Đề tài Nghiên cứu hóa học trên loài địa y Parmotrema tsavoense của (Duong TH, 2015)[4], (Huynh BLC, 2014) [5]

lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất A18 Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất A18 Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất A18 Phụ lục 5. Phổ MS của hợp chất A18 1 LỜI MỞ ĐẦU Vào những năm giữa thế kỉ 19, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu các cấu trúc hóa học của hợp chất có trong địa y và thử nghiệm hoạt tính của chúng. Trong quá trình thử nghiệm ấy, các nhà nghiên cứu nhận thấy hoạt tính của các hợp chất có thể ức chế nhiều loại vi khuẩn, virus. Vì vậy, các loại thuốc được điều chế và tổng hợp từ các hợp chất thiên nhiên của các loài địa y dần được phát triển. Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh. Trong những năm gần đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến. Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, phẩm nhuộm, nước hoa (Muller, 2001)[1]. Theo các tác giả Boustie (2005)[2], Huneck (1999)[3], Muller (2001)[1] từ xưa cho đến nay có khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử nghiệm các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme Xuất phát từ những ứng dụng y học của các nhà nghiên cứu và kế thừa những nghiên cứu đã có về chi Parmotrema trong nước cũng như nghiên cứu hóa học trên loài địa y Parmotrema tsavoense của (Duong TH, 2015)[4], (Huynh BLC, 2014)[5] tôi tiếp tục nghiên cứu trên loài địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow nhằm cô lập các hợp chất phenolic có nhiều hoạt tính sinh học. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa và phân loại địa y Địa y là một dạng thực vật bậc thấp, là kết quả cộng sinh giữa nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont), thường là tảo (algae). Địa y sinh sản theo phương thức sinh sản vô tính. Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được tìm thấy. Thông thường địa y được chia thành 3 dạng chính:  Dạng khảm (crustose lichen): hình vảy, chặt và dán vào giá thể.  Dạng phiến (foliose lichen): hình lá với nhiều thùy như lá cây.  Dạng sợi (fructicose lichens): hình cành, sợi, như bụi cây. Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, ), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi và cộng sự, 2008)[6]. 1.2 Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y  Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao.  Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại.  Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi và cộng sự, 2008)[6].  Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng. Pleopsidium flavum (Crustose lichen) Lobaria linita (Foliose lichen) Usnea longissima (Fructicose lichens) Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y 3 1.3 Nghiên cứu hóa học về các hợp chất trong địa y Có nhiều cách phân loại các hợp chất trong địa y. Tuy nhiên, các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (Hình 1.2) (Huneck, 1997)[7].  Nguồn gốc shikimic acid: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic.  Nguồn gốc mevalonic acid: triterpenoid.  Nguồn gốc acetate-malonate (polyketide): các acid dây dài và các acid phenol. 1.4 Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema  Parmotrema praesorediosum (+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (15) và chloroatranorin (16) được cô lập bởi David F. và cộng sự (1990)[8]. Lecanoric acid (18) và stictic acid (22) được cô lập bởi Ramesh P. và cộng sự (1994)[9]. Huynh B. L. Chi và cộng sự đã cô lập được prasoether A (47), zeorin (55), và 1β,3β-diacetoxyhopan-29-oic acid (56) (2011)[10].  Parmotrema sancti-angelii Atranorin (15), lecanoric acid (18) và α-collatolic acid (30) được cô lập bởi Neeraj V. và cộng sự (2011)[11]. Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y Tảo Nấm 4 Hà Xuân Phong (2012)[12] đã cô lập được 10 hợp chất từ loài địa y Parmotrema sancti-angelii: 8-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H- isochromen-1-one (42), gyrophoric acid (17), lecanoric acid (18), orsellinic acid (5), methyl orsellinate (6), methyl β-orsellinate (9), methyl haematomate (10) và ba hợp chất bicyclo mới Sancti A-C (52-54). Methyl -orsellinate (9), salazinic acid (20) và atranorin (15) được cô lập bởi Nguyen Thi Thu Tram và cộng sự (2016)[13].  Parmotrema conformatum Protocetraric acid (25), malonprotocetraric acid (27) và (+)-(12R)-usnic acid (49) được cô lập bởi Keogh M. F. (1977)[14].  Parmotrema dilatum Depside atranorin (15), các depsidone salazinic acid (20), norstictic acid (23), hypostictic acid (24) và protocetraric acid (25) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi Honda N. K. và cộng sự (2010)[15].  Pamotrema lichexanthonicum Depside atranorin (15), depsidone salazinic acid (20) và xanthone lichexanthone (50) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema lichexanthonicum bởi Micheletti A. C. và cộng sự (2009)[16].  Parmotrema mellissii Methyl orsellinate (6), ethyl orsellinate (7), n-butyl orsellinate (8), methyl β- orsellinate (9), methyl haematommate (10), ethyl chlorohaematommate (11), atranorin (15), chloroatranorin (16), α-alectoronic acid (29), α-collatolic acid (30), 2′′′-O-methyl- α-alectoronic acid (31), 2′′′-O-ethyl-α-alectoronic acid (32), dehydroalectoronic acid (33), dehydrocollatolic acid (34), parmosidone A (35), parmosidone B (36), parmosidone C (37), isocoumarin A (42), isocoumarin B (43), β-alectoronic acid (44), 2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (45), 2′′′-O-ethyl-β-alectoronic acid (46), (+)-(12R)- usnic acid (49) và skyrin (51) được cô lập từ loài địa y Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy (2012)[17].  Parmotrema nilgherrense α-Alectoronic acid (29), α-collatolic acid (30) và dehydrocollatolic acid (34) được cô lập bởi Kharel M. K. và cộng sự (2000)[18]. Depside atranorin (15) được cô lập bởi Neeraj V. và cộng sự (2011)[11]. 5  Parmotrema planatilobatum Năm 2011, Duong Thuc Huy[10] và cộng sự đã cô lập được 7 hợp chất gồm có methyl β-orsellinate (9), methyl orsellinate (6), orsellinic acid (5), methyl haematommate (10), atranorin (15), lecanoric acid (17), (+)-(12R)-usnic acid (49). Năm 2012, orcinol (4), gyrophoric acid (17), protocetraric acid (25), 9’-O- methylprotocetraric acid (26) và methyl 2-(3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl)-2,4- dihydroxy-6-methylphenoxy)-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (48) được cô lập bởi Duong Thuc Huy và cộng sự[19]. 8-(2,4- dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen- 1-one (42), 8-(2,4- dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-methoxy-3-pentyl-1H- isochromen-1-one (43), -collatolic acid (44) và lichesterinic acid (3) được cô lập bởi Duong Thuc Huy và cộng sự (2014)[20].  Parmotrema reticulatum Atranorin (15), chloroatranorin (16), salazinic acid (20) và consalazinic acid (21) được cô lập từ cao acetone bởi Fazio A. T. và cộng sự (2009)[21].  Parmotrema saccatilobum Atranorin (15) và chloroatranorin (16) được cô lập từ cao n-hexane của loài địa y Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T. S. và cộng sự (2009)[22].  Parmotrema stuppeum Orsellinic acid (5), methyl orsellinate (6), atranorin (15) và lecanoric acid (17) được cô lập bởi Jayaprakasha G. K. (2000)[23].  Parmotrema subisidiosum Depside atranorin (15) và hai depsidone salazinic acid (20) và consalazinic acid (21) được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D. G. và cộng sự (1980)[24].  