Đề tài Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp.

tư ban đầu thấp. Nhưng có nhược điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thường thấp, khó cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong các phòng thí nghiệm để chọn giống. * Phương pháp lên men chìm: Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml), Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l, Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m3. Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy mô của bình lên men. Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩm trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một số biện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều chỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên men . - ưu điểm của phương pháp lên men chìm là: + Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý của VSV, + Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao, + Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công. - Nhược điểm: Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn. Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính: - Lên men gián đoạn (lên men mẻ): Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trường lên men, trừ việc cung cấp ôxi (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điều chỉnh pH. Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềm tàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3). lnx Pha dừng Pha log Pha suy tàn Pha tiềm tàng t(h) Hình 3: Đường cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT lỏng.Với: x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men t: thời gian lên men. Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của VSV hoặc khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế. - Lên men có bổ sung: Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đống kín. Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất nitơ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổ sung vào hệ thống trong quá trình lên men. - Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men. Quá trình này xem như một hệ mở. Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian xác định. 1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7] Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l). Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ: penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài. Vì vậy phải chiết tách để lấy kháng sinh. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh. Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng: Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ, Phương pháp kết tủa, Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion. Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được một sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như: lọc, chiết, hấp thụ và sắc ký. 1.6.1. Chiết xuất * Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. * Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau. * Các phương pháp chiết lỏng – lỏng: - Chiết đơn (chiết 1 lần): Thường cho hiệu suất thấp nhưng đơn giản, tốn ít thời gian. - Chiết lặp (chiết nhiều lần): Hiệu suất chiết cao tuy nhiên tốn thời gian và công sức. - Chiết ngược dòng cho kết quả tốt hơn. 1.6.2. Tách sản phẩm * Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng từng chất. * Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng: - Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất (một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha). - Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp như là: chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký. * Sắc ký: Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của hỗn hợp. Sự tách sắc kí được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động. Các phương pháp sắc ký: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ tùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân cực. Chất phân cực ta chọn ngược lại. - Sắc ký trao đổi ion: Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit. Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng. - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10 mm) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. * Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trong chân không trước khi kết tinh. * Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thường giảm theo nhiệt độ. * Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ thoáng khí hoặc hút. * Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học. 1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17]. 1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit được STH từ Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao chép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành. Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC-25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống hệt của boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Lên men STH TMC-25 được tiến hành trên máy lắc ở 270C trong 5 ngày. Dịch lên men thu được lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol, dịch chiết được tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủa thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được TMC-25 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối sau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25. 1.7.2. Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ Streptomyces albidoflavus. Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin. Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trường chứa thịt- da có thể sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào. Dịch lên men chủng Streptomyces albidoflavus được ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó được lọc qua màng lọc có kích thước 0,45mm( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi được cô đặc 10 lần bằng máy cất đặc chủng. Khi so sánh độ nhạy để ức chế enzym, các đặc trưng cơ chất với Streptomyces griseus proteinaza B (SGPB) đã cho thấy đây là một enzym mới được đặt tên là SAKaza, khá tương đồng với SGPB. 1.7.3. Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư với nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCI. Đặc tính kháng ung thư của geldanamycin do ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung thư. Các nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng geldanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phương pháp điều trị đồng thời, ví dụ: xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong giai đoạn 2 giám sát lâm sàng. Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-Epoxy-8-demethyl geldanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Streptomyces hygroscopicus var.geldanus được lên men trên môi trường YPD, pH được điều chỉnh ở 6,5 bằng H2SO4 2,5N hoặc NaOH 2,5N, cấp khí bằng hỗn hợp khí chứa oxy hoà tan là 30%. Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửa giải là MeOH. Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh tổng hợp từ Streptomyces sp. 1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp. Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồm tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ Streptomyces sp. USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp tetrapetalone A. HLO (Human Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là những enzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh ra một loạt các chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin. Nghiên cứu được tiến hành trên Lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean Lipoxygenase) Streptomyces sp. USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải bằng MeOH và Aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan: ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4). Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giả là MeOH, tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2l môi trường Tetrapetalone A có IC50 là 190 (M) Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp 2.1.Nguyên liệu 2.1.1.Giống vi sinh vật *Chủng xạ khuẩn: Giống xạ khuẩn Streptomyces 40.16 phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định, do phòng thí nghiệm Vi sinh Kháng sinh bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. *Chủng vi sinh vật kiểm định: Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh và sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp: -Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 (E.coli) Proteus mirabilis BV 108 (P.mirabilis) Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri) Salmonella typhi DT220 (S.typhi) Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.aeruginosa) -Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC1128 (S.aureus) Bacillus pumilus subtilis ATCC 10241 (B.pumilus) Bacillus subtilis ATCC 6633 (B.subtilis) Bacillus creus ATCC 9946 (B.creus) Sarcina lutea ATCC 9341 (S.lutea) -Các loại nấm mốc: Mốc đen 1, Mốc xanh 1, Cadida, Asp.niger 2.1.2.Các môi trường nuôi cấy *Môi trường phân lập: Chủng xạ khuẩn 40.16 được phân lập trên môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml. *Môi trường nuôi cấy và khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh: +Môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml; pH=6,8-7,2. +Môi trường 2 (MT2): Tinh bột 2g; KCl 0,05g; NaNO3 0,2g; K2HPO4 0,1g; MgSO4,7H2O 0,01g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường3 (MT3): Lactoza 3g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; NH4NO3 0,2g; MgSO4,7H2O 0,01g; Na2SO4 0,05g; Cao ngô 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 4 (MT4): Glucoza 2g; Cao ngô 0,5g; NH4NO3 0,2g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; MgSO4,7H2O 0,15g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 5 (MT5): Bột đậu tương 1g; Cao thịt 2g; CaCO3 0,2g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 6 (MT6): Bột ngô 2g; CaCO3 0,2g; NaCl 0,1g; CoCl2,H2O 0,002g; K2HPO4 0,05g; Bột đậu tương 1,5g; Cao nấm men 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 7 (MT7): Sacaroza 3g; Bột đậu tương 1g; CaCO3 0,2g; CoCl2,H2O 