Đề tài Nghiên cứu, đánh giá chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh

ertoli để nuôi dưỡng tinh trùng. Hai trung tử thì chuyển động về phía sau nhân, nằm đối diện với Acrosom. Ở phía sau nhân xuất hiện một chỗ lõm gọi là hố thụ tinh, 1 trung tử sẽ nằm trong hố đó. Trung tử thứ 2 nằm sau trung tử 1 và là nơi xuất phát cho 2 sợi trục trung tâm cung với các sợi xoắn khác (fibrin) để tạo thành đuôi tinh trùng. Các ty thể chuyển ới vùng cổ thân, phần lớn tế bào chất được biến đi chỉ còn lại 1 lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi. Quá trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dưỡng Sertoli trong lòng ống sinh tinh, trong khoảng thời gian 14 – 15 ngày. Sau đó chúng trở thành tinh trùng non và rơi vào trong lòng ống sinh tinh, được đùn đẩy và đưa về phía phụ dịch hoàn. 2.4.5. Giai đoạn phát dục Ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành thục. Trong quá trình di chuyển từ đầu đến cuối phụ dịch hoàn, tinh trùng phải di chuyển với đoạn đường khá dài (khoảng trên 100m) nằm uốn khúc quanh co. Trong quá trình này có khá nhiều tinh trùng non bị phân hủy, có thể tới 50%,. Thời gian di chuyển 14-15 ngày. 2.4.6. Giai đoạn biến đổi hóa học Chính ở phụ dịch hoàn màng bán thấm Lipoprotein được hình thành nhờ vách đuôi phụ dịch hoàn. Tinh trùng được dự trữ trong phụ dịch hoàn rất lâu cho tới khi thành thục hoàn toàn vì ở đây nó có đủ điều kiện sống thuận lợi. Tế bào vách của phụ dịch hoàn tiết ra 1 chất toan yếu, nồng độ ion N gấp 10 lần so với ở rong lòng ống sinh tinh, trong chất dịch của phụ dịch hoàn có chứa chất điện giải nhưng ít hơn so với dịch hoàn, nhiệt độ cũng thấp hơn, tất cả những điều kiện đó làm tinh trùng ở trạng thái không hoạt động, năng lượng tiêu hao giảm thấp hơn, cho nên nó có thể ở đây trên 2 tháng mà vẫn còn khả năng thụ thai. 2.5. Các chỉ tiêu đánh giá tinh dịch sau khi bảo quản đông lạnh 2.5.1. Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (A%) Hoạt lực là sức sống (sức hoạt động) của tinh trùng có phương hướng chuyển động tiến thẳng, A là chỉ tiêu kỹ thuật quan trọng trong việc đánh giá chất lượng tinh dịch, A cho biết khả năng thụ thai của quần thể tinh trùng trong tinh dịch (Dương Đình Long, 1996). Theo Corteel (1977), tinh trùng có hoạt lực tốt thì tỷ lệ thụ tinh cao, tinh trùng có hoạt lực yếu thì tỷ lệ thụ tinh kém. Ở phụ dịch hoàn, tinh trùng không được hoạt động, khi ra ngoài cơ thể, tinh trùng được tinh thành hoạt hóa nên đã được hoạt động với tất cả sức sống của mình. Tùy theo sức sống mà tinh trùng có, chúng sẽ vận động theo 1 trong 3 phương thức như sau: - Tiến thẳng : là sự vận động của tinh trùng mà phương của vectơ vận động ổn định. - Xoay vòng: là sự vận động của tinh trùng mà phương của vectơ vận động luôn luôn bị thay đổi. - Lắc lư : là sự vận động của tinh trùng mà hầu như không có vectơ vận động, không thay đổi vị trí tương đối của chúng (Trần Tiến Dũng vcs, 2002). Chỉ tinh trùng vận động tiến thẳng mới có khả năng tham gia vào quá trình thụ tinh, Theo Milovanov (1962), sức