Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM)

Mục lục

Trang

Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06 2

Danh sách cán bộ tham gia 3

Danh sách các đon vị tham gia, phối hợp 5

tóm tắt Báo cáo 6

Những từ viết tắt 13

Lời nói đầu 14

Chương I Tổng quan tài liệu 24

1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 24

1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 24

1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 24

1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 25

1.1.2. Tóm lược về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng 26

1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 27

1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida 27

1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn 27

1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn. 28

1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida 28

1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida 31

1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 32

1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida 32

1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 33

1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). 33

1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) ư Somatic antigen. 34

1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida. 35

1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

spp gây ra ở gia cầm. 37

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. 37

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước. 39

1.2.3. Đặc điểm của Salmonella. 41

1.2.4. Tình trạng ngộ độcthức ăn do Salmonella. 41

1.2.5. Biện pháp phòng bệnh. 42

1.2.6. vắcưxin chống Salmonella cho gà 43

1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella 43

1.2.6.2. Sơ lược về kháng nguyên roi của S. typhimurium 44

1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có

khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella. 45

1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin 46

1.3. Bệnh Lở mồm Long móng 47

1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình

nghiên cứu về bệnh trong, ngoài nước. 47

1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh

trên thế giới và ở Việt Nam. 47

1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới. 49

1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong nước. 51

1.3.2. Vi rút gây bệnh LMLM. 52

1.3.2.1. Hình thái học. 52

1.3.2.2. Sức đề kháng của vi rút. 52

1.3.2.3. Đặc tính nuôi cấy. 52

1.3.3. Các phương pháp chẩn đoán. 53

1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng. 53

1.3.3.2. Đại cương về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. 53

1.3.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học. 54

1.3.3.3.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 54

1.3.3.3.2. Phản ứng trung hoà vi rút. 55

1.3.3.3.3. Phản ứng ELISA. 55

1.3.3.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác 56

1.3.3.4. Chẩn đoán vi rút học. 56

1.3.3.5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RTưPCR. 56

Chương II: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 58

A. Nguyên liệu 58

2.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng

chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lượng cao. 58

2.1.1. Động vật thí nghiệm. 58

2.1.2. Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng. 58

2.1.3. Dụng cụ máy móc thí nghiệm. 58

2.1.4. Môi trường, hoá chất 58

2.2. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và

S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 59

2.2.1. Động vật và sản phẩm động vật. 59

2.2.2. Các loại môi trường thông thường. 59

2.2.3. Các loại môi trường chuyên biết. 60

2.2.4. Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác. 62

2.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và

S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 62

2.3.1. Chủng vi sinh vật. 62

2.3.2. Động vật. 62

2.3.3. Plasmid. 62

2.3.4. Môi trường nuôi cấy. 63

2.3.5 Các dung dịch. 63

2.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RTưPCR. 64

2.4.1. Bệnh phẩm. 64

2.4.2. Nguồn bệnh phẩm. 64

2.4.3. Dung dịch bảo quản bệnh phẩm. 64

2.4.4. Tế bào BHKư 21 và môi trường nuôi cấy tế bào. 65

2.4.5. Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RTưPCR. 65

2.4.5.1. Mẫu ARN chuẩn. 65

2.4.5.2. Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RTư PCR. 65

2.4.5.3. Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng (cloning). 65

2.4.5.4. Thiết bị, máy móc. 66

2.4.5.5. Các cặp mồi đặc hiệu với vi rút LMLM type O, A , C hoặc Asiaư1. 66

B. Phương pháp nghiên cứu 66

3.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ

huyết trùng trâu bò chất lượng cao. 66

3.1.1. Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất vacxin. 66

3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi

khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR. 67

3.1.3. Kiểm tra độc lực của vikhuẩn đối với chuột nhắt trắng. 69

3.1.4. Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn – Saponin. 71

3.1.5. Kiểm nghiệm vắc xin 72

3.1.5.1. Kiểm tra vô trùng vắc xin. 72

3.1.5.2 Kiểm tra an toàn vacxin 72

3.1.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin. 72

3.1.5.3.1. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm. 72

3.1.5.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò. 72

3.1.6. Phương pháp xử lý số liệu. 76

3.1.6.1. Phương pháp tính chỉ số miễn dịch. 76

3.1.6.2. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê. 76

3.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium

bằng công nghệ vi khuẩn. 77

3.2.1. Các phương pháp vi sinh vật học thông thường. 77

3.2.2. Các phương pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin. 77

3.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh doS.enteritidis và S. typhimurium

bằng vi khuẩn biến nạp. 78

3.3.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn. 78

3.3.2. Phương pháp tổng hợp chuỗi (PCR). 78

3.3.3. Xử lý ADN bằng enzym hạn chế. 78

3.3.4. Phản ứng nối ghép gen. 79

3.3.5. Biến nạp vào E. coli. 79

3.3.6. Tách chiết ADN plasmid từ E. coli. 80

3.3.7. Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp. 81

3.3.8. Biến nạp plasmid vào nấm men P. pastoris bằng xung điện. 82

3.3.9. Western Blot, ELISA. 83

3.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RTưPCR. 84

3.4.1. Các phương pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của

Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế. 84

3.4.2. Phương pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm. 84

3.4.3. Phương pháp RTưPCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM. 86

3.4.3.1. Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô. 86

3.4.3.2. Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ngược. 86

3.4.3.3. Phản ứng PCR. 86

3.4.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR. 87

3.4.4. Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O

của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam. 88

3.4.4.1. Lai sản phẩm PCR vào vectortách dòng pCRR2.1 và biến nạp

vào tế bào khả biến (competent E. coli cells). 88

3.4.4.2. Tách chiết Plasmid. 89

3.4.4.3. Cắt bằng enzym giới hạn. 89

3.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM. 90

3.4.5.1. Phương pháp nuôi tế bào BHKư21 (Baby Hamster Kidney ư 21). 90

3.4.5.2. Phương pháp tách tế bào bám dính. 90

3.4.5.3. Phương pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHKư21. 90

Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 92

4.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ

huyết trùng trâu bò chất lượng cao. 92

4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ

trâu bò chết của các địa phương. 92

4.1.2. Tính tương đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P. multocida

chủng IR với đại diện các chủng P. multocida phân lập được. 95

4.1.3. Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả

năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò. 96

4.1.4. Kết quả xác định công thứcbổ trợ thích hợp và theo dõi độ

dài miễn dịch của vắc xin keo phènưsaponin. 97

4.1.5. Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phènư saponin chủng IR.98

