMA. Ba mươi ba cây trên đã được phân vào sáu nhóm chính với giá trị tương đồng trong nhóm ≥ 0,65. Nhóm 1 gồm C. sinensis và C. reticulata; nhóm 2 gồm các loài cam chua bình thường và cam chua ‘Peach’; nhóm 3 gồm ‘Bakraee’, Volkameriana và 3 dạng chọn lọc của chanh lá cam. ‘Bakraee’ là một dạng chưa xác định với đặc điểm hình thái học tương tự với cả chanh lá cam ngọt và quýt. Đây có thể là dạng lai giữa hai loài này. Nhóm 4 bao gồm chanh Lisbon (C. limon) và hai dạng chọn lọc chưa xác định ‘Rock lemon’ và ‘Pear-shaped lemon’. Nhóm 5 bao một kiểu gen duy nhất (D3) với sự tương đồng phân tử thấp nhất so với những kiểu gen khác. Nhóm 6 có thể được chia thành 2 nhóm phụ, nhóm phụ 1 bao gồm thanh yên (C. medica) và 3 dạng ‘Otroj’, ‘Bidkhoni’ từ Darab và ‘Bidkhoni’ từ Fassa. Dựa trên đặc điểm hình thái và phân tử tương tự với thanh yên thì 3 dạng này có thể được xem là các biến thể của thanh yên. Nhóm phụ còn lại bao gồm C. aurantifolia, C. latifolia và 11 kiểu gen chưa xác định với đặc điểm hình thái và phân tử giống với chanh lá cam [61]. AFLP (Amplified fragment length polymorphism-sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại) là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài và các primer thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài. Có nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng như bưởi chùm (Cervera và cs, 1998), dừa (Pepera và cs, 1998), đu đủ (Kim và cs, 2002), Carya illinoinensis (Beedanagari và cs, 2005) [24]. Quả không hạt là một tính trạng mong muốn ở những cây thuộc chi Citrus và là mục tiêu quan trọng trong nhân giống. JinPing và cs (2009) đã sử dụng kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại AFLP để tìm ra các chỉ thị phân tử cho quýt không hạt Ponkan (C. reticulata Blanco). Tác giả đã chọn ra được 5 cặp primer có liên quan trực tiếp đến tính trạng mong muốn sau khi sàng lọc 72 cặp primer, sự bắt cặp này đã được kiểm tra bằng phân tích AFLP từ các nhóm cá thể. Năm đoạn khuếch đại đã được tạo dòng, phân tích trình tự và so sánh tương đồng, kết quả cho thấy 4 chỉ thị có sự tương đồng cao với các gen chức năng, điều này có thể giúp hiểu được cơ chế phân tử của tính trạng không hạt ở chi Citrus. Dựa trên các thông tin về trình tự, 8 primer đặc hiệu đã được thiết kế và 2 đoạn AFLP-2 và AFLP-5 đã được chuyển đổi thành công sang dạng chỉ thị SCAR (sequence characterized amplified region). Vì vậy, có thể đẩy nhanh các chương trình chọn giống bằng cách sàng lọc các đột biến không hạt dựa trên các chỉ thị đã được chọn lọc [45]. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Bưởi: Citrus grandis (L.) Osbeck Thuộc chi: Citrus Họ cam quýt: Rutaceae Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 18 giống bưởi thu thập được ở nhiều vùng khác nhau, mỗi giống tiến hành thu 3 mẫu ở 3 cây. Các giống bưởi này về mặt hình thái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái. Sau khi tách chiết, điện di kiểm tra DNA tổng số và chạy PCR-RAPD thử nghiệm với một số primer, chúng tôi đã lựa chọn mỗi giống một mẫu DNA tổng số có khả năng khuếch đại tốt để làm khuôn mẫu cho các phản ứng PCR-RAPD tiếp theo. Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi STT Giống bưởi Địa điểm thu mẫu 1 Bưởi Thanh Trà Thủy Biều, Huế 2 Bưởi Năm roi Ấp An Thiên, huyện Mỏ Cày Nam, Bến Tre 3 Bưởi Da xanh Bến Tre 4 Bưởi Phúc Trạch Quảng Bình 5 Bưởi Bành Thủy Biều, Huế 6 Bưởi Láng Thủy Biều, Huế 7 Bưởi Tàu Thủy Biều, Huế 8 Bưởi Trẹm Thủy Biều, Huế 9 Bưởi Thanh du Thủy Biều, Huế 10 Bưởi Đỏ Thủy Biều, Huế 11 Bưởi Hồng da xanh Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp Huế 12 Bưởi Cốm Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp Huế 13 Bưởi Trắng Lại Bằng, Huế 14 Bưởi Thái Lan Lại Bằng, Huế 15 Bưởi Trụ lông Quảng Nam 16 Thanh trà Tiên Phước Quảng Nam 17 Bưởi Đường lá goắn Bến Tre 18 Bưởi Hải Phòng Quảng Bình II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đồ án của chúng tôi được tiến hành từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2011 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gene, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế. 1. Tách chiết genomic DNA DNA được tách chiết từ lá của các giống bưởi theo phương pháp của Ahmed và cs (2009) [20] có cải tiến: cắt lá bưởi (200 mg) thành từng mảnh nhỏ, đồng hóa mẫu với 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM NaCl). Sau đó thêm 40 µL SDS 20%, vortex 30 giây rồi ủ ở 65oC trong 30 phút. Mẫu được chiết 2 lần với cùng thể tích của hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại bỏ protein và lấy dịch trong chứa DNA hòa tan ở pha trên. Loại polysaccharide bằng ether hydrat hóa. Kết tủa DNA bằng ethanol 100% lạnh trong 30 phút ở -20oC. Thu kết tủa DNA bằng ly tâm 11.000 vòng/phút, ở 25oC trong 12 phút. Rửa tiểu thể DNA bằng ethanol 70%. Hòa tan tiểu thể bằng nước cất vô trùng, thêm 1 µL RNase, bảo quản ở -20oC dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR-RAPD. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ trên máy NanoDrop ND-1000 (Thermo, Mỹ). 2. Phân tích RAPD DNA tổng số của lá bưởi được dùng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR-RAPD. Hỗn hợp phản ứng PCR-RAPD bao gồm 10 pmol primer ngẫu nhiên, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP mỗi loại, 0,625 unit/µl Taq DNA polymerase (PCR Master Mix 2×, Fermentas, Đức); 25 ng DNA khuôn mẫu với tổng thể tích phản ứng là 25 µl. Phản ứng PCR-RAPD được thực hiện theo phương pháp của Coletta Filho và cs (1998) [31] với 25 primer ngẫu nhiên (Operon Technologies, CA) (Bảng 2.2). Quy trình phản ứng khuếch đại PCR: biến tính 92oC/2 phút; 42 chu kỳ: 92oC/1 phút, 36oC/1 phút, 72oC/2 phút; và cuối cùng là 72oC/10 phút. Sản phẩm PCR-RAPD được điện di trên agarose gel 1,4% và nhuộm bằng ethidium bromide 0,006%. Hình ảnh điện di được thu nhận bằng hệ thống Gel Documentation và phân tích bằng chương trình Quantity One (Bio-Rad, Mỹ). Bảng 2.2. Trình tự của các primer sử dụng STT Primer Trình tự 5’-3’ Tài liệu tham khảo 1 A02 TGCCGAGCTG Vũ Thị Nhuận và cs, 2005 [13] 2 A04 AATCGGGCTG Vũ Thị Nhuận và cs, 2005 [13] 3 A18 AGGTGACCGT Shaaban và cs, 2006 [60] 4 A15 TTCCGAACCC Shaaban và cs, 2006 [60] 5 C09 CTCACCGTCC Shaaban và cs, 2006 [60] 6 B05 TGCGCCCTT C Andrade-Rodriguez và cs, 2004 [21] 7 8 B17 B10 AGGGAACGAG CTGCTGGGAC Andrade-Rodriguez và cs, 2004 [21] Cevik và cs, 2007 [28] 9 C02 GTGAGGCGTC Cevik và cs, 2007 [28] 10 C04 CCGCATCTAC Cevik và cs, 2007 [28] 11 B04 GGACTGGAGT Cevik và cs, 2007 [28] 12 C05 GATGACCGCC Cevik và cs, 2007 [28] 13 C08 TGGACCGGTG Cevik và cs, 2007 [28] 14 AA10 TGGTCGGGTG Rao và cs, 2008 [57] 15 AD10 AAGAGGCCAG Rao và cs, 2008 [57] 16 A11 CAATCGCCGT Cai và cs, 1994 [26] 17 A09 GGGTAACGCC Cai và cs, 1994 [26] 18 A01 CAGGCCCTTC Coletta Filho và cs, 1998 [31] 19 AT14 GTGCCGCACT Coletta