0,002g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. *Môi trường lên men là các môi trường trên ở dạng dung dịch (không có thạch), ví dụ MT1dd: Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Nước vừa đủ 100ml *Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu tại bảng sau: Bảng các môi trường kiểm định Thành phần Môi trường NaCl (%) Cao thịt (%) Pepton (%) Glucoza (%) Thạch (%) pH Canh thang 0,5 0,3 0,5 - - Thạch thường 0,5 0,3 0,5 - 1,8 7,0-7,4 Sabouraud lỏng 1 2 - Sabouraud đặc 1 2 1,8 6,0-6,5 *Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP9): Dung dịch muối vi lượng của ISP: FeSO4,7H2O 0,01g; MnCl2,4 H2O 0,1g; ZnSO4, 7H2O 0,1g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH=7,0-7,2. -ISP1: Tryptone 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,2 trước khử trùng. -ISP2: Cao nấm men 40g; dịch chiết Malt 10,0g; glucoza 4,0g; nước cất 1000ml; pH=7,3; Thạch 20g. -ISP3: Bột yến mạch 20,0g; thạch 18,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. IPS4: Tinh bột 10,0g; K2HPO4 1,0g; MgSO4,7H2O 1,0g; NaCl 1,0g; (NH4)2SO4 2,0g; CaCO3 2,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. ISP5: L-asparagin 1,0g; glyxerin 10,0g; K2HPO4 1,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. ISP6: + Dung dịch A: Pepton 20g; sắt amoni xitrat 0,5g; Na2S2O3 0,08g; K2HPO4 1,0g; nước cất vừa đủ 1000ml. +ISP6: dung dịch A 36,0g, cao nấm men 1,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; thạch 15g; pH=7,0-7,2. ISP7: Glycerin 15,0g; L-Tyrosin 0,5g; L- asparagin 1,0g; K2HPO4 0,5g. MgSO4, 7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; FeSO4,7H2O 0,01g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. ISP9: + Các nguồn đường đã tiệt trùng (A): 1: Glucoza 4: Arabinoza 7: D-Fructoza 2: Sacaroza 5: Inositol 8: Rhamnoza 3: D-Xyloza 6: D-mannitol 9: Rafinoza + Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B) CuSO4,5H2O 0,69g; FeSO4,7 H2O 0,15g, nước cất 1000ml. + Môi trường thạch – muối khoáng (MTC): (NH4)2SO4 0,69g; K2HPO4 2,38g; MgSO4, 7H2O 1,0g; dung dịch B 1,00ml; thạch 15,0g; nước cất 1000ml; pH=6,8-7,0 + D*ISP9: MTC sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 600C thì cho một trong các nguồn đường A vào từng MTC riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong môi trường là 1%. 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất Dung môi Khối lượng riêng Nhiệt độ sôi Metanol 0,791 – 0,793 64,50C Etanol 0,789 – 0,791 78,30C Dimetylfocmamit 0,95 1530C Diclometan 1,32 400C Clorofoc 1,470 – 1,480 60 – 620C Butylaxetat 0,880 – 0,885 117 – 1180C n-Butanol 0,81 116 – 1180C Axeton 0,79 560C + Bản mỏng sắc ký : silicagel 60F254, Merck, + Dung môi chạy sắc ký: các dung môi trong bảng dung môi đã sử dụng. + Bình chạy sắc ký. *Máy móc thiết bị: +Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (= 254nm) nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V. + Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300LF, + Tủ ấm 300C,370C, + Kính hiển vi điện tử (Viện Vệ sinh Dịch tễ TW), + Cân kỹ thuật Scaltec 54, + Tủ cấy SanyoClean Bench, + Máy đo pH Mettler Toledo MP 220, + Máy ly tâm ROTOFIX 32, + Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030. 2.2. Các phương pháp thực nghiệm 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống Giống Streptomyces 40.16 cấy trên môi trường thạch nghiêng MT1, ủ cho phát triển ở 300C, trong 7-10 ngày. Giống Streptomyces 40.16 sau khi phát triển được cất giữ trong tủ lạnh 2-40C, định kỳ 3-6 tháng cấy truyền. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. Tiến hành: + Chuẩn bị môi trường cấy vi sinh vật kiểm định: Vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang ủ ở 370C trong 18-24h. Chuẩn bị nhũ dịch VSV kiểm định có nồng độ 107-108 tế bào /ml, đưa nhũ dịch này vào môi trường thạch thường vô trùng ở 450C-500C. Lắc đều đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa. + Đưa mẫu thử vào đĩa petri có chứa môi trường đã cấy VSV kiểm định. Có 3 cách đưa mẫu thử vào môi trường chứa VSV kiểm định: - Khối thạch: Đặt khối thạch D = 6,0mm có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định - Giếng thạch: Đục các giếng trên môi trường đã cấy VSV kiểm định (D = 6,0mm) sau đó nhỏ mẫu thử vào, mỗi miếng nhỏ 0,05ml. - Khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (D = 6,0mm) đã được tẩm ba lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở t0C Ê 500C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định. + Nuôi cấy: Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở t0C = 370C, trong 18-24h. + Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả đo được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, xử lý theo công thức: = s = : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (vô nấm), Di: Đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song (nếu không xác định khác đi, thì số thí nghiệm song song ở đây là 3). 2.2.3. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên + Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 40.16 cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước cất vô trùng. + Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-4 đến 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT1 trong đĩa petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa petri cho mỗi nồng độ pha loãng, cho các đĩa vào tủ ấm 300C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. + Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ sau 6 ngày, cấy zigzac lên bề mặt MT1 trong đĩa petri cho vào ủ ở 300C trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. 2.2.4. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV + Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 40.16 cho vào 10ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa petri vô trùng. Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1 trong đĩa petri được chiếu ánh sáng UV (=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian: 5 phút), sau đó lấy ra để chỗ tối 2-3h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5. + Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng Pepit vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 106 và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa, các đĩa petri sau khi cấy ủ ở nhiệt độ 300C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức: - Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên. - Làm song song mẫu chứng. - % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức: % biến đổi hoạt tính = Với : là đường kính trung bình vòng vô khuẩn thứ i, : là đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu chứng. Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. 2.2.5 Phương pháp lên men gián đoạn + Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 40.16 khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dd bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 30±0,10C với tốc độ quay 145-150 vòng/phút trong 120h. 2.2.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH thích hợp rồi chiết với từng dung môi chiết. + Phương pháp chiết một lần: Dịch lọc, dung môi được cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:5, lắc 1 phút, để phân lớp trong 1h. Sau đó tách riêng dung môi và dịch lọc. + Phương pháp chiết nhiều lần: Dịch lọc, dung môi được cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:15, lắc 1 phút, để phân lớp trong 1h. Sau đó tách riêng dung môi và dịch lọc. Làm tiếp 2 lần với tỷ lệ dung môi trên. Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lọc sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc và phương pháp giếng thạch. 2.2.7. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào Sau khi kết thúc quá trình lên men dịch lên men đem lọc được dịch lọc và sinh khối. - Xác định kháng sinh ngoại bào: Lấy dịch lọc đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, có hoạt tính thì đó là kháng sinh ngoại bào. Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng phương pháp chiết tách. - Xác định kháng sinh nội bào: Sinh khối được rửa 3 lần bằng nước cất, sấy khô ở 45-500C trong 24 giờ. Nghiền vỡ sinh khối trong cối sứ với dung môi thích hợp (đã xác định được trong phần chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ). Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. 2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men Dịch lọc được phân vào 5 ống nghiệm (mỗi ống 7ml) sau đó điều chỉnh pH trong các ống nghiệm lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản trong tủ lạnh. Sau 4 ngày, chỉnh lại pH trong các ống nghiệm về pH trung tính. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch. Tiếp tục xác định ảnh hưởng của pH sau 10 ngày tương tự như trên. 2.2.9. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng + Bản mỏng sắc ký có kích thước thích hợp, được hoạt hóa ở 1100C trong vòng 30 phút. Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ cho vào bình sắc ký (chiều dày lớp dung môi không quá 1cm). Chấm dịch chiết có chứa hoạt chất cần sắc ký lên bản mỏng (bằng micropipet) cách mép dưới 1,5cm. Sấy khô bản mỏng ở 40-500C, cho bản mỏng sắc ký đã chấm dịch chiết có chứa hoạt chất vào bình chạy sắc ký, khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng bỏ ra đánh dấu vết dung môi chạy (Ddm), xác định vết bằng phương pháp: - Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn được trộn với một chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi soi dưới đèn tử ngoại, nếu có vết thử sẽ cho màu thẫm dưới đèn tử ngoại. - Phương pháp hiện hình vi sinh vật: Đặt bản mỏng vào đĩa petri vô trùng đổ môi trường thạch thường vô trùng đã cấy VSV kiểm định, ủ ở 370C trong 24h. Vết kháng sinh được xác định bằng sự xuất hiện vòng vô khuẩn. + Tính Rf: Rf = Dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết ; Ddm: Khoảng cách dung môi chạy. - Phương pháp hiện hình bằng thuốc thử hóa học: Bản mỏng đã chạy sắc ký đem sấy khô rồi nhỏ Ninhydrin 1% lên mặt bản mỏng, sau 3 phút đưa sấy rồi quan sát bằng mắt thường, đo Rf. Nếu trùng với Rf của VSV thì kết luận kháng sinh phát hiện được bằng thuốc thử hóa học. 2.2.10. Phương pháp phân loại Strepto