4.1.6. Tính tương đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida

chủng IR với các chủng P. multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT

trâu bò tại Việt Nam. 99

4.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium

bằng công nghệ vi khuẩn. 99

4.2.1. Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn

nuôi gà giống. 99

4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. 100

4.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn

Salmonella phân lập được. 102

4.2.4. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập

được trên chuột nhắt trắng. 104

4.2.5. Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên

các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau. 105

4.2.6. Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 106

4.2.7. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập được 106

4.2.8. Kết quả xác định LD 50 của các chủng Salmonella phân lập được 107

4.2.9. Sản xuất thử nghiệm vacxin S.enteritidis và S. Typhimurium vô hoạt keo phèn 108

4.2.10. Kết quả thử thuần khiết vacxin 108

4.2.11. Kết quả thử vô trùng của vacxin 108

4.2.12. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng 109

4.2.13. Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị 110

4.2.14. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 110

4.2.15. Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà 111

4.2.16. Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin 111

4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidisvà S. typhimuriumbằng vi khuẩn biến nạp 113

4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 113

4.3.1.1. Đưa gen vào vectơ pCR2.1 113

4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 113

4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S.

typhimurium, S. enteritidis 114

4.3.1.1.3. Đưa sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 115

4.3.1.2. Đưa gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) 119

4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 120

4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3,sef14 trong nấm men P. pastoris 122

4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR 122

4.3.2.2. Đưa gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 123

4.3.2.3. Đưa gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 123

4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris 125

4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 126

4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC 126

4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng

nguyên toàn phần trên gà hậu bị 127

4.3.3.3. Western blot và ELISA 127

4.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3 131

4.3.5. Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3 132

4.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RTưPCR 134

4.4.1. Khái quát tình hình dịchbệnh LMLM tại Việt Nam

trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây 134

4.4.2. Diễn biến lâm sàngcủa bệnh trên bò và lợn 136

4.4.3. Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc

nghi mắc bệnh 138

4.4.3.1. Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 138

4.4.3.2. Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139

4.4.3.3. Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139

4.4.4. Thiết lập phương pháp RT–PCR để phát hiện vi rút

gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết 140

4.4.5. Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập tại tỉnh Qủang Trị 143

4.4.6. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng

trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM. 145

4.4.7. Kết quả ứng dụng phương pháp RTưPCR để chẩn đoán định

typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa 147

4.4.8. Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho

serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị 149

4.4.8.1. Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các

type O, A, C, và asiaư1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O 149

