Đề tài Nghiên cứu điều chế dung dịch Ag nano mật độ cao và khảo sát khả năng diệt khuẩn của chúng

ông nghệ nano đối với bạc để tăng tính năng diệt khuẩn, sát trùng, tiêu độc và khử mùi, được ứng dụng trong một số sản phẩm như các dụng cụ bảo quản thực phẩm, sơn, các vật liệu may mặc, mỹ phẩm Chắc chắn rằng với sự phát triển ngày càng cao của khoa học công nghệ, chúng ta còn khám phá ra nhiều tính chất hữu dụng hơn nữa của bạc nano cũng như các vật liệu nano khác để nâng cao chất lượng cuộc sống và sự tiến bộ của loài người. [9] 1.2.1. Các phương pháp điều chế nano bạc Người ta có thể sử dụng các quy trình khác nhau cũng như các điều kiện khác nhau: chất đầu, phương pháp, điều kiện lọc, rửa, sấy, nung, để điều chế Ag nano kích cỡ khác nhau phục vụ cho những mục đích khác nhau. Nói chung, cũng giống như các vật liệu nano khác, Ag nano chủ yếu được tổng hợp bằng hai phương pháp chính là phương pháp vật lý và phương pháp hóa học. Ở đây chúng tôi chỉ đề cập đến một số phương pháp điển hình đã được biết khá rộng rãi trên thế giới. 1.2.1.1. Phương pháp vật lý Đây là phương pháp tạo vật liệu nano từ nguyên tử hoặc chuyển pha. a: Phương pháp chuyển pha b: Phương pháp bốc bay nhiệt Các phương pháp vật lý để điều chế vật liệu nano như trên thường yêu cầu những thiết bị phức tạp, trong những điều kiện khá khắt khe và khó điều chỉnh được kích thước hạt. 1.2.1.2. Các phương pháp hóa học Có nhiều phương pháp khác nhau để tổng hợp vật liệu nano bạc, trong đó phương pháp hóa học là một phương pháp có nhiều ưu điểm. Ưu điểm nổi trội nhất phải kể đến là mức độ đồng nhất hóa học rất tốt do đó có thể trộn lẫn các chất khác nhau ở cấp độ phân tử. Không những thiết bị đơn giản, mà với phương pháp hóa học người ta có thể kiểm soát được các điều kiện phản ứng, các điều kiện ảnh hưởng đến kích thước hạt và hơn nữa còn điều khiển được kích thước hạt như mong muốn. Dưới đây là một số phương pháp thường được sử dụng để điều chế vật liệu nano, đặt biệt là Ag nano. a. Phương pháp phân hủy nhiệt Phương pháp này người ta thường sử dụng một muối của bạc và axit hữu cơ ( thường là các axit béo mạch dài vì những axit này có tác dụng bảo vệ). Muối đó đem nung ở nhiệt độ <3000C trong vòng 2 giờ thu được tinh thể Ag nano kích cỡ nhỏ và có đường phân bố kích thước hẹp. b. Phương pháp sử dụng màng các chất đa điện li Các chất cao phân tử chứa các nhóm có khả năng ion hoá được gọi là các chất đa điện li. Trong dung dịch chất đa điện li có các ion lớn và ion tương ứng. Đặc điểm chính của các chất đa điện li đó là cấu hình của mạch cao phân tử tích điện, có sự phân bố các đối ion ở trong mạch và xung quanh mạch cao phân tử. Do đặc điểm của mạch cao phân tử các chất điện li nên chúng có thể tạo thành các “hố” kích thước nano mang điện tích âm và sẽ giữ các ion Ag+ trong đó. Sử dụng phương pháp này có thể tổng hợp được các hạt nano với kích thước khoảng 2 - 4nm và độ đồng đều cao. [5] c. Phương pháp polyol [12,13,14] Có thể dùng Etylenglycol và các diol làm chất khử, ở nhiệt độ cao với sự có mặt của chất làm bền để tạo ra các hạt Ag nano. Nhưng qua nghiên cứu người ta thấy rằng khả năng của poly etylenglycol (PEG) nhạy hơn, nó lại có mạch cacbon dài nên PEG vừa là chất khử, vừa là chất bảo vệ trong quá trình phản ứng. Trong công trình [13] đã tiến hành như sau: Đun PEG đến 800C, cho dung dịch AgNO3 vào, giữ nhiệt độ ở 800C và khuấy đều trong một giờ. Khi màu đỏ của dung dịch chuyển từ hồng sang màu xanh đen, chứng tỏ các hạt bạc nano đã được tạo thành. Các hạt này bền trong nhiều tháng, chứng tỏ PEG là một chất bảo vệ tốt. Phương trình phản ứng: RCH2CH2OH + 2Ag+ = RCH2CHO + 2Ag + 2 H+ Đây là một phương pháp mới và đơn giản để điều chế các hạt Ag nano. Khi sử dụng PEG không cần phải thêm dung môi, chất hoạt động bề mặt hay chất khử nữa. Hình dạng và kích thước của Ag nano phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ của chất phản ứng. Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng: Khi độ dài của mạch polyme tăng lên thì khả năng khử của PEG cũng tăng. Các hạt Ag nano thu được bằng phương pháp này có kích thước khá nhỏ và đồng đều, khoảng 8-10nm. d. Phương pháp khử hóa học [1,6,7,16] Vật liệu Ag nano chủ yếu được điều chế bằng phản ứng khử ion Ag+ trong dung dịch bởi các tác nhân khử êm dịu với sự có mặt của các chất làm bền. * Tác nhân khử Tác nhân khử là yếu tố có tính chất quyết định kích thước, hình dáng hạt tạo thành. Nếu chất khử quá mạnh, quá trình khử diễn ra quá nhanh, số lượng Ag sinh ra quá nhiều sẽ kết tụ lại với nhau tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn. Ngược lại, nếu chất khử quá yếu, quá trình tổng hợp sẽ đạt hiệu suất thấp, thời gian phản ứng quá dài làm làm phát sinh nhiều sản phẩm phụ không mong muốn. Các tác nhân khử rất đa dạng, thường là: fomandehit, hydzazin, muối tactrat, xitrat, NaBH4, các polyol * Tác nhân bảo vệ Các chất bảo vệ này có vai trò chủ chốt trong việc điều chỉnh kích thước hạt bạc, bằng cách khống chế sự lớn lên của các hạt Ag và ngăn cản sự keo tụ của chúng. Các chất bảo vệ thường là các polyme và các chất hoạt động bề mặt như polyvinylancol, polyetylenglycol, xenluloaxetat, silica Cơ chế làm bền có thể được giải thích như sau: Phân tử các chất làm bền thường có các nhóm phân cực có ái lực mạnh với ion Ag+ và các phân tử Ag kim loại. Đó là nhóm -OH ở PVA, xenluloaxetat, silica, nhóm chứa nguyên tử O, N trong PVP, nhóm -COO trong các axit béo, nhóm -SH trong các thiol Rn(SH) (OH). Trong quá trình phản ứng, do các ion Ag+ đã được gắn lên trên các polyme nên không thể lớn lên một cách tự do. Hơn nữa các hạt Ag nano khi vừa hình thành đã được ngăn cách với nhau bởi lớp vỏ polyme lớn và không thể kết tụ được với nhau. Điều này đã khống chế cả quá trình lớn lên và tập hợp của các hạt, do đó dễ tạo kích thước hạt nhỏ và đồng đều. Ngoài ra các hạt Ag nano còn được làm bền theo cơ chế làm bền của các hạt keo. Khi ion Ag+ chưa bị khử hoàn toàn, chúng được hấp phụ trên bề mặt hạt và tạo thành các mixen gồm nhân bạc, một lớp chất bảo vệ và lớp điện kép của Ag+ và NO-3. Nhờ lớp điện kép này mà các hạt Ag nano mang điện tích trái dấu và đẩy nhau, tránh hiện tượng keo tụ. Bên cạnh đó các yếu tố khác như: pH, nồng độ chất tham gia phản ứng, nhiệt độ của phản ứng, tốc độ, thời gian phản ứng cũng ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm tạo thành. Ví dụ khi pH quá lớn sẽ xảy ra quá trình tạo thành Ag2O nên khó khống chế phản ứng, đặc biệt khi pH cao, ion OH- làm mỏng lớp điện kép bao ngoài hạt nano làm các hạt nano dễ tập hợp. Khi nồng độ thấp, tốc độ cung cấp chất phản ứng nhỏ, các hạt nano thường tạo thành nhỏ và đồng đều hơn. Phương pháp này thường được sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm vì quy trình sản xuất ra Ag nano khá đơn giản, không đòi hỏi thiết bị quá hiện đại, dễ khống chế các điệu kiện phản ứng để thu được kích thước hạt theo mong muốn đồng thời có thể tổng hợp với lượng lớn. Vì vậy