sống của đời sau cũng phụ thuộc vào sức sống của tinh trùng, Tinh trùng càng nhiều sức sống thì khả năng sinh trưởng phát dục, sức đề kháng bệnh tất… của đời sau càng cao. Theo Nguyên Thiện vcs (2005), tinh trùng có các phương thức vận động: tiến thẳng, vòng quanh, dao động, không hoạt động (chết). Theo Tổ chức Y Tế thế giới WHO, tinh trùng có các kiểu vận động : 0= Không vận động 1= Vận động yếu ớt 2= Vận động chậm 3= Không vận động tiến thẳng về trước 4= Vận động tiến nhanh về phía trước Các giống lợn ngoại đã cải tiến: Đại bạch, Landrace, Duroc, A= 80-90%, còn các giống lợn chưa được cải tiến, A nhỏ hơn: 70 – 80%, A thay đổi theo giống là chủ yếu (Dương Đình Long, 1996). Theo Nguyễn Lăng (1994), A của lợn Yorshire: 80-90%, Landrace: 70-80% Theo kết quả nghiên cứu của Đào Đức Thà vcs (2003), ALandrace= 72%, Ayorshire= 73%. Trong TTNT cho gia súc, chỉ tinh dịch đạt A ≥ 70% thì tinh dịch đó mới đủ tiêu chuẩn để pha chế bảo tồn ở dạng đông lạnh (Trần Tiến Dũng vcs, 2002). Theo tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1859/76, A ≥ 70% mới sử dụng để pha chế bảo tồn (Nguyễn Thiện, Đào Đức Thà, 1998). Tinh dich bảo tồn phải đạt A ≥ 40-50% (tinh lỏng) và A ≥ 30% (tinh đông lạnh) mới được sử dụng để dẫn tinh cho gia súc cái. Các yếu tố: nhiệt độ, khoảng cách lấy tinh, dinh dưỡng, kỹ thuật khai thác…đều có ảnh hưởng đến A. Nhiệt độ cao làm tinh trùng chết rất nhanh, nhiệt độ thấp làm cho sức vận động của tinh trùng giảm, thậm chí ngừng vận động, đây cũng chính là cơ sở khoa học để bảo tồn và đông lạnh tinh. 2.5.2. Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml) Nồng độ tinh trùng là số lượng tinh trùng có trong 1 đơn vị thể tích tinh dịch nguyên (chưa pha loãng) (thường tính bằng đơn vị 106/ml hoặc 108/ml). Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng tinh dịch, là chỉ tiêu cơ sở để tính số liều tinh sản xuất. Do vậy ở các cơ sở sản xuất tinh dịch công nghiệp, sản xuất tinh đông lạnh, C là chỉ tiêu kiểm tra thường xuyên. Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyên Quốc Đạt (1997), C là 1 thông số cần thiết giúp ta quyết định tỷ lệ pha loãng tinh nguyên với môi trường bảo quản và định liều phối trong TTNT. Để pha loãng bảo quản tinh dịch đạt kết quả cao thì tinh dịch phải đạt yêu cầu: Theo tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1859/76, C lợn ngoại ≥ 80,106/ml, C lợn nội = 20,106/ml. Nồng độ tinh trùng lợn thấp hơn các gia súc khác: Milovanov (1962) C= 10-20,106/ml, cao nhất 100,106/ml; Mann (1954), Ctrung bình =100,106/ml. Trần Thế Thông vcs (1974) cho biết: C Đại Bạch =110-130,106/ml, C Landrace = 120-300,106/ml, C Ỉ pha = 30-60,106/ml. Dương Đình Long (1996), C Đại Bạch= 178,8,106/ml, dao động 170-200,106/ml, C Landrace= 167,5,106/ml, dao động 150-190,106/ml, C lợn Ỉ= 39,4,106/ml, dao động 21-78,106/ml. Nồng độ tinh trùng phụ thuộc nhiều yếu tố : giống, tuổi, mùa vụ, chăm sóc nuôi dưỡng, quản lý… Nguyễn Thiện vcs (2005) cho biết: Ở 4-8 tháng tuổi Lợn nội C= 80-100,106/ml Lợn ngoại C= 80-100,106/ml 1-2 năm Lợn nội