4.4.8.2. Kết quả giải trình trình tự nuclêotide 151

4.4.9. Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHKư21 153

4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 153

4.4.9.2. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHKư21 153

4.4.9.3. Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút

LMLM lên tế bào BHKư21 155

4.4.9.4. So sánh chẩn đoán vi rút LMLMbằng RTưPCR từ bệnh phẩm biểu

mô và từ bệnh phẩm biểu mô đã cấy chuyển trên tế bào 156

4.4.10. So sánh phương pháp ELISA và RTưPCR để chẩn đoánưđịnh typ virut LMLM 158

4.4.11. Nhận xét tổng quan về phương pháp RTưPCR trong

chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 160

Chương IVKết luận và đề nghị 163

Kết luận 163

I. Các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm 163

II. Về nội dung và phương pháp sử dụng 163

III. Về giải pháp khoa học công nghệ 164

IV. Các sản phẩm cụ thể 165

Đề nghị 165

Lời cảm ơn 166

Tài liệu tham khảo 167

253 trang | Chia sẻ: maiphuongdc | Lượt xem: 2834 | Lượt tải: 5

Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

u giá KT liều 2ml Hiệu giá KT liều 2,5ml Một số hình ảnh minh họa của đề tài Gan của gà bị nhiễm Salmonella Ruột tịt của gà bị nhiễm Salmonella Salmonella trên môi tr−ờng MSRV Salmonella trên môi tr−ờng XLD Salmonella trên môi tr−ờng Kligler 113 4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp 4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 Với mục tiêu thu nhận protein tinh sạch do gen fliC3, gm3, sef14 mã hóa kháng nguyên roi H: i của vi khuẩn S. typhimurium, H:gm, và kháng nguyên lông sef14 của S. enteritidis để đ−a vào thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở gà, chúng tôi đã nhân các gen này bằng ph−ơng pháp PCR, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng gen. Sau đó các gen này đ−ợc đ−a vào vectơ tách dòng pCR2.1 Các dòng gen đã đ−ợc đ−a vào vectơ này đ−ợc kiểm tra bằng các enzym hạn chế và đ−ợc nhân lên thành l−ợng lớn trong tế bào E. coli DH5α. Sau đó bằng enzym hạn chế NcoI và XhoI đã đ−ợc thiết kế ở tận cùng đầu ngoài gen, các gen đ−ợc cắt và đ−a vào vectơ biểu hiện pET22b(+) và đ−ợc biến nạp vào tế bào E. coli BL21 để biểu hiện gen. Quá trình sinh tổng hợp các kháng nguyên tái tổ hợp này đ−ợc kiểm soát Hình 3.1: Phân tích ADN genom trên gel agarose 0,8% 1: ADN hệ gen của S. enteritidis ATCC13076 2: ADN hệ gen của S. typhi murium 3: Thang ADN chuẩn (1Kb) chặt chẽ bằng sự có mặt của chất cảm ứng IPTG có trong môi tr−ờng. Kết quả đ−ợc trình bày chi tiết ở phần sau. 4.3.1.1. Đ−a gen vào vectơ pCR2.1 4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn Salmonella là tế bào vi khuẩn Gram âm. Chúng sẽ bị phá vỡ bởi lyzozym và SDS trong dung dịch TE. Lyzozym phân giải peptidoglycan (murein), phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn bằng cách cắt đứt các liên kết β(1-4) giữa các đơn vị cấu tạo nên peptidoglican là axit N-axetil muramic (M) và N-axetil glucozamin (G) [1]. SDS tạo sức căng bề mặt mạnh, đồng thời tạo môi tr−ờng nh−ợc tr−ơng, nhờ đó, tế bào ở thể nguyên sinh (protoplast) dễ dàng bị vỡ tung. Ngoài ra, SDS cùng EDTA có tác dụng bất 114 hoạt enzym phân giải ADN có sẵn trong tế bào vi khuẩn. Với tính năng tạo phức với các iôn hóa trị hai (Mg2+), EDTA cạnh tranh các iôn này với các enzym, làm mất yếu tố hoạt hóa của chúng. Toàn bộ protein của tế bào bị phân cắt bởi protein K không đặc hiệu và đ−ợc tách khỏi ADN hệ gen bằng dung dịch chloroform/isoamylalcohol. Sau khi li tâm, dung dịch chứa ADN hệ gen nằm ở pha trên đ−ợc thu nhận và làm tủa bằng cồn tuyệt đối. ADN hệ gen đ−ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agaroza 0,8%. Kết quả điện di đ−ợc trình bày trong hình 3.1. Với băng điện di đơn nhất, rõ nét chứng tỏ ADN hệ gen đã đ−ợctách chiết thành công, rất ít bị đứt gãy, có kích th−ớc đủ lớn, và không lẫn ARN. Tiếp theo, chúng tôi sử dụng ADN genom này để nhân gen fliC3, gm3, sef14 bằng kĩ thuật PCR. 4.3.1.1.2. Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S. typhi murium, S. enteritidis Dựa vào trình tự gen fliC, gm3, sef14 của S. typhimurium, S. enteritidis trong Ngân hàng gen, chúng tôi đã thiết kế các cặp mồi để nhân các gen. Các đoạn mồi để nhân gen trình tự nh− sau: Mồi nhân gen fliC3 từ S. typhimurium: fliC 91f: ACCATggATCgTCTgTCTTCCggTCTg fliC 1485r:TCTCgAgACgCAgTAAAgAgAggAC Mồi nhân gen gm3 mã hoá cho H:g,m từ S. enteritidis gm3f: CCCATggATgCACAAgTCATTAATACAAAC gm3r:TCTCgAgACgCAgTAAAgAgAggACgTT Mồi nhân gen sef14 từ S. enteritidis: sef14f:ACCATggATgCTggCTTTgTTggTAACAAA sef14r:ACTCgAggTTTTgATACTgCTgAACgTA Gen fliC3, gm3, sef14 đ−ợc nhân lên theo ch−ơng trình PCR nh− đã trình bày trong phần ph−ơng pháp. Mỗi chu kì của phản ứng PCR luôn bao gồm ba b−ớc cơ bản là làm biến tính ADN sợi kép thành sợi đơn, gắn mồi vào sợi đơn, và chuỗi bổ sung đ−ợc kéo dài nhờ enzym Taq polimeraza. Ngoài ra, enzym Taq polimeraza còn có vai trò gắn thêm nucleotit A vào đầu 3’ của ADN sợi kép tạo sản phẩm hoàn chỉnh của 115 phản ứng này. Việc gắn thêm nucleotit A vào sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc gắn gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 đ−ợc thiết kế có chứa thêm nucleotit T. Trên điện di đồ trong hình 3.2 ta thấy, sản phẩm PCR chỉ có một băng ADN đơn nhất, sắc nét, có kích th−ớc đúng nh− kích th−ớc của các gen đã đ−ợc dự đoán: gen fliC~1,4kb, gen gm3~1,5kb, sef14~0,5kb. Nh− vậy cặp mồi thiết kế để nhân gen là đặc hiệu và ch−ơng trình chạy phù hợp. 4.3.1.1.3. Đ−a sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 Sản phẩm PCR đ−ợc điều chỉnh đến nồng độ 20 àg/ml cho các phản ứng ghép nối tiếp theo. Vectơ pCR2.1-TOPO đã mở vòng sẵn tại vùng đa nối, mang một nucleotit T ở mỗi đầu dính 5’. Để ghép nối với vectơ, gen fliC3,gm3, sef14 đã đ−ợc gắn thêm nucleotit A vào đầu 3’ của mỗi mạch đơn trong phản ứng PCR nhờ enzym trùng hợp chuỗi Taq polymeraza. Các đầu dính bổ sung A,T sẽ bắt cặp với nhau giúp ghép nối đoạn gen fliC3 vào vectơ tách dòng. Phản ứng đ−ợc xúc tác bởi enzym T4-ligaza ở 16oC. Sau hai giờ tiến hành phản ứng ghép nối, hỗn hợp phản ứng đ−ợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α và đ−ợc cấy trải trên môi tr−ờng LB có bổ sung Ampixilin, IPTG, Hình 3.2: Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 0.8% Đ−ờng chạy 1, 4, 5: Thang ADN chuẩn (1Kb) Đ−ờng chạy 2, 3, 6: Sản phẩm PCR nhân gen fliC3, gm3, sef14 sef14 0,5 Kb 1 2 3 4 5 6 gm3 1,5 Kb fliC3 1,4 Kb 116 Xgal và ủ ở 37oC khoảng 12 giờ. Trên môi tr−ờng này chúng ta dễ dàng chọn lọc đ−ợc những dòng tế bào mong muốn nhờ màu sắc khuẩn lạc. Những dòng tế bào mang plasmid có chứa đoạn gen chèn vào sẽ có màu trắng còn khuẩn lạc chỉ chứa plasmid không có gen ngoại lai sẽ có màu xanh. Vì vậy, chúng tôi chọn ngẫu nhiên những khuẩn lạc màu trắng và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) để cấy chuyển vào dung dịch LB lỏng có bổ sung ampixilin. Tiếp theo, tế bào của các thể biến nạp đó đ−ợc thu nhận để tách plasmid kiểm tra. Plasmid tái tổ hợp đ−ợc thu nhận từ các thể biến nạp và đ−ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agaroza 0,8%. Kết quả trên hình 3.3 cho thấy plasmid tái tổ hợp có kích th−ớc lớn hơn so với plasmid gốc, vì chúng có băng điện di nằm cao hơn. Nh− vậy chứng tỏ vectơ tách dòng đã có gen ngoại lai chèn vào. Để chắc chắn đoạn gen ngoại lai chèn vào là gen fliC3, gm3, sef14 nh− mong muốn chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng các enzym hạn chế. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 3.3: Phân tích các dòng plasmid trên gel agarose 0,8% Đ−ờng chạy 1-3: Các dòng pCR2.1 mang gen fliC3 Đ−ờng chạy 1-10: Các dòng pCR2.1 mang gen gm3 Đ−ờng chạy 13-17: Các dòng pCR2.1 mang gen sef14 Đ−ờng chạy 4, 11, 12: Dòng pCR2.1 117 * Đối với vectơ pCR2.1 mang dòng gen fliC3, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng các enzym NcoI, EcoRV và NcoI+XhoI. Theo tính toán lí thuyết, nếu đúng đoạn gen fliC3 đã chèn vào vectơ, kết quả sản phẩm cắt t−ơng ứng với từng phản ứng sẽ nh− sau: (1) Với enzym NcoI: chỉ có một điểm cắt nằm ở một đầu mút của gen fliC3 và một nằm trong vectơ. Nếu gen gắn xuôi chiều vào plasmid (nh− hình 9 minh họa), sản phẩm cắt hoàn toàn sẽ gồm hai mảnh có kích th−ớc 3 Kb và 2,3 Kb. (2) Với enzym EcoRV, chúng tôi sẽ kiểm tra đ−ợc một điểm cắt nằm ở khoảng giữa của gen fliC3 và một điểm cắt nằm trên vectơ, sản phẩm cắt gồm hai mảnh có kích th−ớc 1 Kb và 4,3 Kb. (3) Với hỗn hợp enzym NcoI và XhoI, sản phẩm cắt hoàn toàn gồm ba mảnh lần l−ợt có kích th−ớc 1,4 Kb, 1,6 Kb và 2,3 Kb. Kết quả phân tích sản phẩm cắt trên gel agarose (Hình 3.4) cho thấy các đoạn ADN đ−ợc tạo ra sau khi cắt có kích th−ớc đúng nh− dự đoán. Plasmid pCR2.1 mang gen