Parmotrema tsavoense Parmosidone A-E (35-39) được cô lập bởi Duong Thuc Huy và cộng sự (2015)[25]. Protocetraric acid (25), 9’-O-methylprotocetraric acid (26), virensic acid (28), (+)- prasoediosic acid (1), atranorin (15), methyl haematommate (10), methyl -orsellinate (9), methyl orsellinate (6) và zeorin (55) được cô lập bởi Bui. Thi Lan Anh và cộng sự (2015)[26]. Methyl (E)-2,4-dihydroxy-6-methyl-3-(3-oxobut-1-en-1-yl)benzoate (12), atranol (13) và 2-O-methylatranol (14) được cô lập bởi Duong Thuc Huy (2017)[27]. 6 Parmosidone F (40) và atranol (13) được cô lập bởi Nguyen Thi Quynh Nhu và cộng sự (2017)[28]. Parmosidone G (41) và methyl (E)-2,4-dihydroxy-6-methyl-3-(3- oxobut-1-en-1-yl)benzoate (12) được cô lập bởi Nguyen Ngoc Man (2017)[29].  Parmotrema tinctorum Isolecanoric acid (19) được cô lập bởi Sakurai A. và cộng sự (1987)[30]. Ethyl orsellinate (7) được cô lập bởi Santos L. C. và cộng sự (2004)[31]. Atranorin (15) và lecanoric acid (18) được cô lập bởi Honda N. K. và cộng sự (2013)[32]. Các acid béo Hợp chất phenolic đơn vòng Depside Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema 7 Depsidone Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp) 8 Diphenylethers Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp) 9 1.5 Vai trò của địa y Ứng dụng trong dược học và y học Các hợp chất từ địa y chủ yếu có hoạt tính kháng virus, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, gây độc tế bào, Một số hợp chất từ địa y là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả. Protolichesterinic acid được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[17]. Một số lượng lớn các hợp chất địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, evernic acid, leprapinic acid và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid và dẫn xuất, usnic acid và dẫn xuất. Trong các hợp chất địa y, usnic acid và dẫn xuất của nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn (Bảng 1.1) (Muller 2001)[1]. Các hợp chất anthraquinone có hoạt tính kháng virus. Hypericin có hoạt tính chống lại sự sao chép ngược của virus HIV. Depside và depsidone có hoạt tính ức chế sự sao chép của virus HIV dựa vào đặc điểm cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11- one của depsidone được đề nghị bởi Neamati. Depside có hoạt tính khá yếu trong khi những β-depsidone có hoạt tính mạnh hơn. Acid béo loại γ-butyrolactone cũng có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV (Bảng 1.2) (Muller, 2001)[1]. Bên cạnh đó, hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là usnic acid. Cách đây 3 thập niên, usnic acid được tiến hành thử nghiệm lần đầu đối với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và Kopperman (1975)[33]. Theo kết quả nghiên cứu, usnic acid có tính thân dầu (lipophilicity) và tính này có ảnh hưởng quan trọng đối với khả năng gây độc tế bào. Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế bào tương đối (Bảng 1.3) (Boustie, 2010) [34]. Ngoài ra, một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme (Bảng 1.4) 10 Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y Hợp chất Vi khuẩn Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Protolichesterinic acid Helicobacter pylori Methyl orsellinate, ethyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematommate Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, pannarin Leishmania spp Emodin, physcion Bacillus brevis Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) 11 Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y Hợp chất Virus và enzyme của virus Depsidone: virensic acid và dẫn xuất tương tự Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Nhân bản của HIV (+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, dichloroemodin, 7-chloro-1-O-methylemodin, 7-cloroemodin, 5,7- hypericin, HIV, cytomegalovirus và các virus khác Bảng 1.3. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào (-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCat Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-chloropannarin, sphaerophorin Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất, euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, salazinic acid, stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột Psoromic acid, chrysophanol, emodin và dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu 12 Bảng 1.4. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y Hợp chất Enzyme bị ức chế Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Baeomycesis acid 5-Lipoxygenase Bis-(2,4-dihydroxy-6-n-propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết từ Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và Letharia vulpina Tyrosinase Chrysophanol Glutathione reductase Confluentic acid, 2β-O-methylperlatolic acid Monoaminoxidase B 4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglandin biosynthesis (+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV) Vulpinic acid Phosphorylase Norsolorinic acid Monoamino oxidase Physodic acid Arginine decarboxylase Usnic acid Ornithine decarboxylase Ứng dụng trong nông nghiệp Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển đối với thực vật bậc cao (Bảng 1.5). Ngoài ra, một số hợp chất phenol đơn vòng, depside và depsidone còn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài giun, ấu trùng, ốc, Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia. Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis. Một số hợp chất depside, depsidone, dibenzofuran như atranorin, pulvinic acid dilactone, stictic acid, norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, usnic acid làm giảm sự tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống còn của chúng. 13 Bảng 1.5. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính Barbatic acid, lecanoric acid, diffractaic acid, 4-O-demethylbarbatic acid, evernic acid, β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic acid Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật Evernic acid Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina Lecanoric acid Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa Usnic acid Ức chế sự nảy mầm và phát triển của Lepidium sativum Ứng dụng trong mĩ phẩm và công nghiệp nước hoa Trong công nghiệp nước hoa, usnic acid được sử dụng phổ biến, nhất là công nghiệp nước hoa Pháp. Ngoài ra, atranorin, pannarin, gyophoric acid và usnic acid còn được áp dụng trong việc điều chế thuốc rám nắng. 14 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1 Máy móc, thiết bị, hóa chất Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Phòng Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM (phổ 1H-NMR được đo ở tần số 500 MHz và phổ 13C-NMR được đo ở tần số 125 MHz). Dung môi sử dụng là n-hexane, chloroform, acetone, ethyl acetate và acetic acid được cung cấp bởi hãng Chemsol (Việt Nam). Sắc kí cột pha thuận sử dụng silica gel kích thước hạt (0.040–0.063 mm, Merck). Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng 20 cm x20 cm phủ silica gel 60 F254 (Merck). 