C= 40-50,106/ml Lợn ngoại C= 250-300,106/ml 3-4 năm Lợn nội C= 20-40,106/ml Lợn ngoại C= 200-250,106/ml 2.5.3. Tỷ lệ sống (Sg: %) Tỷ lệ tinh trùng sống là chỉ tiêu hỗ trợ đánh giá chất lượng tinh trùng. Khi tinh trùng chết, màng của nó có thể cho chất nhuộm màu thấm qua, còn tinh trùng sống thì không bắt màu, Do đó ta có thể xác định được tỷ lệ tinh trùng sống. Chỉ tiêu này cũng là cơ sở để tính số tinh trùng cần thiết cho một liều phối (Đỗ văn Thu, Nguyễn Anh, Lê Thành Đô, 2003). Tỷ lệ tinh trùng sống có ý nghĩa quan trọng trong quá trình pha chế, bảo tồn tinh dịch. Theo Nguyễn Thiện (2005), tỷ lệ sống phải đạt ≥ 80% mới đạt yêu cầu trong pha chế, bảo tồn tinh dịch. Theo TCVN 1859/76, tỷ lệ sống chung cho cả lợn nội và lợn ngoại phải ≥ 70% (Nguyễn Thiện, Đào Đức Thà, 1998). Nguyễn Anh (2004) cho biết lợn Ỉ có Sg = 83,18%, dao động 60-98%. Tỷ lệ sống phụ thuộc nhiều yếu tố: giống, tuổi, chế độ khai thác, nuôi dưỡng và quản lý đực giống, 2.5.4. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %) tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình thái học khong bình thường ở đầu, cổ thân, đuôi. Những tinh trùng này không có khả năng thụ thai. Đây là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch. Những tinh trùng kỳ hình thường dược xuất ngay từ giai đoạn đầu (Asdell, 1946). Theo Hafez (1974), K của tinh trùng lợn biến động từ 10-30%. Còn Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) cho biết chỉ sỗ này ở lợn Việt Nam < 20%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình càng thấp càng tốt, không nên quá 20%. Quy trình kỹ thuật TTNT lợn của Bộ Nông Nghiệp 1985 và tiêu chuẩn tinh dịch lợn Việt Nam 1982 cũng quy định Kmax = 16%. Theo Dương Đình Long (1996), lợn Landrace có K= 6,2% dao động 3- 10,4%, lợn Đại Bạch K= 6,2%, dao động 3-4%, lợn Ỉ K= 4,1% dao động 3 - 5,7%, lợn Móng Cái, K= 4,76% dao ddoongj 4-5%. Trương Lăng (1994) cho biết lợn Landrace, Yorshire có K= 9,86%. Đào Đức Thà vcs, 2003 nghiên cứu cho thấy: Landrace K= 4,91%, Yorshire K=5,81%. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch phản ánh tình trạng sức khỏe của con đực, hoạt động sinh dục và đặc biệt là quá trình sinh tinh. Vì vậy nó phụ thuộc tuổi, chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc và chế độ khai thác tinh. Theo Milovanov (1962), có 2 thời kỳ có thê gây kỳ hình cho tinh trùng: - Ngay trong quá trình sinh tinh, điều này xảy ra đều bắt nguồn từ những nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý. - Sau khi tinh trùng ra ngoài cơ thể, trường hợp này xảy ra thường có liên quan với các nhân ngoại cảnh và kỹ thuật không đúng khi kiểm tra tinh dịch. Theo Hà Văn Chiêu (1999) nếu tinh trùng còn giọt bào tương bám theo thì tinh trùng đó được coi là kỳ hình và không có khả năng thụ thai. Còn theo Trần Tiến Dũng vcs (2002), tinh trùng còn giọt nguyên sinh ở cổ thân, đuôi là những tinh trùng chưa thành thục-tinh trùng non. Phân loại tinh trùng kỳ hình: - Kỳ hình ở phần đầu: đầu khổng lồ, đầu bé bất thường, bong xoang acrosom, 2 đầu. - Kỳ hình ở phần đuôi: đuôi xoăn, đuôi cuộn, đuôi cong, đuôi gập, 2 đuôi. Tinh trùng kỳ hình đuôi là chủ yếu chiếm 80%. 