phương pháp khử hóa học với những ưu điểm nổi bật sẽ là sự lựa chọn tối ưu để tổng hợp các loại vật liệu này. 1.2.2. Ứng dụng của Bạc nano Với sự phát triển của công nghệ nano, bạc nano là một đối tượng nhận được nhiều chú ý của các nhà khoa học cũng như các doanh nghiệp. Vì bạc không những mang lại những đặc tính đáng quý của vật liệu nano mà còn có những tính chất riêng khác biệt ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. a. Ứng dụng của bạc nano đối với sức khoẻ và y học Do con người luôn phải chịu sự tấn công của các loại vi khuẩn độc hại có trong môi trường, chính vì vậy mà khoa học luôn phải tìm kiếm, tổng hợp nên các vật liệu có khả năng diệt trừ vi khuẩn. Dù không quá lâu khi thế giới phát hiện ra công nghệ bạc nano có những tính năng tuyệt vời với khả năng bảo vệ sức khoẻ con người, nhưng chỉ hơn một năm trở lại đây Việt Nam mới xuất hiện dòng sản phẩm ứng dụng công nghệ được coi là cuộc cách mạng của thế kỉ XXI này. Công nghệ Ag nano được biết phù hợp với điều kiện khí hậu, môi trường và văn hoá tiêu dùng của nước ta. Với những ưu thế vượt trội, công nghệ nano – công nghệ siêu nhỏ đang ngày càng được ứng dụng nhiều hơn trong lĩnh vực sử dụng sản phẩm thiết yếu phục vụ đời sống con người và được coi là tiêu chí cạnh tranh hàng đầu giữa các nhà sản xuất trên thị trường. [9] Với diện tích bề mặt lớn, chỉ cần dùng một lượng nhỏ bạc nano mà tác dùng diệt khuẩn lại tăng lên rất nhiều. Bởi vậy mà rất nhiều vật dụng được tráng một lớp bạc nano để diệt khuẩn như máy điều hoà nhiệt độ, tủ lạnh, bình lọc nước, nhằm kháng khuẩn và tiêu độc. Bên cạnh đó không thể không nhắc tới một nhãn hiệu được tin dùng trong suốt thời gian qua đó là bình sữa tiệt khuẩn và các dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ nhỏ của Mummybear. Loại bình sữa tráng Ag nano này đang được thu hút bởi tính năng ưu việt của nó như kháng khuẩn, tiêu độc, khử mùi, diệt được 99.9%vi khuẩn E.coli và Staphylococi gây bệnh tiêu chảy ở trẻ, ngoài ra khăn ướt, hộp đựng thức ăn, quần áo trẻ em cũng đều được tráng một lớp bạc nano để kháng khuẩn và tiêu độc. Hình 2. Bình sữa với công nghệ Nano Silver Trong y học, người ta dùng hạt nano bạc để làm các loại bông gạc y tế, các dụng cụ phẫu thuật, dung dịch tẩy trùng và thành phần của một số dược phẩm [2] b. Ứng dụng của bạc nano trong công nghiệp điện tử Không có một lĩnh vực nào mà công nghệ nano có ảnh hưởng nhiều như điện tử, công nghệ thông tin và truyền thông, bạc nano là một tronh những vật liệu được ứng dụng nhiều nhất trong lĩnh vực này. Chúng không chỉ mang trong mình những tính chất ưu việt của vật liệu nano mà còn có hoạt tính xúc tác, tính điện, tính quang, tính từ rất cao so với các vật liệu khác. Do vậy bạc nano được ứng dụng trong lĩnh vực điện tử để sản xuất những linh kiện, những vi mạch có thể truyền tải, ghi nhận, lưu trữ thông tin nhanh hơn và nhiều hơn. Nhờ thế mà kích thước của các thiết bị giảm xuống đáng kể mà chất lượng còn tăng thêm nhiều so với trước đây.