Đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của cây lá ngón Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae

ng cồn, khó tan trong ether, không tan trong nước. Tan trong nước acid. Đây là thành phần chủ yếu của cây chất này không độc lắm. + Kuminin: vô định hình không màu, dễ tan trong ether và nhiều dung môi hữu cơ, khó tan trong nước, tan trong nước acid. + Kuminixin: là chất vô định hình. + Kuminidin: có tinh thể hình trụ, không màu, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ và nước. Tỷ lệ cả 4 loại alcaloid trên là 0,3%. Vào năm 1936 F.Guichard nghiên cứu từ cây lá ngón mọc ở Việt Nam đã chiết từ lá, vỏ thân và rễ được những chất giống như lá ngón Trung Quốc. Tác giả đã thấy chất kumin có cả trong quả và hạt, ngoài ra còn tìm thấy một chất có huỳnh quang dưới đèn tử ngoại, không tan trong acid và ghi là chất thuộc nhóm esculetin. [12] Năm 1953 M.M Janot xác định lá ngón Việt Nam có chứa gelsemin ở lá, kumin ở thân, rễ và sempervinrin ở các bộ phận của cây. Năm 1971 Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi và Lương Văn Thịnh chiết được kumin từ rễ cây lá ngón mọc ở Hoà Bình.[1] Hoàng Như Tố đã phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thấy có 15 vết Alcaloid ở cây lá ngón trong đó đã tách được gelsemin và kumin.[1] Gelsemin Sempervirin 1.3. Độc tính và tác dụng sinh học Cây lá ngón là một loại cây rất độc, không được nhân dân ta dùng làm thuốc mà chỉ dùng với mục đích tự tử hay đầu độc. Nhưng ở Trung Quốc người dân lại hay dùng làm thuốc chữa hủi hay chữa bệnh nấm tóc [12]. Theo Võ Văn Chi, [4], thì cây lá ngón có thể dùng làm thuốc, bộ phận dùng là rễ, thân, lá. Nó có vị cay, đắng, tính nóng, rất độc có tác dụng thanh nhiệt, tiêu thũng, hạt có độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa. Có công dụng là: điều trị eczema, nấm ở chân, ở thân, đòn ngã tổn thương, đụng giập, trĩ, tràng nhạc, đinh nhọt và viêm mủ da, điều trị phong hủi. Giã cây tươi đắp ngoài hoặc nấu nước rửa ngoài mà không được dùng uống trong.[4] Trong cây lá ngón mọc ở Bắc Mỹ: thành phần chủ yếu là chất gelmixin, có độc tính rất mạnh. Với liều thấp trên động vật có vú, trước khi thấy hiện tượng ức chế hô hấp thường thấy một thời kỳ hưng phấn ngắn.[12] Trong cây lá ngón của ta và Trung Quốc có thành phần khác nhưng so với tác dụng của những alcaloid của cây lá ngón Bắc Mỹ thì nhiều phần giống nhau. Chất kumin và kuminin ít độc hơn, gần giống tác dụng của gelsemin. Chất kuminixin rất độc, nhưng chất gelsemixin lại độc hơn nữa. Nhỏ dung dịch gelsemin và gelsemixin lên mắt thì thấy hiện tượng giãn đồng tử còn kumin và kuminin không làm giãn đồng tử.[12] Ngoài thành phần hoá học, Hoàng Như Tố còn kiểm tra truyền thuyết dân gian nói: “chỉ ăn 3 lá là đủ chết người" đồng thời tìm cơ chế tác dụng của lá ngón để tìm cách chống độc có hiệu quả đã đi tới một số kết luận sau: Liều độc: LD50 đối với chuột nhắt trắng của rễ là 102mg/kg thể trọng (chiết bằng cồn 900), của lá là 600mg/kg (dược liệu tươi chiết bằng nước), 200mg/kg (lá khô chiết bằng nước), 150mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 700), 89mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 900), của alcaloid toàn phần chiết từ lá khô là 200mg/kg, trong khi đó của gelsemin là 140mg/kg và kumin thì không độc. Như vậy, lá ngón có độc nhưng không đến mức 3 lá đủ chết người như dân gian thường nói. Tác dụng độc của lá ngón không đặc hiệu trên hệ thống thần kinh, gây nên co giật và chết do ngừng hô hấp trong một trạng thái thiếu oxy rõ rệt. Nghiêu cứu về mặt chống độc, cho phép kết luận cơ chế tác dụng của các hoạt chất cây lá ngón chủ yếu đánh vào các men hô hấp, gây sự rối loạn trong tế bào dẫn tới sự thiếu oxy nghiêm trọng gây nên tình trạng co giật cơ và liệt cơ. Phương hướng dùng các thuốc ngăn cản sự ức chế men và bảo trợ men đã dẫn tác giả tìm ra được tính chống độc của ATP. Khi dùng ATP để ngăn ngừa cũng như để điều trị ngộ độc bằng lá ngón đã giảm tỷ lệ chết của chuột nhắt trắng từ 58% xuống còn 25%, đã cứu được tất cả các thỏ làm thí nghiệm khi đã bị ngộ độc bằng liều chết của lá ngón.