2.6. Thụ tinh ống nghiệm bằng tinh bảo tồn lạnh trong Nitơ lỏng -1960C + Nguyên lý thụ tinh: TTON là sự két hợp giữa trứng đã nuôi thành thục trong ống nghiệm với tinh trùng đã được kiện toàn năng lực thụ tinh. Trong kỹ thuật TTON, tế bào trứng và tinh trùng là nguyên liệu cơ bản đồi hỏi cần có sự chuẩn bị kỹ càng cùng với các điều kiện nuôi cấy thích hợp. + Các giai đoạn của quá trình thụ tinh: Các giai đoạn của TTON cũng có những điểm tương đồng với thụ tinh invivo, bao gồm các giai đoạn: Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ Tương tác của tinh trùng với màng trong suốt Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt Phản ứng thể đỉnh Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái Sự hoạt hóa tế bào trứng Để tiến hành IVF cần thực hiện các bước: Thu buồng trứng, bảo quản và vận chuyển buồng trứng Thu trứng từ các nang trứng Nuôi thành thục trứng invitro Xử lý tinh trùng (kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng) Thụ tinh trứng lợn trong ống nghiệm. + Kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng: Astin (1951) thí nghiệm trên chuột và Chang (1951) trên thỏ khi tiến hành thí nghiệm thụ tinh bằng tinh trùng trong ống dẫn trứng, cả 2 ông đều chỉ ra rằng: Các tinh trùng trong tinh dịch khi phóng tinh đều không có khả năng thụ tinh trực tiếp với trứng mà chúng phải trải qua một thời gian nhất định trong đường sinh dục con cái để đạt tới khả năng thụ tinh. Chính vì vậy “kiện toàn năng lực thụ tinh chi tinh trùng” là khâu quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả thụ tinh ống nghiệm. Hiện nay có 1 số phương pháp xử lý tinh trùng được phổ biến: - Phương pháp bơi ngược dòng (swim-up) Tinh trùng đông lạnh được giải đông ở nhiệt độ 35-37oC trong 1 phút, Toàn bộ tinh trùng được đưa vào môi trường TALP trong vòng 45-60 phút ở 38,5-39oC. Thu lấy phần trên và ly tâm 200xg trong 10 phút. Những tinh trùng đạt tiêu chuẩn được đưa vào thụ tinh, Kolbe và Holz (1999), bổ sung NaHCO3, Pyruvat, lactate, gluco, BSA, dịch nang trứng, Kanamycine, giữ pH = 7,8 và đưa vào tủ nuôi 39 oC, 5% CO2, độ ẩm bão hòa trong 90 phút. - Phương pháp ly tâm (centrifusion) Tinh trùng đông lạnh được giải đông ở nhiệt độ 35-37 oC trong 1 phút và được rửa lại 2-3 lần trong môi trường TCT-PVA bổ sung axit béo – free BSA, đưa vào ly tâm 2 lần, mỗi lần 5 phút, 9000 xg/phút. Tinh trùng thu được cho vào ống nhựa hình chóp (4ml), để vào tủ ấm 38,5 oC, độ ẩm bão hòa trong 15 phút đến khi thụ tinh, lúc này tinh trùng đã đủ tiêu chuẩn đưa vào thụ tinh. + Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll (gradient percoll) Tinh trùng đông lạnh được giải đông trong nước ấm 35-37 oC trong 1 phút. Chúng được cho lên lớp Percoll với nồng độ khác nhau (90%/45%: 1 lớp percoll 90% ơ dưới và 1 lớp percoll 45% ở trên), ly tâm 700 xg/phút trong 20-3- phút, Phần lắng xuống đáy là những tinh trùng khỏe mạnh đạt tiêu chuẩn thụ tinh. Ngoài ra còn có