Đề tài Nghiên cứu khả năng tăng trưởng của một số vi sinh vật trên bề mặt giá đỡ cellulose vi khuẩn (bc – bacterial cellulose)

ên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Tiếp theo Glc-6-P bị isomer hóa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzyme phosphoglucosemutase (PGM). Sau đó enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) xúc tác chuyển Glc-1-P thành UDPGlc, trong đó có sự hiện diện của UTP. Cuối cùng cellulose được tạo thành từ UDPGlc nhờ enzyme cellulose synthase và cyclic-di-GMP là yếu tố giúp hoạt hóa enzyme này. Giai đoạn kết tinh: các chuỗi bắt đầu được tổng hợp nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết hợp với nhau bằng liên kết Van der Waals tạo nên lớp các chuỗi glucan. Lớp này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó các lớp này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đó tạo thành các bó và thành các sợi. Kích thước, hình dạng, độ trong suốt, tỷ lệ các dạng của cellulose tùy thuộc vào vị trí xúc tác của phức chất enzyme. Hình 2.4: Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài [43] 1PFK Fru-bi-P FBP Con đường sinh glucose Chu trình Pentose phosphate Chu trình Krebs PGI FK Fru-6-P Fructose PTS Fru-1-P ATP ADP PGA G6PDH (NAD, NADP) Glucose Glc-6-P GK ADP ATP Cellulose CS UDP-Glc UGP Glc-1-P PGM Hình 2.5: Con đường sinh tổng hợp BC ở Acetobacter xylinum [44] UDPGlc pyrophosphorylase là enzyme quyết định sự tổng hợp cellulose vì vài kiểu hình đột biến không tổng hợp cellulose thiếu enzyme này (Valla et al.,1989). Hơn nữa, hoạt tính pyrophosphorylase khác nhau giữa những loài A. xylinum khác nhau và hoạt tính cao nhất thì được phát hiện trong những loài sản xuất cellulose hiệu quả nhất như là A. xylinum ssp. sucrofermentans BPR2001. Ngoài ra có vài loài thích sử dụng fructose như là nguồn cacbon và thể hiện hoạt tính phosphoglucoisomerase cao và có hệ enzyme trao đổi phosphor và phụ thuộc vào phosphoenolpyruvate. Hệ này xúc tác biến đổi fructose thành fructose-1-phosphate và thành fructose-1,6-biphosphate [7][6]. Nguyên liệu để nuôi Acetobacter xylinum nhằm thu BC Nước dừa già Nước dừa già là môi trường cổ điển để thu nhận BC từ A. xylinum. Đây là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích sinh trưởng: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản từ 3 ngày rồi đem sử dụng làm môi trường lên men. Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm, chất lượng dinh dưỡng của nước dừa cũng không đảm bảo. Môi trường nước dừa cần cung cấp thêm nguồn cacbon (sucrose, glucose hoặc nguồn cacbon khác), nguồn nitơ (SA, DAP). Rỉ đường Là phần nước đường không thể kết tinh hết cũng như còn lẫn các tạp chất sau khi ly tâm nhiều lần nước mía để tách lấy đường kết tinh. Rỉ đường là một hỗn hợp khá phức tạp. Ngoài lượng đường khá cao, rỉ đường còn chứa các hợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ khác. Thành phần của rỉ đường có chứa 15 – 20% nước, 80 – 85% chất khô hòa tan và nhiều loại vitamin như: thiamine, riboflavin, acid nicotinic, acid folic, biotin Chất khô hòa tan trong rỉ đường gồm: Đường tổng số chiếm hơn 50%, trong đó saccharose chiếm 30 – 35%, đường khử chiếm 15 – 20% (gồm glucose, fructose). Chất khử không lên men thường chiếm 1,7%. Thành phần chất khô còn lại chiếm dưới 50%, trong đó có 30 – 32% chất hữu cơ và chất vô cơ 18 – 20%. Khi được bảo quản lâu ngày, chất lượng rỉ đường thường giảm. Vì vậy cần có chế độ bảo quản hợp ý để quá trình lên men đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, còn sử dụng nước mía và các nguyên liệu khác từ công nghiệp thực phẩm để lên men thu BC [7]. Các phương