[4, 11] c. Ứng dụng của bạc nano trong lĩnh vực may mặc[2,4] Các nhà nghiên cứu đại học Clemson(Mỹ) vừa chế tạo một loại chất phủ mới, giúp con người có những bộ quần áo sạch mà không cần giặt bằng cách sử dụng các hạt nano bạc có độ dày bằng 1/1000 sợi tóc người. Hạt nano tạo ra các bướu tí hon trên mặt vải và lớp phủ polymer làm bướu vĩnh viễn bám vào vải. Khi vải tiếp xúc với nước, chẳng hạn dưới trời mưa, chất bẩn sẽ tự cuốn trôi dễ dàng. Brown nói “Người mặc vẫn cần một ít nước để loại bỏ chất bẩn. Tuy nhiên quá trình giặt sẽ nhanh hơn và không phải giặt thường xuyên như quần áo hiện nay”. Có thể gắn lớp phủ vào mọi loại vải, từ polyester, bông cho tới lụa. Chất phủ mới cũng có tiềm năng được phủ lên quần áo trẻ em, quần áo bệnh viện, đồ thể thao, quân phục và áo mưa Với sự phát triển cao của khoa học công nghệ, đặc biệt là công nghệ nano, trong thời gian tới người ta còn khám phá ra nhiều đặc tính ưu việt hơn nữa của bạc nano để tạo ra các loại vật dụng tiện ích, nâng cao chất lượng cuộc sống và tiến bộ xã hội. d. Ứng dụng của bạc nano- Hoạt tính diệt khuẩn Vật liệu bạc nano vừa kết hợp được những tính chất ưu việt của vật liệu nano, vừa kết hợp được những tính chất quý báu của Ag kim loại nên có rất nhiều ứng dụng quan trọng và thú vị, đặc biệt là trong lĩnh vực kháng khuẩn và xúc tác. Trong khuôn khổ bài khóa luận này, chúng tôi chỉ đề cập đến một ứng dụng quan trọng của bạc nano đó là hoạt tính diệt khuẩn của nó. Đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu giải thích hoạt tính diệt khuẩn của bạc. Tuy nhiên cơ chế chính xác của bạc và ion Ag+ tấn công vào vi sinh vật như thế nào thì không thực sự rõ ràng. Hiện nay, các nhà khoa học đưa ra 3 giả thiết về cơ chế diệt khuẩn này: Các nhóm thiol (-SH) trong thành tế bào của các vi sinh vật, virus đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất và năng lượng của chúng. Ion Ag+ có khả năng liên kết tạo các chất không tan với các nhóm thiol này và do vậy vô hiệu hoá khả năng hoạt động của chúng. Ag+ ngăn cản quá trình hô hấp của các vi sinh vật, virus do Ag+ có khả năng ức chế các enzim tham gia vào quá trình hô hấp như xitocrom, oxidaza, các muối của sucxinat dehydrogenaza Ag+ tấn công vào các AND của tế bào vi khuẩn, phá huỷ các mạch nucleotit bằng cách chuyển chỗ, làm đảo lộn các liên kết Hidro giữa các nhóm purin và các nhóm pyrimidin liền kề nhau. Tuy là chất độc đối với các loài vi khuẩn, virus nhưng Ag lại không độc hại với các tế bào sống của cơ thể con người và động thưc vật. Chính vì vậy mà Ag là một vật liệu kháng khuẩn lý tưởng. Người ta đã nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của hạt bạc nano trên vi khuẩn Gam âm E.coli. Kết quả nghiên cứu cho thay rằng: Tác dụng diệt khuẩn của các hạt nano bạc là phụ thuộc vào kích thước. Chỉ các hạt bạc nano có đường kính khoảng 1-10nm với diện tích bề mặt rất lớn làm tăng hoạt tính hóa học của chúng là tương tác với vi khuẩn nhiều hơn cả. [15,16] 1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmisson Electron Microscope – TEM) [6] Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) là phương pháp cho phép sử dụng chùm tia electron năng lượng cao để quan sát các vật thể rất nhỏ. Độ phóng đại của TEM là 400.000 lần đối với nhiều vật liệu và thậm chí lên đến 15 triệu lần đối với các nguyên tử. Với ưu thế về độ phóng đại rất lớn, TEM là công cụ đặc biệt quan trọng trong việc nghiên cứu các vật liệu nano. Nguồn cấp electron Thấu kính hội tụ Mẫu Phóng ảnh to Ảnh Màn hình hiển thị Hình 3. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi điện tử truyền qua TEM. Nguyên lý làm việc của máy TEM được mô tả như sau: Chùm electron được tạo ra từ nguồn sau khi đi qua các thấu kính hội tụ sẽ tập trung lại tạo thành một dòng electron hẹp. Dòng electron này tương tác với mẫu và một phần xuyên qua mẫu. Phần truyền qua đó được hội tụ bằng một thấu kính và tạo ảnh. Ảnh sau đó sẽ được truyền đến bộ phận phóng đại. Cuối cùng tín hiệu tương tác với màn huỳnh quang và sinh ra ánh sáng cho phép người dùng quan sát được ảnh. Phần tối của ảnh đại diện cho vùng mẫu đã cản trở, chỉ cho một số ít electron xuyên qua (vùng mẫu dày hoặc có mật độ cao). Phần sáng của ảnh đại diện cho những vùng mẫu không cản trở, cho nhiều electron truyền qua (vùng này mỏng hoặc có mật độ thấp). Ảnh TEM thu được sẽ là hình ảnh mặt cắt ngang của vật thể. Ảnh TEM có thể cung cấp thông tin về hình dạng, cấu trúc kích thước của vật liệu nano. 1.4. Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG NƯỚC SINH HOẠT VÀ NƯỚC THẢI 1.4.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có kích thước nhỏ bé, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng kính hiển vi. Các dạng vi sinh vật khác nhau không những về hình thái mà cả cấu tạo và đặc tính sinh học nữa. Tuy nhiên chúng có những đặc điểm chung sau. Kích thước nhỏ bé Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị Phân bố rộng, chủng loại nhiều 1.4.2. Nguồn ô nhiễm và sự phân bố vi sinh vật trong nước và thực phẩm Vi sinh vật sống ở khắp mọi nơi trên trái đất, từ đỉnh núi cao đến tận đáy biển sâu, trong không khí, trong đất, trong hầm mỏ, sông ngòi, ao hồ, trong thực phẩm hàng hóaNgay cả những nơi mà điều kiện sống tưởng chừng khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển của vi sinh vật như đáy đại dương. Sự phân bố của chúng hoàn toàn không đồng nhất mà rất khác nhau tùy thuộc vào đặc trưng của từng loại môi trường. Phần lớn các vi sinh vật xâm nhập vào nước là từ đất khi mưa hoặc bụi do không khí rơi xuống. Ngoài ra, nước còn nhiễm bẩn do rác thải công nghiệp, chế biến nông nghiệp chất thải sinh hoạt cùng phân người và phân gia súc. Chất hữu cơ trong nước, các loại chất độc, tia tử ngoại, PH, môi trường, là những yếu tố có tính chất quyết định đến sự tăng số lượng cũng như các chất dinh dưỡng vi sinh vật. Nước càng bẩn, càng có nhiều chất hữu cơ thì số lượng vi sinh vật càng nhiều và sự phát triển vi sinh vật của chúng trong nước càng nhanh. Trong nước có nhiều loại vi sinh vật: Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Nhưng chủ yếu vẫn là vi khuẩn. Số lượng vi sinh vật khác nhau khi ở trong các nguồn nước khác nhau. Trong môi trường nước ngọt, do sự nhiễm khuẩn từ đất nên hầu hết các vi sinh vật có trong nước là từ đất, tuy nhiên với số lượng và chủng loại khác nhau. Ở ao hồ và sông, hàm lượng chất dinh dưỡng cao hơn ở nước ngầm và suối nên thành phần vi sinh vật ở đây phong phú hơn nhiều. Ở những nơi nhiễm bẩn bởi nước thải sinh hoạt còn có mặt các khuẩn đường ruột và các vi khuẩn gây bệnh khác. Các vi khuẩn này chỉ sống trong một thời gian nhất định nhưng do nguồn nước thải đổ vào thường xuyên, nên lúc nào cũng có mặt. Đây chính là nguồn nhiễm vi sinh nguy hiểm nhất đối với sức khỏe con người. Nước biển có số lượng vi sinh vật nhỏ hơn nước sồng ngòi và ao hồ. Mặc dù hàm lượng muối trong nước biển khá cao nhưng số lượng vi sinh vật cũng không phải là ít. Thường trong một lít nước biển thay đổi từ 35 đến vài nghìn vi khuẩn. Nước giếng phun và nước giếng ngầm có số lượng vi sinh vật tương đối ít vì nước đã thấm qua đất như một màng lọc tự nhiên rất tốt nên hầu hết vi khuẩn bị giữ lại. Số lượng vi khuẩn trong nước máy phụ thuộc trực tiếp vào nguồn nước cung cấp. Nếu lấy từ nguồn nước ngầm thì rất ít vi khuẩn, nếu lấy từ nguồn nước sông, hồ...thì dù qua hệ thông lọc cũng còn sót lại một số vi khuẩn đáng kể. Trong nước cất và nước tiệt trùng hầu như không có vi khuẩn. Đôi khi cũng có một số ít vi khuẩn do tiếp xúc với dụng cụ hoặc từ không khí rơi vào. Do đó đây là hai môi trường tốt để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. 