[12] Dù đã nghiên cứu như vậy nhưng việc phát hiện các chất độc trong cơ thể khi bị ngộ độc lá ngón còn rất khó khăn, vì phản ứng được tiến hành trên những chất lấy được ở cơ thể người bị ngộ độc là một việc không phải dễ dàng.[12] Chất độc chính trong cây lá ngón là các alcaloid như gelsemin, kumidin và kumin có trong toàn cây, độc nhất là ở rễ và lá non. Ngộ độc với triệu chứng như khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt răng cắn chặt, sùi bọt mép, hạ thân nhiệt, hạ huyết áp, hô hấp chậm rồi chết. Cách giải độc: Phải nhanh chóng loại chất độc ra khỏi cơ thể bằng cách gây nôn và rửa ruột (nôn ra sớm thì sống, chậm thì chết).[9] Theo kinh nghiệm truyền thống thì cho uống thật nhiều nước sắc cam thảo. Tiêm truyền huyết thanh mặn hay ngọt, giữ cơ thể ấm. Nếu hạ huyết áp thì dùng ephedrine, khó thở thì dùng niketamid cho thở oxy hoặc hô hấp nhân tạo, đau bụng thì dùng thuốc giảm đau.[9] Phần II Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu - Nguyên liệu là rễ, thân và lá của cây lá ngón có hoa thu hái tại xã An Châu, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang vào tháng 02/2003. - Nguyên liệu sau khi thu hái được thái nhỏ sấy khô ở nhiệt độ 40-500C sau đó được bảo quản trong túi bóng lớn, kín. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu về mặt thực vật học Quan sát hình thái bên ngoài bằng cảm quan theo tài liệu [1],[2],[12]. Cắt và quan sát vi phẫu: Rễ, thân, lá trên kính hiển vi quang học tại bộ môn dược liệu theo tài liệu thực tập [2],[8]. Soi bột và mô tả các đặc điểm của bột rễ, thân, lá theo tài liệu [2],[8],[13]. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học trong cây lá ngón Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá cây. [1],[2] Định lượng alcaloid trong cây theo phương pháp acid base.[2] Xác định độ ẩm trên máy Sartorius ( Germany) tại bộ môn dược liệu. Đo phổ UV trên máy ..... tại Viện kiểm nghiệm Bộ y tế. Đo phổ IR trên máy ....... tại Phòng Hoá, Viện khoa học hình sự. Đo phổ khối trên máy 5989B MS tại Phòng cấu trúc Viện hoá học. Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy ........ tại ............ Đo độ chảy trên máy GALLENKAMP tại bộ môn hoá hữu cơ. PHầN iii Thực nghiệm và kết quả 3.1. Đặc điểm thực vật 3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón Cây bụi leo mọc ở ven rừng, thân nhỏ hoặc vừa không có lông, lá mọc đối, hình trứng thuôn dài hay hơi hình mác, đầu nhọn phía cuống lá nhọn, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 10cm, rộng 5cm, mặt trên của lá mầu sẫm, mặt dưới mầu nhạt hơn, gân lá hình lông chim, có từ 4-7 cặp gân phụ, cuống lá dài 1cm. Hoa nhỏ mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá, bao hoa mầu phớt tím, cánh hoa mầu vàng. Mẫu chúng tôi nghiên cứu đã được GS. Vũ Văn Chuyên định tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae. 3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá, thân và rễ Cấu tạo giải phẫu lá: Hình 2 Mặt cắt ngang có dạng đối xứng hai bên, lá được chia làm hai phần chính, phiến lá và gân lá. - Gân lá: Mặt dưới lồi, mặt trên phẳng hơi lõm. Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình trứng kích thước tương đối lớn xếp đứng, biểu bì dưới tế bào có dạng hình tròn và nhỏ hơn. Mô dày gồm những lớp tế bào tròn, thành dày xếp sát biểu bì trên và biểu bì dưới. Mô mềm cấu tạo từ những tế bào tròn hình mỏng xếp lộn xộn. Cung libe gỗ ở giữa gân lá. Có libe bao quanh cung gỗ. - Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi những tế bào tròn xếp đều đặn thành hàng, tế bào ở phía trên to hơn ở phần biểu bì dưới. Hầu như không quan sát thấy mô dậu. Ngay dưới lớp biểu bì là mô khuyết, các tế bào xếp lộn xộn có nhiều khuyết nhỏ. Cấu tạo giải phẫu thân: Hình 3 Mặt cắt ngang thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: - Lớp bần: Gồm một đến hai hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành dãy. - Mô mềm vỏ: Gồm nhiều tế bào thành mỏng, phía ngoài dẹt, phía trong hình trứng. Trong mô mềm vỏ có các tế bào hoá gỗ và các sợi gỗ xếp riêng lẻ, hoặc thành từng đám. - Libe: xếp thành từng bó, phía ngoài libe có các sợi thành dầy, xếp thành từng đám. - Gỗ: Mô gỗ khá dầy có các mạch gỗ lớn xếp trong mô gỗ, bị các tia ruột thành dầy hoá gỗ chia ra tầng bó. Mô gỗ liên tục càng vào phía trong các mạch gỗ nhỏ dần, phần ngoài tia ruột có nhiều tinh thể canxi oxalat hình khối. - Libe quanh tuỷ tạo thành một cung liên tục nằm ở giữa gỗ và mô mềm ruột. - Mô nềm ruột: Gồm các tế bào thành mỏng xếp lộn xộn tạo nhiều chỗ khuyết. * Cấu tạo giải phẫu rễ: Hình 4 Mặt cắt rễ tròn từ ngoài vào trong có: - Lớp bần: Gồm ba đến bốn hàng tế bào xếp thành dẫy đồng tâm và xuyên tâm, có nhiều chỗ đã bị bong ra. - Mô mềm vỏ: Phần này của rễ mỏng hơn so với ở thân, được cấu tạo bởi những tế bào có thành mỏng. Không có các bó sợi và tế bào hoá gỗ trong mô mềm vỏ. - Libe: Xếp thành từng bó, bên ngoài libe không có các sợi thành dầy hoá gỗ như ở phần thân cây. - Gỗ: Có các mạch gỗ lớn, xếp trong mô gỗ bị các tia ruột thành dầy hoá gỗ chia ra tầng bó vào gần đến tâm. Mô gỗ phía trong liên tục và không có mô mềm ruột. 3.1.3. Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón Hình 5 Bột lá: mầu xanh lục, mùi hắc. Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc điểm sau: - Các mảnh mô mềm - Các mảnh mạch - Các mạch xoắn - Các mảnh biểu bì có lỗ khí - Tinh thể Canxi Oxalat hình khối. Bột thân cây: mầu vàng nhạt. Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc điểm sau: - Có rất nhiều các mảng mạch điểm - Các tế bào màng hoá gỗ. - Các sợi gỗ - Các mảnh mô mềm Bột rễ cây: mầu vàng đậm có mùi hắc. Soi dưới kính hiển vi có các điểm sau: - Tế bào màng hoá gỗ. - Có nhiều các mảng mạch điểm - Các bó sợi và sợi gỗ - Có rất nhiều các hạt tinh bột đứng riêng lẻ hay thành từng đám hai đến ba hạt. - Có các mảnh mô mềm. Nhận xét: Các bộ phận của cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trưng: - Giải phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng, xếp đứng, kích thước lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó gỗ. Bột lá có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào tạo thành khối giống tinh thể canxi oxalat. - Giải phẫu thân và rễ: Mô mềm vỏ của thân có nhiều sợi gỗ thành dầy, khoang hẹp, còn ở rễ thì hầu như không có sợi gỗ ở mô mềm vỏ. Các tia ruột màng hoá gỗ chia gỗ ra từng bó ở phía ngoài, mô gỗ ở phía trong liên tục, tinh thể canxi oxalat hình khối phân bố nhiều ở phần tia ruột cạnh libe của thân. Bột thân và rễ có nhiều tế bào màng hoá gỗ kích thước lớn và các sợi gỗ. 3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học 3.2.1. Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá của cây lá ngón Định tính alcaloid Cân khoảng 10 gam bột dược liệu đã được sấy khô cho vào bình nón dung tích 250ml. Thấm ẩm đều bằng dung dịch NH4OH 10%. Để yên 60 phút. Thêm vào 50ml CHCl3, lắc 5 đ 10 phút rồi để yên qua đêm, lọc. Lấy 30ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 10ml HCl 5%, lắc 2 đ 3 phút, gạn lấy phần acid để làm phản ứng. Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết. ống 1 : Thêm 2 đ 3 giọt TT Mayer đ Có tủa trắng. ống 2 : Thêm 2 đ 3 giọt TT Dragendorff đ Có tủa đỏ gạch. ống 3: Thêm 2 đ 3 giọt TT Bouchardat đ Có tủa đỏ nâu. Nhận xét: Qua kết quả định tính trên ta có thể sơ bộ kết luận trong rễ, thân, lá của cây lá ngón đều có alcaloid. Định tính flavonoid: Lấy khoảng 10 gam dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml thêm 50ml ethanol 900 đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc nóng. Dịch lọc dùng vào các phản ứng sau: + Phản ứng cyanidin: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm thêm một ít bột Mg kim loại sau đó cho từng giọt HCl đặc (3 đ 5 giọt), để yên một vài phút không thấy dung dịch chuyển màu. Phản ứng âm tính. + Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút, màu vàng của dịch chiết không tăng lên. Phản ứng âm tính. + Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5% không có hiện tượng tạo tủa. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Từ kết quả trên sơ bộ kết luận trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có Flavonoid. Định tính coumarin: Cho 5 gam bột dược liệu vào cốc, thêm 50ml cồn 900, đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc qua giấy lọc. Dịch chiết thu được tiến hành làm các phản ứng sau: + Phản ứng mở- đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết. ống 1: Thêm 1ml dung dịch NaOH10%. ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi rồi để nguội. Quan sát: - ống 1: Có mầu vàng - ống 2: Vẫn trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều Quan sát: - ống 1: đục hơn ống số 2 - ống 2: vẫn trong suốt Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì thấy ống 1 vẫn đục như ban đầu. Phản ứng âm tính. + Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, kiềm hoá bằng NaOH 10%, đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt TT Diazo mới pha. Dung dịch trong ống nghiệm không chuyển sang màu hồng hay tím đỏ. Phản ứng âm tính. + Vi thăng hoa: Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng kim loại, đậy lên trên một phiến kính nhỏ có bông tẩm nước lạnh ở trên. Đốt nóng bằng đèn cồn trong 15 đ 20 phút. Lấy phiến kính ra để nguội, nhỏ 1 đ 2 giọt dung dịch KI. Soi trên kính hiển vi không thấy tinh thể nâu sẫm hay tím. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Từ kết quả trên sơ bộ kết luận. Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có coumarin. Định tính tanin: Lấy 3 gam bột dược liệu, cho vào cốc. Thêm 20ml nước cất, đun sôi vài phút rồi lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: + Phản ứng với FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 1 đ2 giọt FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa xanh đen. Phản ứng dương tính. + Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vào vài giọt dung dịch gelatin 1% thấy xuất hiện tủa bông. Phản ứng dương tính. Nhận xét: Sơ bộ nhận thấy trong rễ, thân, lá của cây có chứa tanin. Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết nước vài tinh thể Na2CO3, thấy có bọt khí nổi lên rất rõ. Như vậy trong rễ, thân, lá của cây có acid hữu cơ Định tính antranoid: + Phản ứng Borntraeger: Cho 3 gam bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 15ml H2SO4 10%. Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với ether etylic trong 1 đ 2 phút, để yên cho tách thành 2 lớp. Loại phần nước, cho vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10%. Lắc thấy lớp ether có mầu vàng nhạt. Thêm vào đó dung dịch H2O2. Lắc đều, đun cách thuỷ vài phút dung dịch trở nên không mầu. Phản ứng âm tính. Vậy sơ bộ kết luận: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có Antranoid. Định tính saponin: + Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 5 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh trong 5 phút. Thấy có nhiều bọt xuất hiện và bền vững sau 15 phút. Phản ứng dương tính. + Phản ứng phân biệt saponin sterolic và saponin triterpenic: Cho vào óng nghiệm lớn 0,2 gam bột dược liệu, thêm 5 ml cồn 900 đun sôi, lọc. Bố trí thí nghiệm trong 2 ống nghiệm như sau: ống nghiệm 1 ống nghiệm 2 Sơ bộ kết luận Dung dịch NaOH 0,1N (pH=13) 5 ml 0 Dung dịch HCl 0.1N ( pH=1) 0 5 ml Dịch chiết dược liệu 5 giọt 5 giọt Lắc mạnh trong 1 phút Hiện tượng tạo bọt Cột bọt cao Cột bọt thấp Saponin sterolic Nhận xét: trong rễ, thân, lá của cây lá ngón có saponin. Định tính đường khử: Lấy 2 gam bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml cồn, đun cách thuỷ 10 phút, lọc, cho 1md dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 3 giọt TT Feling A và 3 giọt TT Feling B. Đun cách thuỷ 10 phút thấy có tủa đỏ gạch. Phản ứng dương tính. Kết luận : Có đường khử tự do trong rễ, thân, lá. Định tính chất béo: Nhỏ dịch chiết cloroform lên giấy lọc, hơ khô. Không để lại vết mờ trên giấy lọc. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Không có chất béo trong rễ, thân, lá. Định tính sterol: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 40ml cồn 250 . Ngâm 24 giờ, gạn dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% đến dư, lọc bỏ tủa, lắc dịch lọc với cloroform 2 lần (mỗi lần 10ml trong một bình gạn). Gạn lớp cloroform làm phản ứng: + Phản ứng Salkopski:Trong ống nghiệm nhỏ cho khoảng 2ml cloroform. Thêm từ từ 1ml H2SO4 đặc (nghiêng ống nghiệm 450) cho chảy từ từ dọc theo thành ống nghiệm để có phân lớp.Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm trên bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng. Phản ứng dương tính. + Phản ứng Liebermann: Trong ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết cloroform. Bốc hơi cách thuỷ đến khô. Hoà cắn bằng 1ml anhydrid acetic, lắc đều, thêm từ từ 1ml H2SO4 đặc cho chảy dọc theo thành ống nghiệm để có phân lớp.Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm trên bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng. Phản ứng dương tính. Nhận xét: Dược liệu có sterol trong rễ, thân, lá . Định tính gly cosid tim : Cho 10 g dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 80ml cồn 250 ngâm 24 giờ, gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% dư, lọc bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn và lắc kỹ 2 lần với clorofrom (mỗi lần 20ml), gạn dịch cloroform vào cốc thuỷ tinh khô bốc hơi cách thuỷ đến khô. Cắn được hoà tan trong cồn 900, dịch chiết cồn để làm các phản ứng định tính glycosid tim. + Phản ứng Legal: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch Natri Nitroprusiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% ,không thấy xuất hiện mầu hồng. Phản ứng âm tính. + Phản ứng Baljet: Chuẩn bị thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1ml acid picric1% và 9ml dung dịch NaOH 10% lắc đều. Làm phản ứng: Cho 1ml dịch chiết trong cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ, nhỏ từng giọt thuốc thử baljet vừa mới pha vào ống nghiệm. Không thấy xuất hiện màu. Phản ứng âm tính. + Phản ứng Liebermann: Trong 1 ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết trong cồn 900. Cô cạn cồn, rồi hoà tan cắn bằng 2ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt ống nghiệm nghiêng 450, thêm từ từ H2SO4 theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp, ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có xuất hiện vòng tím đỏ. Phản ứng dương tính. +Phản ứng Keller- Kiliani: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, cho vào đó 1ml FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều, nghiêng ống nghiệm, cho đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm. Không thấy xuất hiện vòng tím đỏ giữa 2 lớp phân cách. Phản ứng âm tính. Kết luận: Không có glycosrd tim trong rễ, thân, lá của cây lá ngón. Định tính acid amin: Trong một ống nghiệm nhỏ cho 2ml dịch chiết nước, thêm vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3% trong ethanol. Đun cách thuỷ 5-10 phút, không thấy xuất hiện màu xanh tím. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Không có acid amin trong rễ, thân, lá. Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây lá ngón. TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Rễ Thân Lá 1 Flavonoid Phản ứng Cyanidin - - - Không có Phản ứng với kiềm - - - Thuốc thử AlCl3 3%/cồn - - - 2 Glycosid Phản ứng Lieberman - - Không có Phản ứng Baljet - - - Phản ứng Legal - - - Phản ứng Keller-Kiliani - - - 3 Đường khử Thuốc thử Fehling A+B + + + Có 4 Alkaloid Thuốc thử Dragendorff +++ ++ + Có Thuốc thử Mayer +++ ++ + Thuốc thử Bouchardat +++ ++ + 5 Coumarin Thuốc thử Diazo - - - Không có Phản ứng mở đóng vòng Lacton - - - Vi thăng hoa - - - 6 Tanin Thuốc thử Gelatin 1% + + + Có Thuốc thử FeCl3 5% + + + 7 Saponin Phản ứng tạo bọt ++ ++ + Có saponin sterolic Phản ứng phân biệt Saponin Sterolic và Triterpenic ++ ++ + 8 Acid hữu cơ Thuốc thử Na2CO3 + + + Có 9 Antranoid Phản ứng Borntraeger - - - Không có 10 Sterol Phản ứng Liebermann Phản ứng Salkopski + + + + + + Có 11 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - - - Không có 12 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin 3% - - - Không có Nhận xét: Qua các phản ứng định tính sơ bộ thấy trong rễ, thân, lá đều có các chất sau: alcaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, sterol, đường khử. 3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng alcaloid: Làm định tính alcaloid trên 3 bộ phận: rễ, thân, lá của cây lá ngón bằng sắc ký lớp mỏng. 3.2.2.1. Chuẩn bị bản mỏng Dùng bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merck), hoạt hoá bản mỏng trong tủ sấy ở 1050C trong 1 giờ. 3.2.2.2. Chuẩn bị dịch chấm sắc ký Cân 10g bột dược liệu làm ẩm bằng NH4OH 10% trong 1h cho vào bình nón dung tích 250 ml, cho 50 ml CHCl3, ngâm qua đêm, lọc, lấy dịch lọc cô còn khoảng 5 ml đem chấm sắc ký. 3.2.2.3. Tiến hành Chấm lên các bản mỏng đã chuẩn bị sẵn cùng lượng dịch chiết rồi khai triển bằng 2 hệ dung môi sau: Hệ I - CHCl3: CH3OH: NH4OH đặc [50 : 9 : 1] Hệ II- Toluen: aceton : C2H5OH : NH4OH đặc [ 45: 45:7:3] Sau đó phun hiện mầu bằng thuốc thử Dragendorff. Trên bản sắc ký xuất hiện các vết có mầu từ vàng đến vàng đậm. So sánh thấy hệ dung môi II tách tốt vì số lượng các vết xuất hiện nhiều và khoảng cách các vết ở xa nhau hơn. Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi II được trình bày ở sắc ký đồ 1 và ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả SKLM STT Rễ Thân Lá Màu Rf Màu Rf Màu Rf V1 Vàng nhạt 0,045 Vàng nhạt 0,044 V2 Vàng đậm 0,270 Vàng đậm 0,270 Vàng 0,270 V3 Vàng 0,315 Vàng nhạt 0,315 Vàng 0,314 V4 Vàng nhạt 0,342 V5 Vàng 0,387 Vàng 0,384 V6 Vàng 0,423 Vàng 0,423 V7 Vàng đậm 0,459 Vàng nhạt 0,458 Vàng nhạt 0,457 V8 Vàng 0,514 Vàng 0,514 Vàng nhạt 0,513 Sắc ký đồ Nhận xét 3.2.3. Định lượng alcaloid toàn phần: 3.2.3.1. Định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá của cây lá ngón bằng phương pháp acid base. Bột dược liệu dùng để định lượng đem xác định độ ẩm trên máy xác định độ ẩm tại bộ môn dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội. Tiến hành: Cân chính xác khoảng 10g dược liệu (đã xác định độ ẩm) thấm ẩm bằng NH4OH đặc (để yên 12 giờ), cho