fliC đ−ợc đặt tên là pCRfliC3. * Đối với gen gm3 chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng EcoRI, KpnI và NcoI. Theo tính toán lý thuyết khi cắt bằng EcoRI, pCR2.1 mang gen gm3 sẽ cho ra đoạn gen có kích th−ớc 1,5 Kb. Khi cắt bằng KpnI, vectơ mang gen gm3 sẽ bị cắt thành hai đoạn gen kích th−ớc xấp xỉ 0,8 kb và 4,6 kb. Đặc biệt khi sử dụng enzyme NcoI, các dòng plasmid mang đoạn gen gm3 xuôi chiều sẽ cho ra các đoạn gen có kích th−ớc 2,3 kb và 3 kb. Kết quả (Hình 3.5) cho thấy các đoạnADN sau khi cắt có kích th−ớc đúng nh− dự đoán. Plasmid pCR2.1 mang gen gm3 đ−ợc đặt tên là pCRgm3. Hình 3.4: Phân tích sản phẩm cắt trên gel agaroza 0,8% Đ−ờng chạy 1: Thang ADN chuẩn (1Kb, Gibco) Đ−ờng chạy 2: pCRfliC3 cắt bằng NcoI Đ−ờng chạy 3: pCRfliC3 cắt bằng EcoRV 118 Đối với gen sef14, chúng tôi cắt kiểm tra bằng E. coRI. Đoạn gen nhỏ đ−ợc tạo ra sau khi cắt có kích th−ớc 0,5kb đúng nh− tính toán (Hình 3.6). Plasmid pCR2.1 mang gen sef14 đ−ợc đặt tên là pCRsef14. Các đoạn gen fliC3, gm3, sef14 trong vectơ pCRfliC3, pCRgm3, pCRsef14 đã đ−ợc đọc trình tự. Kết quả cho thấy các gen có trình tự nucleotit t−ơng Hình 3.5: Phân tích sản phẩm cắt vectơ pCR2.1 mang gen gm3 bằng các enzym hạn chế khác nhau trên gel agarose 0,8% Đ−ờng chạy 1-2, 5-6, 7-8: 2 dòng plasmid đ−ợc cắt kiểm tra bằng EcoRI, KpnI, NcoI Đ−ờng chạy 3, 6, 9: Thang ADN chuẩn (1Kb, Gibco) đồng rất cao (95%) với gen fliC mã hoá cho H:i của S. typhimurium, H:g,m, sef14 của S. enteritidis trên ngân hàng gen quốc tế. Nh− vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công các gen mã hoá cho kháng nguyên roi và kháng nguyên lông của vi khuẩn S. typhimurium, S. enteritidis trong vectơ tách dòng pCR2.1 Hình 3.6: Phân tích sản phẩm cắt pCR2.1 mang gen sef14 trên gel agarose 0,8% Đ−ờng chạy 1: Thang ADN chuẩn (1kb, Gibco). Đ−ờngchạy 2: pCR2.1 cắt bằng EcoRI. Đ−ờng chạy 3-7: pCR2.1 mang gen sef14 cắt bằng EcoRI 119 4.3.1.2. Đ−a gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) Vectơ pET22b(+) có kích th−ớc 5492 bps đ−ợc thiết kế chuyên biệt cho việc biểu hiện gen ngoại lai. Vùng đa nối bao gồm nhiều điểm nhận biết đặc hiệu cho enzym hạn chế tạo điều kiện ban đầu cho việc chèn gen ngoại lai vào vectơ theo đúng vị trí mong muốn. Vị trí này luôn nằm sau promotơ T7. Promotơ này điều khiển quá trình tổng hợp protein rất mạnh có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T7. Ngoài ra, gen kháng kháng sinh ampixilin giúp thể biến nạp mang vectơ này đ−ợc chọn lọc trong môi tr−ờng nuôi cấy có ampixilin. Để thực hiện việc chèn gen vào vectơ biểu hiện, đầu tiên chúng phải đ−ợc tạo các đầu dính t−ơng ứng bổ sung bằng hai enzym hạn chế. Các gen fliC3, gm3, sef14 đ−ợc giới hạn bởi hai enzym hạn chế NcoI, XhoI ở 2 đầu gen nhờ trình tự enzym đã đ−ợc thiết kế sẵn trong đoạn mồi nhân gen. Đoạn ADN fliC3, gm3, sef14 nằm trong plasmit pCRfliC3, pCRgm3, pCRsef14 đ−ợc cắt bằng NcoI+XhoI và đ−ợc thu lại bằng cột tinh sạch ADN. Song song với quá trình này, ADN plasmit pET22b(+) cũng đ−ợc cắt bằng 2 enzym giới hạn trên và loại bỏ nhóm photphat đầu 5’ bằng photphataza kiềm để tránh hiện t−ợng tự nối của vectơ và để tạo ra đầu dính t−ơng thích (Hình 3.7). Sau đó các đoạn gen đ−ợc nối với pET22b(+) đã mở vòng nhờ enzym ADN ligaza. Sản phẩm lai đ−ợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21, cấy trải trên môi tr−ờng LB có bổ sung ampixilin ở 37oC. Sau 12 giờ, số l−ợng khuẩn lạc mọc lên là khá nhiều và có kích th−ớc đồng đều. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra plasmit tr−ớc khi đ−a vào Hình 3.7: Phân tích plasmit trên gel agarose 0.8% Đ−ờng chạy 2, 4, 7: pET22b(+) Đ−ờng chạy 1, 3: pET22b(+) mang gen fliC3 Đ−ờng chạy 5, 6: pET22b(+) mang gen gm3 Đ−ờng chạy 5, 6: pET22b(+) mang gen sef14 biểu hiện. Các dòng plasmid đ−ợc tách từ các thể biến nạp đều cao hơn dòng plasmid pET22b(+) (Hình 3.8). Điều đó chứng tỏ các dòng plasmid đó đã có đoạn gen đ−ợc 120 chèn vào. Để chắc chắn chúng tôi đã cắt kiểm tra các dòng plasmid này bằng enzyme giới hạn NcoI và XhoI. Hình 3.8 cho thấy các đoạn gen đ−ợc tạo ra sau khi cắt có kích th−ớc đúng nh− tính toán. Điều này khẳng định rằng chúng tôi đã thiết kế thành công vectơ biểu hiện pET22b(+) mang các gen fliC3, gm3, sef14. Vectơ pET22b(+) mang gen fliC3, gm3, sef14 đ−ợc đặt tên theo thứ tự là pETfliC3, pETgm3, pETsef14. Các gen này sẽ đ−ợc kiểm tra khả năng biểu hiện trong tế bào E. coli BL21. 