pháp sản xuất BC Nhân giống Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được giữa trong ống thạch nghiêng trong điều kiện lạnh sâu. Khi cần nuôi cấy thì tiến hành hoạt hóa chúng. Khi lấy giống ra sử dụng cần cấy chuyền qua môi trường rắn. Cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã hấp khử trùng, hoạt hóa ở nhiệt độ 28°C trong 18 – 24 giờ được giống cấp 1. Giống cấp 1 có thể tiếp tục được nhân giống cấp 2, 3 Tỉ lệ giống so với môi trường từ 1 – 10%. Lên men Lên men tĩnh: môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30°C. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulos nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 – 10 ngày có thể thu BC. Hình 2.6: Miếng BC được hình thành từ lên men tĩnh [24] Lên men động: vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 28 - 30°C, 180 – 200 vòng/phút. BC được tạo từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men. Hình 2.7: Hạt BC được hình thành từ nuôi cấy lắc [24] Ứng dụng của BC Với những ưu điểm nổi bật, BC ngày càng được nghiên cứu nhiều và có nhiều ứng dụng rộng rãi. Bảng 2.2: Một số sản phẩm từ màng BC của Acetobacter xylinum [6] [21][15] Lĩnh vực ứng dụng Sản phẩm Thực phẩm Tráng miệng (thạch dừa) Ăn kiêng (kem, salad) Thịt nhân tạo Vỏ bao xúc xích Nước uống siro không có cholesterol Trà Kobucha hay manchurian Y dược Lớp màng trị bỏng Tác nhân vận chuyển thuốc Da nhân tạo Chất làm co mạch Mỹ phẩm Móng nhân tạo Đánh móng dày và mỏng hơn Môi trường Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn Hấp thu chất độc Quần áo, giày dép tự phân hủy Dầu mỏ Thu hồi dầu Trang phục Sản xuất sợi nhân tạo Y phục quân đội Thể thao Lều lắp ráp Sản phẩm rừng Gỗ nhân tạo Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ Thùng hàng có độ bền cao Lĩnh vực khác Làm màng lọc Tả lót có thể tái chế Màng rung động âm thanh Môi trường nuôi cấy mô thực vật Hình 2.8: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC[7]. Hình 2.9: Ứng dụng BC làm giá thể nuôi cấy cụm chồi thuốc lá[7]. Hình 2.10: Ứng dụng BC trong vật liệu mới làm tấm xốp [7]. Ứng dụng BC làm giá đỡ nuôi cấy tế bào vi sinh vật BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của giá đỡ trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào vi sinh vật. Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học: hình dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra hình dạng mong muốn. Đây là ưu điểm của BC so với các giá đỡ khác. BC có tính cơ lý bền và ổn định: độ chịu lực của BC khá cao. Tính chất cơ lý bền và ổn định của BC giúp cho BC chịu được sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực. BC không tan trong môi trường phản ứng. Giá đỡ BC có độ trương nở tốt: độ trương nở cao giúp cho sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm. Môi trường trong và ngoài giá đỡ không có sự khác biệt giúp cho tế bào vi sinh vật giữ nguyên được các đặc điểm sinh hóa của tế bào tự do. BC đã qua xử lý không gây tác động kìm hãm đến hoạt động sống của vi sinh vật vì sau giai đoạn xủ lý, BC chỉ là giá đỡ trơ về mặt hóa học và có độ trương nở tốt. Giá thành BC: so với các vật liệu khác thì BC thấp hơn rất nhiều. BC có khả năng tái sử dụng. BC an toàn cho môi trường sống. Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men là: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, giá thành rẻ. Tuy nhiên điểm hạn chế của nó là không thể nuôi cấy những vi sinh vật tạo ra cellulase vì bản chất của BC là cellulose [12]. Giới thiệu về Saccharomyces cerevisiae Đặc điểm của S. cerevisiae S. cerevisiae là tế bào nhân chuẩn đơn bào, được dùng làm đối tượng mô hình cho nghiên cứu sinh vật nhân chuẩn. Ứng dụng sớm trong lên men rượu và làm bánh mì. Hiện nay ứng dụng trong công nghiệp lên men rượu với quy mô lớn. Đối tượng sinh vật nhân chuẩn đơn bào dùng để sản xuất protein tái tổ hợp. Cấu tạo và sinh sản của S. cerevisiae Phân loại: Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Saccharomyces Loài: Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào, tế bào giống như ở động và thực vật [9]. S. cerevisiae thường có dạng hình tròn hay bầu dục. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Kích thước thay đổi trong khoảng (3 – 10)μm x (4,5 – 15)μm. Hình 2.11: Tế bào nấm men S. cerevisiae [40][42] Hình 2.12: Khuẩn lạc S. cerevisiae trên môi trường Hansen Nhân của tế bào S. cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. Ngoài nhiễm sắc thể, trong nhân tế bào S. serevisiae còn có thể có plasmid có cấu tạo là 1 phân tử DNA vòng chứa 6300 đôi base và có kích thước 2μm, có khả năng sao chép độc lập, mang thông tin di truyền, có vai trò quan trọng trong thao tác chuyển gen của kĩ thuật di truyền[3]. Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần chủ yếu của tế bào nấm men là nước (chiếm khoảng 75% khối lượng chung). Thành phần sinh khối khô của nấm men : Chất vô cơ 5 – 10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4,8 – 12 Protein (N x 6,25) 30 – 75 Lipid 2 – 5 Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% là chất tro. Chất hữu cơ gồm: protein 13 – 14%, glycogen 6 – 8%, cellulose 1,8 – 2%, chất béo 0,5 – 2%. Protein: nấm men có hàm lượng protein trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô) và khoảng 45% chất khô protein hoàn chỉnh. Các dẫn xuất của acid nucleic như base, purin, pyrimidin, các acid amin tự do đều được coi là nguyên liệu. Glycogen: là chất dự trữ nguồn cacbon. Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hóa của nấm men và giải phóng ra nước, CO2. Chất béo: gồm acid oleic, linoelic, palmitic. Trong chất béo có 30 – 40% phosphatide. Tro: gồm các oxide sau: P2O5 khoảng 25 – 60%, CaO 1 – 8%, MgO 4 – 6%, Na2O 0,5 – 2%, SO2 0,5 – 6%, SiO2 1 – 2%, Fe2O3 0,05 – 0,7%. Nấm men S. cerevisiae có nhiều phương thức sinh sản khác nhau: Sinh sản vô tính: Tế bào nảy chồi đa cực, đôi khi có khuẩn ty giả. Sinh sản hữu tính: Bào tử túi. Túi khá bền và hình thành trực tiếp từ một tế bào lưỡng bội. Mỗi túi có chứa 1-4 (ít khi nhiều hơn). Bào tử túi hình ô van, tròn nhẵn. Chu kì sống của nấm men S. cerevisiae: có 2 giai đoạn đơn bội và lưỡng bội. Đầu tiên tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) sinh sôi nảy nở theo kiểu nảy chồi. Sau đó hai tế bào đơn bội tiếp hợp với nhau, có sự trao đổi của tế bào chất và nhân, tạo ra tế bào lưỡng bội (2n). Tế bào lưỡng bội lại nảy chồi thành nhiều tế bào lưỡng bội khác, cuối cùng hình thành hợp tử. Sau quá trình giảm phân nhân của hợp tử thành bốn nhân đơn bội. Mỗi nhân đơn bội được bao bọc tế bào chất, hình thành màng, tạo thành bốn bào tử nằm trong một túi gọi là bào tử túi. Khi túi vỡ, bào tử ra ngoài phát triển thành tế bào dinh dưỡng và lại phân chia theo lối này rồi tiếp tục chu trình sống. Trong vòng đời của nấm men có sự luân phiên sinh sản vô tính và hữu tính với các giai đoạn đơn bội và lưỡng bội khác nhau[9]. Sự hình thành nang bào tử trong điều kiện thiếu CO2 ở Saccharomyces cerevisiae được kích thích khi nồng độ oxy 12% và nồng độ oxy 41,1% thì giảm cũng không đáng kể. Tuy nhiên khi oxy đạt nồng độ 68,8% và 100% thì khả năng hình thành nang bào tử sẽ giảm rất rõ. CO2 kiềm hãm sự hình thành nang bào tử và rất ít nang bào tử được hình thành ở nồng độ CO2 25% hoặc cao hơn. Hơi