bột dược liệu vào túi lọc rồi đặt vào bình soxhlet. Chiết với dung môi là CHCl3 đến kiệt alcaloid (kiểm tra bằng TT Dragendorff). Cất thu hồi dung môi rồi hoà tan cắn trong HCl 5%, rửa dịch acid bằng ether (rửa 3 lần, mỗi lần 10ml). Kiềm hoá bằng NH4OH đặc đến pH 10 đ11 rồi chiết bằng CHCl3 (chiết 5 lần, mỗi lần 10ml) để lấy hết alcaloid. Tập trung dịch chiết rồi rửa bằng nước cất đến pH 7, để bốc hơi tự nhiên đến khô. Hoà tan cắn bằng một lượng chính xác 10ml HCl 0,1 N thêm nước cất đun sôi để nguội và 3 giọt dung dịch đỏ metyl. Định lượng acid thừa bằng dung dịch NaOH 0,1N. Gọi V là số ml dung dịch NaOH 0,1 N đã định lượng. (10 - v) sẽ là số ml dung dịch acid đã tham gia bão hòa alcaloid, 1ml dung dịch HCl 0,1N tương ứng với 0,0306(g) alcaloid toàn phần, tính theo Kumin. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo Kumin. (10 - V) x 0,0306 x 100 X% = P X: Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu khô tuyệt đối. V: Thể tích NaOH 0,1 N dùng để trung hoà HCl dư P: Khối lượng bột dược liệu đã trừ độ ẩm Tiến hành làm mỗi bộ phận 5 mẫu, kết quả được tính trung bình từ 5 mẫu và được ghi ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá TT Hàm lượng alcaloid toàn phần (%) Rễ Thân Lá 1 0.67 0.34 0.16 2 0.66 0.34 0.19 3 0.68 0.32 0.18 4 0.65 0.32 0.16 5 0.66 0.33 0.15 Trung bình 0.664 0.332 0.169 3.2.4. Chiết xuất và phân lập alcaloid 3.2.4.1. Chiết xuất alcaloid toàn phần Chiết xuất alcaloid bằng dung dịch acid HCl 1% qui trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ 1. Sơ đồ 1: Quy trình chiết xuất alcaloid toàn phần: Bột dược liệu Dịch chiết acid Dịch chiết acid đã loại tạp Dịch chiết đã kiềm hoá Dịch chiết cloroform Cắn alcaloid toàn phần ơ dung dịch acid HCl 1% ực tiếp trên bếp . Cứ 1tr gạn dịch chiết 1 lần (gạn 5 lần) Lắc với ether Tạp ơ NH4OH 10% Cloroform CHCl3 thu hồi ơ 3.2.4.2. Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột: Căn cứ vào kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy, trong các vết alcaloid của rễ cây lá ngón có V2 to nhất (hàm lượng cao nhất ). Vậy có thể sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập alcaloid V2. * Dùng silicagel 60 cỡ hạt 0,036 đến 0,2mm của hãng Merck thực hiện phương pháp nhồi cột ướt. Hoạt hoá silicagel ở 1050C trong 1 giờ, sau đó lấy silicagel hoà trong một lượng cloroform rồi đem nhồi cột. Để yên cột trong 8 giờ. Cắn alcaloid toàn phần hoà tan bằng một ít cloroform rồi cho thêm 2g silicagel vào trộn đều. Sấy nhẹ cho cloroform bay hơi rồi đổ lên cột dàn thành lớp. * Rửa giải cột: Dùng hệ dung môi rửa giải là CHCl3 : CH3OH (9:1) hứng mỗi ống khoảng 2 ml. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Chọn riêng những ống chỉ cho một vết trên bản mỏng gộp lại rồi cho bốc hơi cloroform, để kết tinh tự nhiên trong ống nghiệm. Cạo lấy phần tinh thể đem kết tinh lại nhiều lần thu được alcaloid V2. Kiểm tra độ tinh khiết của V2 bằng sắc ký lớp mỏng: Tinh thể alcaloid V2 được hoà tan trong một lượng vừa đủ methanol, rồi chấm lên ba bản mỏng và được khai triển bằng ba hệ dung môi khác nhau: Hệ I- Cloroform : Methanol : Amoniac [50:9:1]. Hệ II- Toluen : Aceton : Ethanol: Amoniac [45:45:7:3]. Hệ III- Ether Ethylic : Methanol : Amoniac [50:9:1]. Kết quả cho thấy alcaloid V2 chạy trên ba hệ dung môi khác nhau luôn cho một vết. Điều đó chứng tỏ V2 là đơn chất. 3.2.5 Nhận dạng chất TV2 TV2 là dạng tinh thể hình kim, không màu Tan tốt trong cloroform , methanol, ethanol Không tan trong nước. Độ chảy 1700C. Phổ UV đo trong MeOH cho lmax : 264 nm. Phổ IR đo dưới dạng viên nén KB6 cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3447,23; 2929,28; 2864,88; 1724,85; 1628,49; 1584,87; 1446,69; 1331,09; 1214,75; 1080,55;