4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 Sau khi thiết kế thành công vectơ biểu hiện pETfliC3, pETgm3, pETsef14, chúng tôi tiến hành cảm ứng các dòng tế bào E. coli BL21 mang plasmit tái tổ hợp ở hai nhiệt độ là 28oC và 37oC với nồng độ chất cảm ứng IPTG là 1 mM. IPTG là hợp chất có khả năng t−ơng tác với chất ức chế operon Lac Z, giải phóng operon này trở lại hoạt động phiên mã bình th−ờng. Nhờ đó, đoạn gen ngoại lai nằm trong operon Lac Z đ−ợc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 fliC3 1,5 kb gm3 1,5 kb sef14 0,5 kb Hình 3.8: Phân tích sản phẩm cắt các dòng plasmid pET22b(+) mang đoạn gen ngoại lai trên gel agarose 0.8% Đ−ờng chạy 1-3: pET22b(+) mang gen fliC3 cắt bằng NcoI+XhoI Đ−ờng chạy 4, 5, 11: Thang ADN chuẩn (1Kb, Gibco) Đ−ờng chạy 6, 7: pET22b(+) mang gen gm3 cắt bằng NcoI+XhoI Đ−ờng chạy 8: pET22b(+) cắt bằng NcoI+XhoI Đ−ờng chạy 9, 10: pET22b(+) mang gen sef14 cắt bằng NcoI+XhoI 121 biểu hiện d−ới sự điều khiển của promotơ T7 nằm phía tr−ớc nó. Để biểu hiện protein tốt nhất trong điều kiện có chất cảm ứng, tế bào phải ở trong giai đoạn đang tăng tr−ởng. Vì vậy, tr−ớc khi bổ sung chất cảm ứng chúng tôi đã nuôi cấy làm t−ơi 1 thể tích dịch huyền phù trong 50 thể tích môi tr−ờng LB lỏng có bổ sung ampixilin đến OD600 đạt khoảng 0,8. Quy trình cảm ứng đ−ợc thực hiện nh− phần ph−ơng pháp đã trình bày. Mẫu tế bào E. coli mang plasmit tái tổ hợp pETfliC3 pETgm3, pETsef14 đ−ợc thu lại sau 3h nuôi cấy cảm ứng bằng cách li tâm và đ−ợc hòa lại vào l−ợng n−ớc vừa đủ chứa 1àg/ml PMSF và để trong -750C trong 1 giờ hoặc để qua đêm. Sau đó tế bào đ−ợc phá bằng ph−ơng pháp sốc nhiệt kết hợp Hình 3.9: Phân tích protein tổng số của các chủng E. coliBL21 mang gen fliC3, gm3, sef14 trên gel acrylamit 12,6% Đ−ờng chạy 1: Protein từ chủng E. coli BL21 mang pETfliC3 Đ−ờng chạy 2, 5: Thang protein chuẩn Đ−ờng chạy 3, 4: Protein từ chủng E. coli BL21 mang pET22b(+) Đ−ờng chạy 6: Protein từ chủng E. coli BL21 mang pETgm3 với lyzozym. Theo cách này, protein tái tổ hợp nằm trong khoang chu chất sẽ đ−ợc giải phóng và đ−ợc thu lại bằng cách li tâm tốc độ cao. Protein tách chiết đ−ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel polyacrylamit 12,6% (Hình 3.9). Chúng tôi đã làm thí nghiệm cảm ứng ở hai nhiệt độ khác nhau là 28oC và 37oC. Tuy nhiên, các kháng nguyên tái tổ hợp fliC3, gm3, sef14 chỉ đ−ợc tổng hợp tốt ở nhiệt độ 28oC. Theo tính toán băng protein tái tổ hợp của gen fliC3 có kích th−ớc 1410 bps sẽ quy định cho chuỗi polypeptit có trọng l−ợng phân tử khoảng 52 kDa. Trong thí nghiệm của chúng tôi, băng protein tái tổ hợp có kích th−ớc nằm ở khoảng giữa băng 66,2 kDa và băng 45 kDa của protein chuẩn. Vì vậy, chúng tôi nhận định protein tái tổ hợp thu đ−ợc có kích th−ớc xấp xỉ với protein fliC3 của vi khuẩn S. typhimurium. Cũng theo tính toán, gen gm3 sẽ mã hoá cho protein có kích th−ớc khoảng 55 kDa. Trong thí nghiệm của chúng tôi, protein đ−ợc tạo ra khi cảm ứng chỉ có kích th−ớc trên 40 kDa nhỏ hơn kích th−ớc dự đoán. Mặc dù vậy gen gm3 đã đ−ợc kiểm tra không bị lỗi và 122 khung đọc là đúng. Nguyên nhân protein đ−ợc tổng hợp ra có kích th−ớc nhỏ hơn có thể do trong quá trình tổng hợp, protein lạ đã bị cắt bỏ một phần. Đây chỉ là phỏng đoán vì nguyên nhân chính xác thì vẫn còn là một ẩn số. Gen sef14 cũng không đ−ợc biểu hiện trong E. coli mặc dù việc kiểm tra trình tự gen cho thấy gen sef14 đ−ợc đ−a vào pET22b(+) không bị lỗi. Nguyên nhân của rủi ro này có thể do trong E. coli cũng có lông và roi nh− Salmonella. Vì vậy, trong E. coli cũng có cơ chế cho việc điều khiển tạo protein cho lông và roi riêng. Việc có thêm gen tạo roi và lông có thể ảnh h−ởng tới sự phát triển bình th−ờng của chủng và vì vậy để bảo vệ sự phát triển bình th−ờng, chủng E. coli đã làm ức chế không tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp này nữa. Vì vậy, để tạo đ−ợc nguồn kháng nguyên cho thử nghiệm văc-xin, chúng tôi đã đ−a các gen này vào thử biểu hiện trong nấm men với mong muốn sẽ có đ−ợc nguồn kháng nguyên tốt hơn. 4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong nấm men P. pastoris Với mục đích thu đ−ợc nguồn kháng nguyên tái tổ hợp khác từ nấm men để nghiên cứu so sánh khả năng biểu hiện và bảo vệ gà chúng tôi đã biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên lông và roi trong nấm men P. pastoris. Dự định gen đ−a vào nấm men sẽ chứa cả trình tự mã hoá cho đuôi histidin dùng cho tinh sạch protein tái tổ hợp, chúng tôi đã thiết kế các đoạn mồi nhân các gen từ đầu 5’ của gen đến hết vùng histag trong pETfliC3, pETgm3, pETsef14. Gen sau khi đ−ợc nhân lên bằng pCR sẽ đ−ợc giới hạn bởi SnaBI, NotI và đ−ợc đ−a vào vectơ pCR2.1 để tách dòng. Sau đó, các đoạn gen đ−ợc đ−a vào pPIC9 tại điểm cắt SnaBI và NotI. Vectơ pPIC9 mang các gen sau khi đã đ−ợc kiểm tra sẽ đ−ợc cắt mở vòng tại vùng HIS4 để tích hợp vào hệ gen nấm men P. pastoris. 