phương pháp lọc qua phân lớp Polyvinyl pyrrolidone (Guerin, 1981). + Phương pháp thụ tinh trứng lợn trong ống nghiệm: Trứng đã thành thục và tinh trùng đã được tăng cường năng lực thụ tinh, sẵn sàng tham gia vào thụ tinh thì tiến hành TTON. Loại bỏ môi trường bảo quản đông lạnh tinh bằng cách ly tâm 200 vòng/phút sau đó pha loãng với một số môi trường thích hợp: DPPS, TCM-199, Saline-BSA… Sau khi xử lý tinh trùng xong phải tiến hành kiểm tra nồng độ và hoạt lực tinh trùng tiến thẳng, thông thường nồng độ tinh trùng sau pha loãng phải đạt 5x105- 106 tinh trùng/ml. + Một số yếu tố ảnh hưởng đến TTON Kết quả TTON phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó chủ yếu là: kích thước nag trứng, chat lượng trứng, môi trường và điều kiện nuôi cấy, giống, mùa vụ, tuổi, đực giống, phương pháp xử lý hoạt hóa tinh trùng, nồng độ và hoạt lực tinh trùng tiến thẳng… Phần thứ ba VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu Đánh giá 1 số đặc điểm sinh học tinh dịch lợn được tiến hành trên 2 giống lợn: Lợn Bản và Landrace nuôi tại các trại giống gia súc gia cầm Thuận thành – Bắc Ninh, trại Cầu Diễn – Hà Nội… lợn khỏe mạnh, được chăm sóc nuôi dưỡng tốt, giao phối thuần thục trước khi mổ lấy. Khảo sát 1 số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn Bản, Landrace sau đông lạnh, Lợn Bản (hay còn gọi lợn Mường, lợn “cắp nách”, Minipig) là 1 giống lợn quý, kích cỡ nhỏ (khối lượng lợn đực trưởng thành là 30-40 kg, lợn nái 20-30 kg (7-8 tháng tuổi)), được nuôi chủ yếu ở vùng đồi núi phía Bắc, vùng trung du. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 1 đến hết tháng 4 năm 2010. - Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ phôi, viện CNSH, viện Khoia học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội Trung tâm giống gia súc gia cầm Thuận Thành – Bắc Ninh. Trại nuôi động vật thí nghiệm của phòng công nghệ phôi. 3.3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát và đánh giá chất lượng tinh trùng trước và sau bảo quản lạnh được mổ lấy từ mào tinh của lợn Landrace theo các chi tiêu A, K, Sg. Đánh giá chất lượng tinh dịch của tinh từ mào tinh của lợn Landrace qua việc tham gia vào thụ tinh ống nghiệm. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp thu tinh Tinh trùng khai thác từ mào tinh được thu thập từ 5 con lợn Landrace. Đối với mào tinh của lợn ngoại Landrace được thu thập tại lò mổ địa phương và được vận chuyển về phồng thí nghiệm để ở nhiệt độ phòng. Bao gồm các bước như sau: - Mổ dịch hoàn thu lấy mào tinh - Đầu nhỏ của mào tinh được nối với ống để chứa tinh dịch - Dùng kim cỡ 15 đã bấm đầu nhọn gắn vào lòng ống phia đầu còn lại của mào tinh - Dùng xilanh 100ml đã hút đầy không khí gắn vào kim, rồi bơm hết không khí ra, Khi đó tinh dịch trong mào tinh sẽ được dồn hết về phía ống chứa tinh, Chúng ta sẽ thu được tinh dịch từ mào tinh. 3.4.2. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch lợn thu được - Lượng tinh thu được (V: ml) Theo phương pháp của Milovanov (1962), Chemineau (1991) dùng ống đong, cốc đong có chia độ sẵn, đặt thăng bằng ngang tầm mắt và đọc kết quả ở mặt cong dưới của tinh dịch. - Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (A: %) Theo phương pháp của Milovanov (1962), Chemineau (1991), cách tiến hành: Dùng đũa thủy tinh sạch, lấy 1 giọt tinh dịch nhỏ lên phiến kính khô, sạch, ấm (35-370C). Dùng 1 lamen sạch, ấm đặt lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch được dàn đều ra 4 cạnh của lamen và không lẫn bọt khí. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi độ phóng đại 400 lần, ước lượng tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng (theo kinh nghiệm) trong vi trường quan sát được. Trong khi kiểm tra, tiêu bản được sưởi ấm 37-390C.  Việc đánh giá hoạt lực tiến thẳng được cho điểm theo thang 1 điểm: Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 % tinh trùng tiến thẳng 100 - 95 95 - 85 85 - 75 75 - 65 65 – 55 55 - 45 45 - 34 35 - 25 25 – 15 15 - 5 - Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml) + Theo phương pháp của Milovanov (1962), Chemineau (1991), Dùng buồng đếm hồng cầu theo kiểu Toma và ống pha loãng hồng cầu pha loãng tinh dịch bằng dung dịch NaCl 3%. + Dùng pipet 1000 µl hút 990 µl NaCl 3% vào ống ibendoft Dùng pipet 100 µl hút 10 µl tinh dịch vào ống ibendoft, trộn đều Tỷ lệ pha loãng 100 lần Hút 1 giọt nhỏ lên buồng đếm hồng cầu Đặt buồng đếm lên kính hiển vi độ phóng đại 200-600 lần. Đếm tinh trùng trong 5 ô lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa – mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400 mm2, độ sâu 1/10 mm2). Nguyên tắc đếm: Đếm tinh trùng theo đầu, đếm lần lượt theo hàng, hết hàng nọ đến hàng kia theo hình chữ chi, Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm ở 2 cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải). Đếm xong lấy kết quả trung bình qua 3 lần đếm được trong 5 ô lớn, Nếu kết quả của 2 lần đếm chênh lệch nhau trên 30% thì phải làm lại. Nếu tinh trùng tụ thành đám không đếm được thì cũng bỏ đi, làm lại. Công thức tính nồng độ tinh trùng : C = n.106 Trong đó: C: nồng độ tinh trùng trong tinh dịch n: số tinh trùng đếm được trong 5 ô lớn 106 : chỉ số quy nồng độ tinh trùng về 1 ml tinh nguyên - Tỷ lệ tinh trùng sống (Sg: %) Theo phương pháp của Chemineau vcs (1991): Nhuộm tinh trùng bằng thuốc nhuộm eosin-nigrosin. Cách tiến hành: Dùng phiến kính sạch, ấm (35-370C. Nhỏ 1 giọt dung dịch thuốc nhuộm lên 1 đầu của phiến kính, Thêm 1 giọt tinh dịch và trộn đều với dung dịch thuốc nhuộm. Dùng lamen sạch nhẵn đặt lên hỗn hợp chếch 1 góc 450 so với phiến kính, lướt nhẹ sao cho hỗn hợp được dàn mỏng đều. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi độ phóng đại 400 lần. Đếm tổng số khoảng 200 tinh trùng phân bố đều ở các vùng, Các tinh trùng sống không bắt màu. Tinh trùng chết bắt màu đỏ. Công thức tính: Sg (%) = Số tinh trùng sống x 100 Tổng số tinh trùng đếm - Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %) Theo phương pháp của William (1921), kết hợp với phương pháp của Chemineau (1991), sử dụng phương pháp nhuộm bằng dung dịch xanh Methylen, đỏ Fucsin, Eosin-Nigrosin… Cách tiến hành: Nhỏ 1 giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, nhẵn, ấm, dùng lamen sạch, nhẵn dàn đều tinh dịch trên phiến kính (nếu đặc pha bằng nước sinh lý hoặc Natricitrai 2,9%). Để tự khô trong không khí, sau đó cố định bằng cồn (2-3 phút), rửa nhẹ bằng nước cất, vẩy khô. Nhuộm màu tinh trùng: Nhuộm đơn bằng dung dịch eosin-nigrosin trong 5-7 phút, rửa nhẹ bằng nước cất, vẩy khô. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi độ phóng đại 400-600 lần. Đếm tổng số 300-500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình, không đếm lặp. Công thức tính: Trong đó: K%: là tỷ lệ tinh trùng kỳ hình n: là số tinh trùng kỳ hình N: là tổng số tinh trùng đếm được (N= 300-500), Đếm tổng số 300-500 tinh trùng và phân loại kỳ hình theo bảng sau: Số lượng tinh trùng kỳ hình Tổng số tinh trùng đếm được Tỷ lệ kỳ hình (%) Đầu Cổ Thân Đuôi Cộng ... ... 3.4.3. Pha loãng và bảo tồn tinh dịch lợn ở nhiệt độ -1960C Tinh dịch lợn vừa mới khai thác được đánh giá chất lượng tinh dịch ngay, sau đó pha loãng tinh dịch để bảo quản dài ngày hoặc bảo quản đông lạnh, Nếu A đạt ≥ 70%, Sg ≥ 80% mới đủ tiêu chẩn pha chế bảo tồn đông lạnh được. Phương pháp đông lạnh: trước đây, một số tác giả đã nghiên cứu thử nghiệm 1 số quy trình đông lạnh tinh lợn: phương pháp đông lạnh của Dương Đình Long (1996), phương pháp đông lạnh tinh dịch lợn Ỉ của Nguyễn Anh (2004). Ở đây chúng tôi đông lạnh tinh lợn theo phương pháp đông lạnh của Kikuchi vcs (1998). 3.4.4. Phương pháp khảo sát, đánh giá chất lượng tinh dịch lợn sau thời gian bảo tồn Định kỳ kiểm tra các chỉ tiêu A, Sg, C, K theo phương pháp ở mục 3.4.2 trong suốt quá trình bảo quản lạnh trong ni-tơ lỏng -1960C. 3.4.5. TTON bằng tinh lợn bảo tồn ở -1960C - Chuẩn bị trứng: Trứng sau khi được nuôi thành thục trong môi trường nuôi tại phòng Công nghệ phôi sẽ được chúng tôi tiến hành TTON. Trứng được đánh giá là thành thục khi quan sát thấy sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II). - Chuẩn bị tinh trùng: Để tiến hành IVF, chúng ta có thể sử dụng tinh tươi hoặc tinh đông lạnh, Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ, Trước khi thụ tinh, tinh cọng rạ bảo quản trong nitơ lỏng ở -1960C được giải đông trong nước ấm 370C dưới 1 phút. Sau đó tinh trùng được “kiện toàn năng lực thụ tinh” bằng cách xử lý theo phương pháp ly tâm: Cách tiến hành: Đưa tinh trùng vào ống ly tâm, sau đó đưa môi trường nước rửa trứng lợn vào để rửa tinh trùng, đảo đều và đưa vào máy ly tâm 10 phút, tốc độ 2000xg, thu lấy phần lắng dưới đáy, Sau đó cho môi trường rửa tinh TALP-2 vào để pha loãng, đảo đều và cho vào tủ ấm 37-380C trong 10-15 phút. Tinh trùng lúc này đã sẵn sàng cho thụ tinh. Sau khi xử lý tinh trùng xong, tiến hành khảo sát đánh giá chất lượng tinh dựa vào các chỉ tiêu: Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ sống của tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Nồng độ tinh trùng sau khi xử lý đạt từ 5,105-106 tinh trùng/ml là đạt yêu cầu cho TTON. - Phương pháp TTON: tạo giọt thụ tinh đã được chuẩn bị trước 2h, trứng được thụ tinh là những trứng loại A, B (có thể tách hay không tách culumus). Mỗi giọt thụ tinh đưa vào từ 10-15 trứng, sau đó đưa tinh trùng đã xử lý vào (5,105-106 tinh trùng/10-15 trứng). Đưa mẫu vào trong tủ nuôi ở 390C, 5% CO2, độ ẩm bão hòa trong 24h. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel-ANOVA, Phần IVKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC TINH XUẤT VÀ TINH TỪ MÀO TINH CỦA LỢN LANDRACE Trên cơ sở nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh học của tinh dịch lợn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên mẫu tinh dịch tươi của giống lợn Landrace. Sau khi thu được tinh xuất và tinh từ mào tinh chúng tôi đã tiến hành khảo sát đánh giá ngay các chỉ tiêu về số và chất lượng tinh dịch lợn. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh xuất và tinh từ mào tinh của lợn Landrace. Tinh dịch lợn Landrace Tinh xuất Tinh từ mào tinh V (ml) 233,57±7,10 10,54±3,65 A (%) 80,71±1,87 80,00±4,63 C (tỷ/ml) 0,28±0,02 4,16±0,14 Sg (%) 89,94±1,70 88,86±2,73 K (%) 5,36±0,27 4,61±0,84 (trích dẫn từ Nguyễn Thị Mến, khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn nuôi- Thú y, 2007) Thông qua kết quả trình bày ở bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy: Các chỉ tiêu có sự khác nhau giữa hai phương thức thu tinh lấy tinh. - Lượng tinh dịch thu được (V: ml) Lượng tinh dịch thu được từ mào tinh của lợn Landrace là: 10,54 ml, tinh xuất là: 233,57 ml. Như vậy, lượng tinh xuất ra nhiều hơn rất nhiều lần so với lượng tinh thu lấy từ mào tinh. - Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng(A%) Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng của lợn Landrace là : 80.00% còn hoạt lực của tinh xuất là 80,71 %, theo kết quả này cho thấy chỉ tiêu A khá cao, phạm vi biến động A giữa hai phương thức thu lấy tinh là nhỏ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đương với kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước: Kunitado Sato, Junichi Mori, Hiroshi Masuda (2005) [10] cũng cho kết quả tương tự với A dao động 75-95%. Nguyễn Tấn Anh, Lê Đức Hào, Lưu Kỷ vcs (1996), giáo trình chăn nuôi lợn và Võ Trọng Hốt vcs, 2002, chỉ tiêu A của lợn Móng Cái: 70-80%, A của lợn Landrace: 80-90%. Trương Lăng (1994) cho biết A của lợn Landrace: 70-80%. Theo Nguyễn Thiện (2005), A ≥ 70% sẽ đạt hiệu quả cao trong pha loãng và bảo tồn tinh dịch. Như vậy, với kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi hoàn toàn có thể sử dụng tinh dịch trên để bảo quản lạnh trong nitơ lỏng với mục đích chủ động cung cấp nguyên liệu cho TTON và các nghiên cứu liên quan. - Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml) Nồng độ tinh trùng của tinh xuất là 0,28 tỷ/ml, của tinh từ mào tinh là 4,16 tỷ/ml. Kết quả chúng tôi thu được phù hợp với quy luật: các giống lợn ngoại thường có nồng độ tinh trùng cao. Các tác giả khác đã nghiên cứu trên các giống lợn này cũng nhận được kết quả tương tự: Trần Thế Thông vcs (197