Filho và cs, 1998 [31] 20 N09 TGCCGGCTTG Orbović và cs, 2008 [54] 21 L17 CTGCAATGGG Mariniello và cs, 2004 [51] 22 M20 GGTGCACGTT Elisiario và cs, 1999 [35] 23 K16 GAGCGTCGAA Elisiario và cs, 1999 [35] 24 N06 GAGACGCACA Yi và cs, 2006 [64] 25 N02 ACCAGGGGCA Yi và cs, 2006 [64] 3. Xây dựng giản đồ phả hệ Xây dựng giản đồ phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán UPGMA dựa trên hệ số Jaccard (1908) [42] bằng phần mềm NTSYS 2.1 (Exeter Software, Mỹ) trên cơ sở xuất hiện hay không xuất hiện của các band trên phổ điện di sản phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các primer theo nguyên tắc đánh số "1" nếu có xuất hiện band và số "0" nếu không xuất hiện band. Các band được ký hiệu bằng tên primer khuếch đại và kích thước của band đó. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. CHẤT LƯỢNG DNA TỔNG SỐ Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá của 18 giống bưởi nghiên cứu theo phương pháp của Ahmed và cs (2009) [20] có cải tiến. Sản phẩm tách chiết DNA tổng số được điện di trên agarose gel 0,8% và đo độ hấp thụ quang (OD260/280) để xác định nồng độ và kiểm tra chất lượng. Kết quả kiểm tra cho thấy DNA tổng số của 18 mẫu nghiên cứu khá sạch (tỷ lệ hấp thu ở bước sóng 260/280 nm từ 1,73-1,81), ít bị đứt gãy và nồng độ các mẫu tương đối đồng đều. Chất lượng và nồng độ DNA của các mẫu đáp ứng yêu cầu cho các phản ứng PCR-RAPD. Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình 3.1. DNA tổng số của các giống bưởi nghiên cứu Hình 3.1. DNA tổng số của các giống bưởi nghiên cứu M: marker Lambda/HindIII, 1: Bưởi Thanh trà, 2: Bưởi Năm roi, 3: Bưởi Da xanh, 4: Bưởi Phúc Trạch, 5: Bưởi bành, 6: Bưởi láng, 7: Bưởi Tàu, 8: Bưởi trẹm, 9: Bưởi Thanh du, 10: Bưởi đỏ, 11: Bưởi Hồng da xanh,12: Bưởi cốm, 13: Bưởi trắng, 14: Bưởi Thái Lan, 15: Bưởi Trụ lông, 16: Thanh trà Tiên Phước, 17: Bưởi Đường lá goắn, 18: Bưởi Hải Phòng Bảng 3.1. Tỷ lệ hấp thụ ở bước sóng 260/280 nm và nồng độ và của các mẫu DNA từ lá Mẫu A260/280 ng/µL Bưởi Thanh trà 1,75 236,8 Bưởi Năm roi 1,62 195,0 Bưởi Da xanh 1,73 330,8 Bưởi Phúc Trạch 1,73 309,5 Bưởi bành 1,73 294,1 Bưởi láng 1,70 323,1 Bưởi Tàu 1,79 250,7 Bưởi trẹm 1,79 213,4 Bưởi Thanh du 1,77 280,3 Bưởi đỏ 1,73 319,6 Bưởi Hồng da xanh 1,72 304,8 Bưởi cốm 1,73 277,3 Bưởi trắng 1,81 218,6 Bưởi Thái Lan 1,69 335,5 Bưởi Trụ lông 1,72 189,7 Thanh trà Tiên Phước 1,70 219,7 Bưởi Đường lá goắn 1,69 259,2 Bưởi Hải Phòng 1,71 258,6 II. ĐA HÌNH DNA CỦA CÁC GIỐNG BƯỞI Hai mươi lăm primer ngẫu nhiên đã được sử dụng để phân tích đa hình DNA của 18 giống bưởi nghiên cứu. Kết quả phân tích sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,4% cho thấy tổng cộng có 298 band DNA được tạo ra. Primer có số band DNA khuếch đại nhiều nhất là L17 (22 band), tiếp đến là C05 (21 band) và A02 (20 band). Hai primer có số band DNA khuếch đại ít nhất là B05 và AD10 (4 band). Trong số 25 primer sử dụng có 8 primer (A02, A18, B10, C02, C08, AD10, AT14, N06) cho sản phẩm khuếch đại ở tất cả 18 giống bưởi, tiếp theo là sáu primer (A04, C09, B17, AA10, N09, K16) với 17 giống được khuếch đại. Primer có số giống bưởi khuếch đại ít nhất là A01 (14 giống) (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Số cây khuếch đại và số band khuếch đại của từng primer STT Primer Số cây khuếch đại Tổng số band DNA của từng primer Phạm vi kích thước band DNA (bp) Số band DNA đa hình (%) Số band DNA