4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR Các gen đ−ợc nhân lên bằng PCR sử dụng các cặp mồi sau: fliC -pPICf: gTACgTACgTCTgTCTTCCggTCTg gm3-pPIC9f: TTACgTAgCACAAgTCATTAATACAAAC Sef14-pPIC9f: TTACgTAgCTggCTTTgTTggTAACAAA HistagPic9r: TGCggCCgCTCAgTggTggTggTggTggT 123 Qua điện di đồ trên hình 3.10 cho thấy các gen đ−ợc nhân lên đặc hiệu thể hiện là một băng sáng, rõ có kích th−ớc t−ơng ứng với kích th−ớc của các gen nh− mong muốn. Điều này tạo điều kiện cho việc tách dòng gen đ−ợc chính xác. 4.3.2.2. Đ−a gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 Sản phẩm pCR sau đó đ−ợc nối với vectơ pCR2.1 bằng enzyme DNA ligase và đ−ợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α để tách dòng. T−ơng tự nh− khi đ−a gen vào vectơ pCR2.1 ở phần trên, các khuẩn lạc có màu trắng là dòng tế bào có chứa plasmid đã mang gen ngoại lai đ−ợc nuôi cấy để tách plasmid kiểm tra. Nh− trên điện di đồ cho thấy các dòng plasmit đ−ợc tách ra từ khuẩn lạc màu trắng có kích th−ớc cao hơn dòng đối chứng là pCR2.1. Plasmid mang gen fliC3, gm3, sef14 đ−ợc đặt tên t−ơng ứng là pCRfliC-his, pCRgm-his, pCRsef-his. 4.3.2.3. Đ−a gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 Các gen từ vectơ pCRfliC-his, pCRgm-his, pCRsef-his đ−ợc cắt ra bằng SnaBI, NotI, tinh sạch và đ−a vào vectơ pPIC9 đã đ−ợc cắt bằng enzyme t−ơng ứng. Sản phẩm của phản ứng nối ghép gen đ−ợc biến nạp vào E. coli DH5α. Sản phẩm biến nạp đ−ợc trải trên môi tr−ờng có chứa Amp chọn lọc. Chúng tôi đã ngẫu nhiên chọn một số 1 2 3 4 5 Hình 3.10: Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% Đ−ờng chạy 1, 4: Thang ADN chuẩn (1Kb) Đ−ờng chạy 2, 3, 5: t−ơng ứng với sản phẩm PCR gen gm3, fliC3, sef14 124 khuẩn lạc để tách plasmit kiểm tra. Kết quả cho thấy, hầu hết các plasmit đã chứa đoạn gen chèn vào (Hình 3.11). Hình 3.11: Phân tích plasmit tái tổ hợp trên gel agarose 0,8% Đ−ờng chạy 1, 5, 14: pCR2.1 Đ−ờng chạy 6-9: pCRgm-his Đ−ờng chạy 2-4: pCRsef-his Đ−ờng chạy 210-13: pCRfliC-his 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 3.12: Phân tích plasmit pPIC9 mang gen fliC3, gm3, sef14 trên gel agarose 0,8%1-3: pICSef-his Đ−ờng chạy 1-3: pPICsef-his Đ−ờng chạy 4, 7, 10: pPIC9 Đ−ờng chạy 5, 6: pPICfliC-his Đ−ờng chạy 1-3: pPICsef-his 125 Để chắc chắn các dòng gen nằm trong pPIC9, chúng tôi đã tiến hành cắt kiểm tra gen bằng enzym hạn chế NcoI + XhoI. Kết quả cho thấy các đoạn gen đ−ợc tạo ra có kích th−ớc đúng nh− tính toán (Hình 3.12 và 3.13). Nh− vậy chúng tôi đã thiết kế thành công vectơ pPICsef14, pPICgm3, pPICfliC để biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris. 4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris Các plasmit pPICsef14, pPICgm3, pPICfliC đ−ợc cắt mở vòng tại vùng HIS4 để tạo điều kiện thuận lợi cho plasmid tìm và bắt cặp với vùng t−ơng đồng trên hệ gen nấm men và trao đổi chéo, tích hợp đ−a đoạn gen ngoại lai vào hệ gen. Đây là hệ biểu hiện rất mạnh đ−ợc nghiên cứu và ứng dụng rất rộng rãi để tạo nhiều protein tái tổ hợp đặc biệt là các protein của Eukaryot để sử dụng trong y, d−ợc học. Tuy nhiên, không phải tất cả các protein đều đ−ợc biểu hiện tốt trong hệ này mà một số protein đặc biệt là protein của vi khuẩn đ−ợc tạo ra yếu và không đ−ợc tiết ra ngoại bào. Vì vậy trong thí nghiệm của mình, chúng tôi chỉ thử biểu hiện với hy vọng có thể thu đ−ợc nguồn kháng nguyên tái tổ hợp trong nấm men để nghiên cứu. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hình 3.13: Phân tích sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8% Đ−ờng chạy 1: pICflic-his cắt bằng SnaB I/Not I Đ−ờng chạy 2, 3, 6: pPIC9 cắt bằng SnaBI/NotI Đ−ờng chạy 5:pPICgm cắt bằng SnaBI/NotI 126 Nấm men P. pastoris đ−ợc chọn lọc theo đột biến khuyết d−ỡng. Những dòng tế bào chứa đoạn gen tích hợp vào vùng HIS4 thì mới có khả năng sinh tr−ởng trên môi tr−ờng không có histidin còn những dòng không mang gen tích hợp thì không sinh tr−ởng đ−ợc. Bằng cách này chúng tôi đã chọn ra đ−ợc các dòng nấm men có chứa gen ngoại lai để biểu hiện. Các dòng tế bào chứa gen fliC3, gm3, sef14 đ−ợc nuôi cấy trong môi tr−ờng YPG sau đó đ−ợc cảm ứng bằng methanol để tạo protein tái tổ hợp. Sau khi cảm ứng 3 ngày, môi tr−ờng nuôi cấy đ−ợc điện di trên gel acrylamit để xem sự biểu hiện của protein ngoại lai. Không nh− mong muốn, protein ngoại lai đã không đ−ợc tổng hợp trong tế bào nấm men. Nguyên nhân tại sao các protein này không đ−ợc biểu hiện là ch−a rõ nh−ng có thể protein roi và lông đã gây ảnh h−ởng đến tế bào nấm men. Từ các kết quả thu đ−ợc ở trên, chúng tôi đã biểu hiện đ−ợc fliC3, gm3 mã hoá cho kháng nguyên roi H:i, H:g,m của vi khuẩn S. typhimurium và S. enteritidis trong tế bào E. coli BL21. Các kháng nguyên tái tổ hợp này đ−ợc sử dụng để thử đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo vệ gà chống lại Salmonella. 4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC Vì protein Gm3 đ−ợc tạo ra không còn nguyên vẹn và bị mất đoạn ở phần cuối gen vì vậy việc tinh sạch gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, trong quá trình xác định lại điều kiện để biểu hiện và tinh sạch protein Gm3 tốt nhất, chúng tôi tinh sạch FliC3 để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch. Riêng với Gm3, chúng tôi sẽ tiến hành ngay sau khi xác định đ−ợc các điều kiện cho FliC3. E. coliBL21 mang gen fliC3 đ−ợc nuôi cấy cảm ứng để tạo protein tái tổ hợp nh− đã đ−ợc trình bày ở phần ph−ơng pháp. Sau khi xử lý mẫu nh− đã nêu trên phần ph−ơng pháp, protein tổng số đ−ợc cho qua cột ái lực His-tag để tiến hành tinh sạch protein FliC. Điểm thuận lợi của kháng nguyên tái tổ hợp FliC so với kháng nguyên tự nhiên là đã mang thêm đ−ơc đuôi gồm 6 axit amin histidin. D−ới điều kiện pH thích hợp (pH =7), Ion Co2+ gắn trên hạt Sepharose tạo liên kết tĩnh điện với đuôi histidine. Khi đó, protein tái tổ hợp sẽ đ−ợc giữ lại trên cột. Sau khi đã rửa sạch những protein không mong muốn, protein tái tổ hợp đ−ợc thu lại nhờ dịch thu có pH = 5. D−ới điều kiện pH 127 66 1 2 FliC 97 14 45 30 21 kDa Hình 3.14: Phân tích protein tinh sạch trên gel polyacrylamide 12% Đ−ờng chạy 1: Thang protein chuẩn (Gibco) Đ−ờng chạy 2: Sản phẩm protein tinh sạch thấp, liên kết tĩnh điện giữa Ion Co và đuôi His-tag đ−ợc phá vỡ, vì vậy, protein tái tổ hợp theo dịch thu ra ngoài cột. Sản phẩm protein tái tổ hợp đ−ợc kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE 12% (hình 3.14). Kết quả điện di trên hình 9 cho thấy, băng protein rõ nét ở đ−ờng chạy 2 với kích th−ớc khoảng 51 kDa, đúng nh− tính toán. Sản phẩm protein tinh sạch đ−ợc sử dụng làm kháng nguyên để gây miễn dịch trên gà. 4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng nguyên toàn phần trên gà hậu bị Kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng nguyên toàn phần đ−ợc tiến hành tiêm vào lô gà (4 con đối chứng, 4 con thí nghiệm). Sau khi gây miễn dịch đ−ợc 14 ngày, tiến hành tiêm tiếp kháng nguyên lần 2 để cơ thể gà đáp ứng miễn dịch thứ cấp. Thu huyết thanh gà sau 21 ngày gây miễn dịch. Sau đó, huyết thanh gà đ−ợc sử dụng nh− kháng thể 1 trong kỹ thuật Western blot và ELISA. 4.3.3.3. Western blot và ELISA Tr−ớc tiên, để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp, kháng nguyên FliC đ−ợc chuyển qua màng PVDF (Polyvinylidene difluoride). Phủ 128 1 2 3 4 66 30 21 14 KDa Kháng nguyên tái tổ hợp ~51KDa Hình 3.15: Kết quả Western blot của kháng nguyên FliC với kháng thể từ các loại gà Đ−ờng chạy 1, 3: Thang protein chuẩn (Gibco) Đ−ờng chạy 2: FliC phủ với kháng thể từ gà đối chứng Đ−ờng chạy 4: FliC phủ với kháng thể từ gà thí nghiệm 45 tiếp kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp FliC (gọi là kháng thể đặc hiệu) để tạo sự kết cặp đặc hiệu với kháng nguyên. Kết quả Western blot đ−ợc thể hiện trên hình 10. Trong thí nghiệm này, gà đối chứng là gà đ−ợc nuôi cùng điều kiện với gà thí nghiệm nh−ng không đ−ợc tiêm kháng nguyên. Vì vậy, gà đối chứng không tạo kháng thể kháng lại FliC. Ng−ợc lại, gà thí nghiệm có khả năng tạo ra IgG rất mạnh do đ−ợc gây miễn dịch thứ cấ

Các file đính kèm theo tài liệu này:

6102.pdf