1.4.3. Đặc điểm E.coli, coliform Coliform Coliorm là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, có khả năng lên men lactozơ sinh axít là sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Trong thực tế phân tích, coliform còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh lauryl Sulphat và canh Briliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm coliform hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Nhóm coliform gồm 4 giống là: Escherichia với một loại duy nhất là E.coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua thử nghiệm Indol (I ), Metyl red (MR), Vgesproskauer (VP) và Citrat (IC) thường được gọi tắt là IMVIC . Nhóm coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị số lượng của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng của nhóm này được chia thành hai nhóm nhỏ là coliform và faecal colifrom. Colifrom phân (faecal colifrom hay E.coli giả định) là colifrom chịu nhiệt có khả năng sinh Idol khi được ủ ở 24giờ ở 44.50C trong canh Triptone. Colifrom phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm ,nước uống cũng như để chỉ thị sự nhiễm phân trong mẫu môi trường. Colifrom phân hiện diện với số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân. Hình 4. Hình dạng coliform E.coli E.coli là vi sinh vật hiếu khí tùy tiện hiện diện trong đường ruột của người và các loại động vật máu nóng. Hầu hết E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lí đường ruột.Tuy nhiên có bốn dòng có thể gây bệnh cho người và một số loại động vật là: Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (EPEC), Eterohaemorrhagic E.coli (EPEC) và Verocytoxin E.coli(VTEC). Trong các thành viên của nhóm faecal coliorm thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại lâu trong môi trường. Gần đây người ta có thể chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước ấm không bị nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến . Các dòng E.coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa . Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm dòng gây bệnh và khả năng đáp ứng của từng người. Hình 5. Hình dạng E.coli 1.4.4. Các phương pháp định lượng vi sinh vật Sự hiện diện của vi sinh vật có thể định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như: - Phương pháp đếm trực tiếp - Phương pháp đếm khuẩn lạc - Phương pháp màng lọc - Phương pháp MPN (Most Probable Number) - Phương pháp đo độ đục Trong khuôn khổ bài khóa luận này chúng tôi sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc. Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count). Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp này có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hoặc hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đếm kết quả. Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối. Ngược lại số lượng lạc khuẩn trên một đĩa quá nhỏ sẽ không có giá trị thống kê. Số lượng lạc khuẩn tối ưu từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Số lượng lạc khuẩn xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ, kết quả đếm thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony – forming unit). CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 2.1.1. Hóa chất - Dung dịch AgNO3 0,1M: Cân 1,7g AgNO3 tinh thể PA, sau đó cho vào bình định mức 100ml đã có sẵn 20ml dung dịch HNO3 10%, lắc cho tan và định mức đến vạch. Bảo quản trong bình tối màu tránh ánh sáng mặt trời. Các dung dịch có nồng độ nhỏ hơn (như: 0.01M) được pha từ dung dịch trên. NH3 đậm đặc PA 35% (Trung Quốc). - Đường Gluco. Dung dịch PVA: Cân 1g tinh thể PA Polyvinylancol (PVA) hòa tan trong bình định mức 1000ml rồi định mức bằng nước cất đến vạch. - Fucshin bazơ bão hòa trong rượu. Agar. Hỗn hợp Microbiology gồm các chất sau: Pepton KH2PO4 Lactozơ K2HPO4 Brilliant NaCl Glucoza Na2HPO4 Cao nấm men NaOH Cao thịt bò Methyl red Sodium Lauryl Sulphat HCl Nước cất 1 lần, 2 lần. 2.1.2. Dụng cụ - Chai lấy mẫu. - Bình định mức 50ml, 100ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml. - Phễu lọc. - Tủ sấy, tủ điều nhiệt, bút đếm khuẩn lạc. - Bình nón, đũa thủy tinh. - Đĩa petri, cốc chịu nhiệt. - Máy khuấy từ. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Điều chế dung dịch Ag nano khi không có chất phân tán. Cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt dung tích 250ml các chất sau: nước cất, dung dịch đường Gluco 0.1M, dung dịch AgNO3 0.01M (có thể lấy lượng chất khử dư từ 2 đến 10 lần). Sau đó đặt hỗn hợp trên máy khuấy từ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (hoặc có thể đun đến nhiệt độ khoảng 600C). Sau đó cho vào hỗn hợp trên vài giọt NH3 1M. Sau khi cho NH3 vào, tiếp tục khuấy dung dịch dần dần chuyển từ trong suốt sang màu vàng nhạt rồi đậm dần. Đó chính là dung dịch Ag nano cần điều chế. 2.2.2. Điều chế dung dịch Ag nano khi có mặt của chất phân tán. Cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt dung tích 250ml các chất sau: nước cất, dung dịch đường Gluco 0.1M, dung dịch AgNO3 0.01M (có thể lấy lượng chất khử dư từ 2 đến 10 lần), dung dịch PVA (ở đây PVA đóng vai trò là chất phân tán). Sau đó đặt hỗn hợp trên máy khuấy từ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (hoặc có thể đun đến nhiệt độ khoảng 600C). Sau đó cho vào hỗn hợp trên vài giọt NH3 1M. Sau khi cho NH3 vào, tiếp tục khuấy dung dịch dần dần chuyển từ trong suốt sang màu vàng nhạt rồi đậm dần. Ta được dung dịch Ag nano. 2.3. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIỆT TRÙNG CỦA Ag NANO 2.3.1. Lấy mẫu và khu vực lấy mẫu Mẫu nghiên cứu được lấy ở 2 bên bờ sông, mẫu được đựng trong chai sạch. Sông Kim Ngưu được lựa chọn để lấy mẫu, khu vực sông này chứa rất nhiều nguồn thải từ các nhà máy, và nước thải sinh hoạt của các hộ dân đổ ra từ 2 bên bờ sông. 2.3.2. Phân tích mẫu Dùng phễu lọc, lọc mẫu để loại bỏ cặn, váng có màu. Để không ảnh hưởng tới màu khi hiện trên môi trường nuôi cấy. Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần, 100 lần, 1000 lần, định mức bằng bình định mức. 2.3.3. Thực nghiệm xác định E.coli, coliform Môi trường Endo Đây là môi trường dinh dưỡng thích hợp để định lượng coliform và E.coli trong nước và trong thực phẩm. Ngoài ra người ta cũng có thể định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí khi điều chỉnh pH ổn định. Thành phần: - 0,5g Agar. - 3,65g hỗn hợp Microbiology. - 0.5ml fucshin bazơ bão hòa trong rượu. Hòa tan các chất trong 1000ml nước cất, pH = 7.5. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút. 2.3.4. Định lượng coliform, coliform phân. Nguyên tắc Nuôi cấy một lượng nhất định mẫu lên môi trường Endo. Môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin có khả năng ức chế vi