duy nhất 1 A01 14 6 346-838 100 0 2 A02 18 20 429-2.194 95,0 2 3 A04 17 12 287-1.431 100 1 4 A09 16 12 540-1.667 100 4 5 A11 16 16 476-2.079 100 4 6 A15 16 13 436-3.836 100 0 7 A18 18 6 359-2.353 83,33 2 8 AA10 17 9 429-2.259 100 2 9 AD10 18 4 400-982 100 1 10 AT14 18 12 335-1.997 91,67 2 11 B04 15 13 320-1.702 100 4 12 B05 16 4 630-1.187 100 0 13 B10 18 8 360-1.444 100 3 14 B17 17 6 471-1.779 100 1 15 C02 18 16 444-2.169 100 3 16 C04 16 11 352-1.733 100 3 17 C05 16 20 422-2.770 100 3 18 C08 18 10 346-1.317 100 3 19 C09 17 15 418-2.467 100 1 20 M20 16 15 313-1.913 100 1 21 N02 16 12 302-1.932 100 3 22 N06 18 10 348-1.045 100 4 23 N09 17 12 497-1.813 100 4 24 L17 16 22 381-2.873 100 0 25 K16 17 13 425-2.525 100 4 Tổng 298 295 55 Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tất cả các primer đều biểu hiện sự đa hình, số lượng band khuếch đại là từ 4 đến 22 band tùy primer và mẫu DNA. Kích thước của các band khoảng từ 287 bp đến 3.836 bp. Trong số 298 band DNA tạo thành có 295 band là đa hình (98,99%), tỷ lệ band đa hình trên mỗi primer là 11,8; cao hơn so với nghiên cứu trên một số giống bưởi trồng ở Việt Nam của Nguyễn Xuân Thụ và cs (9,54) [17]. Tỷ lệ các band đa hình cao chứng tỏ các giống bưởi nghiên cứu có quan hệ di truyền xa nhau. Trong số 295 band đa hình có đến 55 band DNA duy nhất, chiếm 18,46%. Các band DNA này chỉ xuất hiện ở một giống bưởi mà không xuất hiện ở các giống bưởi còn lại, do đó chúng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu nhằm phân biệt các giống bưởi khác nhau. Trong 18 giống bưởi nghiên cứu có 14 giống được đặc trưng bởi ít nhất 1 band DNA duy nhất khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD với 25 primer, trong đó nhiều nhất là giống bưởi Đường lá goắn tạo thành 9 band từ 6 primer, tiếp đến là giống bưởi Thái Lan có 5 band từ 5 primer và bưởi Trắng có 5 band từ 4 primer. Như vậy có thể bước đầu nhận định rằng ba giống bưởi này có sự sai khác đáng kể so với các giống còn lại. Bốn giống bưởi không tạo thành band duy nhất với tất cả primer sử dụng là bưởi Da xanh, bưởi Bành, bưởi Tàu và bưởi Hồng da xanh. Bảng 3.3 biểu thị các chỉ thị RAPD đặc hiệu cho 14 trong số 18 giống bưởi nghiên cứu. Bảng 3.3. Các chỉ thị RAPD đặc trưng cho các giống bưởi nghiên cứu Giống Chỉ thị RAPD đặc trưng Bưởi Thanh trà C09-1.289, AT14-589, AT14-335, N06-443 Bưởi Năm roi AA10-740, B10-360, N09-880, N09-540 Bưởi Phúc Trạch A09-1.667, AD10-500, M20-542 Bưởi Láng A04-287, A18-726, N02-836, N06-655 Bưởi Trẹm A11-674, A18-1.811 Bưởi Thanh du K16-2.027 Bưởi Đỏ B04-1.143, C04-890, N02-325, N02-302 Bưởi Cốm A02-2.194, B04-520, B04-320 Bưởi Trắng A11-782, C04-1.041, C08-630, C08-477, N06-885 Bưởi Thái Lan A02-1.031, A09-1.092, A11-1.002, B17-471, C08-675 Bưởi Trụ lông C02-680, B10-1.094, B10-855 Thanh trà Tiên Phước A11-476, C02-771, K16-1.222, K16-737 Bưởi Đường lá goắn A09-1.372, A09-1.166, AA10-882, C02-1.004, C05-2.027, C05-811, N09-1.099, N09-904, K16-818 Bưởi Hải Phòng N06-762, B04-1.702, C04-352, C05-706 416 bp 780 bp 23130 bp 4361 bp 2027 bp 564 bp 287 bp 1237 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.2. Hình ảnh điện di PCR-RAPD với primer A04 Hình 3.2 biểu thị kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD của 18 giống bưởi nghiên cứu với primer A04, trong đó có band A04-287 đặc trưng cho giống bưởi Láng. Trong số 25 primer sử dụng có 21 primer có khả năng tạo th