2.2 Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất Loài địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swinscow) Krog & Swinscow thu hái trên đá trên núi Tà Cú, tỉnh Bình Thuận (tháng 8/2012-12/2012). Tên khoa học được xác định bởi tiến sĩ Wetchasart Polyiam, Tổ nghiên cứu địa y, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học, Đại học Ramkhamhaeng, Bangkok, Thái Lan. Mẫu ký hiệu số US-B027 và được lưu trong quyển tiêu bản thực vật tại bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá, Đại học Khoa học Tự nhiên. Hình 2.1. Loài địa y Parmotrema tsavoense Bột khô địa y nghiền nhỏ (1,350 g) được ngâm dầm trong methanol và dịch chiết cô quay dưới áp suất thấp. Trong quá trình methanol bay hơi, tủa trắng P (30.3 g) xuất hiện dần và được lọc riêng. Phần dung dịch lọc còn lại được tiếp tục cô quay thu được cao methanol thô (249.8 g). Phần cao methanol thô đã được tiến hành nghiên cứu bởi Duong TH (2015) [5]. Phần bột địa y khô còn lại tiếp tục được ngâm dầm trong acetone thu được cao acetone thô AC (8.54 g). Tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường trên 15 cao acetone, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acetic acid (12:5:1:1) để thu được 10 phân đoạn AC0 (341.6 mg), AC1 (1.2 g), AC2 (1.3 g), AC3 (209.0 mg), AC4 (264.9 mg), AC5 (1.31 g), AC6 (476.3 mg), AC7 (971.1 mg), AC8 (1.2 g) và AC9 (1.1 g). Phân đoạn AC5 (1.31 g) được thực hiện sắc ký cột, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acid acetic (30:5:1:1) để thu được 8 phân đoạn kí hiệu từ AC5.1 đến AC5.8. Từ phân đoạn AC5.5 tiến hành sắc ký cột giải ly nhiều lần thu được hợp chất A18 (2.3 mg). 16 B ộ t đ ịa y n g h iề n n h ỏ ( 1 ,3 5 0 g ) T ủ a P ( 3 0 .3 g ) C a o M eO H t h ô ( 2 4 9 .8 g ) B ộ t đ ịa y c ò n l ạ i C a o A c th ô ( 8 .5 4 g ) A C 9 1 .1 g A C 8 1 .2 g A C 7 9 7 1 .1 m g A C 6 4 7 6 .3 m g A C 5 1 .3 1 g A C 4 2 6 4 .9 m g A C 3 2 0 9 .0 m g A C 1 1 .2 g A C 2 1 .3 g A C 0 3 4 1 .6 m g A C 5 .7 A A c5 .6 A C 5 .5 7 8 .4 m g A C 5 .4 A C 5 .3 A C 5 .2 A C 5 .1 A 1 8 2 .3 m g A C 5 .8 N g âm d ầm t ro n g M eO H N g âm d ầm t ro n g A c S K C H :E A :A c: A cO H 1 2 :5 :1 :1 S K C H :E A :A c: A cO H 3 0 :5 :1 :1 S K C C :E A :A c 8 :1 :3 H ìn h 2 .2 . S ơ đ ồ q u y t rì n h l y t rí ch v à c ô l ậ p c á c h ợ p c h ấ t tr ên l o à i đ ịa y P a rm o tr em a t sa vo en se 17 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất A18 Hợp chất A18 thu được từ phân đoạn cao acetone thô của loài địa y Parmotrema tsavoense là chất bột, màu trắng. Phổ 1H-NMR (Phụ lục 1). Phổ 13C-NMR (Phụ lục 2). Phổ HSQC (Phụ lục 3). Phổ HMBC (Phụ lục 4). Phổ MS (Phụ lục 5). 3.2 Biện luận cấu trúc phổ Phổ 1H-NMR ở vùng từ trường yếu cho thấy sự hiện diện một tín hiệu của nhóm hydroxy tại δH 11.30 (1H, s), hai tín hiệu proton của nhóm olefin mũi đôi tại δH 8.12 (1H, d, J =16.5 Hz) và δH 7.24 (1H, d, J =16.5 Hz) ghép đôi với nhau với hằng số ghép J =16.5 Hz giúp xác định cấu hình trans của chúng. Ngoài ra phổ còn cho thấy hai tín hiệu của hai proton gắn trực tiếp với vòng thơm mũi đơn tại δH 6.70 (1H, s) và 6.58 (1H, s), một tín hiệu của nhóm methylene mũi đơn tại δH 4.10 (2H, s), một tín hiệu của nhóm methoxy mũi đơn tại δH 3.87 (3H, s) và bốn tín hiệu của nhóm methyl tại δH 2.5 (3H, s), 2.34 (3H, s), 2.32 (3H, s) và 2.09 (3H, d, J =1.1 Hz). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất A18 có sự hiện diện của hai carbon olefin (δC 132.8 và 131.1), hai carbon methine thơm (δC 115.6 và 113.3) một nhóm methylene (δC 20.8), một nhóm methoxy (δC 51.2) và năm nhóm methyl (δC 26.9, 19.4, 18.5, 17.2 và 8.0) và các carbon tứ cấp khác. Phân tích độ dịch chuyển hóa học của hai proton nhóm olefin mũi đôi tại δH 8.12 và 7.24, chứng tỏ chúng phải có sự cộng hưởng với nhóm carbonyl lân cận (-CH=CH- C(=O)-) và nhóm CH liên kết ở vị trí  với nhóm -C(O)- có độ chuyển dịch hóa học ở vùng từ trường thấp hơn do hiệu ứng cộng hưởng ở C-8. Cụ thể, H-8 liên kết với C-8 tại δC 132.8 và H-10 liên kết với C-10 tại δC 131.1. Trên phổ HMBC nhận thấy sự tương quan của proton H-8 với những carbon tại δC 197.7 (C-11), 162.5 (C-4) và 114.0 (C-3) và proton nhóm methyl CH3-12 tương quan với những carbon tại δC 197.7 (C-11) và 131.1 (C-10) giúp xác định sự hiện diện của nhóm thế but-1-en-3-onyl (-CH=CH-C(O)-CH3-) tại C-3. Sự tương quan của proton H- 18 5 với những carbon tại δC 114.0 (C-3), 111.3 (C-1) và 19.4 (C-9) và proton của nhóm methyl CH3-9 tương quan với những carbon tại δC 115.6 (C-5) và 145.5 (C-6) giúp xác định vị trí lân cận của các nhóm methyl CH3-9 và H-5. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học của carbon C-4 giúp xác định carbon này gắn trực tiếp với oxygen. Từ đó suy ra được cấu trúc nhân A. Dựa theo dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của A18 và so sánh với furfuric acid[35], nhận thấy dữ liệu phổ của chúng có sự tương đồng trên nhân thơm A. Vì vậy, hợp chất phải sở hữu khung sườn depsidone. Độ dịch chuyển hóa học 1H-NMR và 13C-NMR của nhóm methylene CH2-8’ giúp xác định nhóm này phải liên kết với 2 nhân benzen. Trên phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methylene CH2-8’ tương quan với những carbon tại δC 118.3 (C-5”), 137.9 (C-6”), 143.9 (C-1’), 152.4 (C-5’) và 158.7 (C-4”) đều có δC >100 ppm giúp củng cố nhận định là nhóm methylene phải liên kết trực tiếp với 2 nhân thơm B và C. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học của carbon C-1’ và C-5’ và C-4” giúp xác định 3 carbon này gắn trực tiếp với oxygen. Ở nhân B, phổ HMBC cho tương quan của proton H-2’ với những carbon tại δC 144.2 (C-4’), 117.6 (C-6’) và 17.2 (C-7’) và proton của nhóm methyl CH3-7’ tương quan với những carbon tại δC 144.2 (C-4’), 113.3 (C-2’) và 128.5 (C-3’) giúp xác định các proton H-2’ và nhóm methyl CH3-7’ ở lân cận nhau. Theo tính toán độ chuyển dịch hóa học các carbon trên nhân thơm B và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất A18 với các tài liệu tham khảo của furfuric acid[35] và các chất tương tự từ đó xác định vị trí nhóm methylene trên nhân thơm B. Từ đó xác định được cấu trúc nhân B. Ở nhân C, phổ HMBC có proton của nhóm methyl CH3-9” tương quan với carbon tại δC 118.3 (C-5”), 137.9 (C-6”) và 106.2 (C-1”) giúp xác định nhóm thế methyl này nằm kế cận với nhóm thế methylene CH2-8’. Proton của nhóm methyl CH3-8” tương quan với những carbon tại δC 109.3 (C-3”) và 158.7 (C-4”) giúp xác định vị trí của nhóm này trên nhân thơm C. Proton của nhóm 7”- OCH3 tương quan với carbon tại δC 172.7 (C-7”) giúp xác định nhóm methyl ester tại C-7”. Dựa vào các dữ liệu trên và so sánh với dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của furfuric acid nhận thấy có sự tương đồng trên nhân C, từ đó xác định cấu trúc nhân C của hợp chất A18 giống nhân C của furfuric acid. Ngoài ra, khối phổ phân giải cao của hợp chất A18 xuất hiện mũi ion giả phân tử tại m/z bằng 547.1605, tương ứng với công thức phân tử C30H27O10-. Theo tính toán dựa 19 trên cấu trúc đã xác định ta thấy ion [M-H]- có giá trị m/z là 547.1600, chênh lệch 0.5‰. Từ đó giúp khẳng định một lần nữa cấu trúc của hợp chất A18. Vậy hợp chất A18 có cấu trúc được xác định như Hình 3.1, đặt tên là Parmosidone H. Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của hợp chất A18 20 Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất A18 và furfuric acid A18 Furfuric acid N δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δC 1 111.3 112.7 2 N.D 164.0 3 114.0 111.7 4 162.5 163.7 5 6.70 (1H, s) 115.6 6.76 (1H, s) 116.9 6 145.5 151.6 7 N.D 160.7 8 8.12 (d, 1H, J =16.5 Hz) 132.8 10.55 (1H, s) 191.7 9 2.09 (d, 3H, J =1.1 Hz) 19.4 2.10 (3H, s) 20.1 10 7.24 (d, 1H, J =16.5 Hz) 131.1 - - 11 197.7 - - 12 2.34 (3H, s) 26.9 - - 1’ 143.9 155.9 2’ 6.58 (1H, s) 113.3 118.5 3’ 128.5 134.7 4’ 144.2 142.5 5’ 152.4 145.4 6’ 117.6 113.7 7’ 2.32 (3H, s) 17.2 2.23 (3H, s) 14.4 8’ 4.10 (2H, s) 20.8 3.97 (2H, s) 21.4 9’ - - 171.0