nước từ dung dịch ethanol 5% ức chế đáng kể sự hình thành bào tử (Adams và Miller - 1954) [26]. S. cerevisiae phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 30°C, thời gian nhân đôi khoảng 1,5 – 2 giờ. Nấm men Saccharomyces cerevisiae phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước, trong không khí, trong trái cây, nước ngọt, nước nho ép trước khi lên men thành rượu, rượu táo, rượu vang, rượu sake, bia, quả ôliu, salads, bột mì, bánh mì, kefir, yogurt, phô mai, kem [23]. Nhu cầu dinh dưỡng Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên các nguồn cacbon khác nhau, glucose được sử dụng phổ biến nhất. Ngoài ra fructose, maltose, saccharose, galactose và các dextrin đơn giản cũng được sử dụng. Nhưng S. cerevisiae không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulose vì vậy nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicelulose. Còn lactose, pentose cũng hoàn toàn không sử dụng được. Với raffinose chỉ sử dụng được một phần ba. S. cerevisiae cũng có thể tồn tại trên nguồn cacbon không lên men như glycerol, ethanol và acetate (3% glycerol, 3% ethanol, 3% acetate). Tùy từng ứng dụng, có thể phối trộn nhiều cacbon vào môi trường nuôi cấy. Nấm men S. cerevisiae không đồng hóa được nitrate. Nguồn nitơ vô cơ được sử dụng tốt là các muối ammonium của acid vô cơ cũng như hữu cơ, đó là ammonium sulphate, phosphate, muối acetate, lactate, succinate. Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptide, các nucleotide Trong thực tế thường dùng cao nấm men, cao ngô, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc) làm nguồn nitơ hữu cơ. Đối với các nguyên tố vô cơ thì phospho được quan tâm trước hết. S. cerevisiae sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphate, thường dùng muối K2HPO4 và KH2PO4 làm nguồn P và K. Kế đến là nguyên tố lưu huỳnh vì là thành phần của một vài acid amin trong phân tử protein. Trong nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn N và S. Vài ion kim loại như kali, magie, canxi, sắt, kẽm cũng cần có trong môi trường nuôi cấy S. cerevisiae. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men S. cerevisiae là 6 vitamin nhóm B: B8, biotin, B3, B1, B6 và PP. Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám (cám gạo, cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp biotin). Saccharomyces cerevisiae khác với các loài nấm men khác nhờ vào đặc tính sinh trưởng và các đặc điểm sinh lý: phần lớn loài này có khả năng lên men đường. Đặc tính cơ bản nhất của nấm men được phân loại dựa vào khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau[17][35]. Ứng dụng của Saccharomyces cerevisiae Nấm men có nhiều ứng dụng trong sản xuất công nghiệp như công nghiệp sản xuất cồn, sinh khối (thực phẩm, men bánh mì, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi) và các sản phẩm trao đổi chất khác. Trong những năm gần đây, nấm men còn được sử dụng để sản xuất enzyme, vitamin, polysaccharide, carotenoid, ethanol, CO2, glycerin, acid hữu cơ và các hợp chất được tổng hợp bằng cách tái tổ hợp DNA vào nấm men. Trong các sản phẩm nói trên có nhiều sản phẩm được sản xuất ở quy mô thương mại. S. cerevisiae và các chủng nấm men khác từ hạt ngũ cốc được dùng để sản xuất rượu chưng cất. Ngày nay nấm men dùng trong sản xuất ethanol được cải tiến bằng cách biến đổi gen và hợp nhất với tế bào trần để tăng năng suất cho quá trình sản xuất. Trước đây, việc sản xuất ethanol chủ yếu bằng phương pháp tổng hợp hóa học từ dầu. Nhưng hiện nay, phần lớn lượng ethanol được sản xuất bằng nấm men (cao hơn 87% so với phương pháp hóa học). Enzyme invertase của nấm men S. cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo và mứt. S. cerevisiae được dùng làm tế bào chủ để sản xuất DNA tái tổ hợp. Một số sản phẩm được tiết ra bởi nấm men S. cerevisiae chứa gen tái tổ hợp: α-amylase của lúa mì, nhân tố phát triển biểu bì ở người, nhân tố giải phóng hormone tăng trưởng ở người, albumin huyết thanh người, nhân tố tăng trưởng insulin của người, prochymosin, insulin và somatostation. Interferon-γ của người được tạo ra 5 – 10% tổng lượng protein của tế bào hemoglobin người, kế tiếp là hemendogenous chiếm 2 – 3% tổng số protein. Superoxide dismutase của người được tạo ra trong pha ổn định của tế bào[12][1]. Giới thiệu về Rhodotorula Đặc điểm của tế bào Rhodotorula Phân loại Giới: Nấm Ngành: Basidiomycota Lớp: Urediniomycetes Bộ: Sporidiales Họ: Sporidiobolaceae Giống: Rhodotorula Theo Kurtzman và Fell (2000) giống men Rhodotorula gồm 45 loài, theo mô tả các tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa trước đó có tên gọi là Rh. rubra, loài này sinh enzyme urease, không đồng hóa nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc ở nhiệt độ 40°C và loài Rh. rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. rubra ở một số tài liệu hiện nay không còn nữa và đã được thay bằng tên mới là Rh. mucilaginosa. Cho đến ngày nay, người ta đã phân lập được 34 loài, trong đó có 2 loài Rhodotorula glutinis và Rhodotorula gracilis đang được quan tâm nhiều nhất. Cấu tạo và sinh sản của Rhodotorula Tế bào nấm men Rhodotorula ở dạng đơn bào, hình tròn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc gậy. Kích thước tế bào (2,5 – 5)x(5 – 10)μm. Khuẩn lạc Rhodotorula có bề mặt trơn nhẵn, bong, đôi khi gồ ghề, mịn. Mép khuẩn lạc không có răng cưa. Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng có khi màu vàng hoặc đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tùy môi trường, có thể đạt từ 1 – 10mm. Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử đốt. Hình 2.13: Khuẩn lạc Rhodotorula trên môi trường Hansen Rhodotorula thuộc nhóm nấm men không sinh bào tử, thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ dao động từ 20 - 40°C. Giống như các loài nấm men khác, tế bào Rhodotorula cũng được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản như: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân và các bào quan khác. Vài acid amin tham gia vào thành phần cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula: arginine, histidine, isoleucine, leucine, tryptophan, phenylalanine, methionine Nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nảy chồi đa cực, trừ một số loài như: Rh. pilimanae, Rh. pilatii, Rh .javaniti, Rh. ingniosa, Rh. difuens và Rh.bogoriensis là nảy chồi có cực. Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu phân đôi. Tốc độ sinh sản nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi là từ 2 - 6 giờ. Đầu tiên hạch dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Một phần hạch chuyển động vào chồi, một phần ở tế bào mẹ. Đồng thời một phần tế bào chất cũng sang chồi con. Chồi con lớn dần, khi chồi con bằng chồi mẹ nó được tách ra sống riêng lẻ. Một tế bào mẹ tạo một lần được một hoặc nhiều chồi con. Các chồi con sắp xếp trên tế bào không nhất thiết cùng một vị trí. Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula trong khoảng 24 - 48 giờ nếu môi trường cung cấp đủ các chất cần thiết. Nấm men Rhodotorula phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong trái cây, nước nho ép trước khi lên men thành rượu, rượu vang, bia, bột mì, thịt bò, thịt gia cầm, cá, hải sản, động vật có vỏ, xúc xích, thịt giăm bông [23]. Đặc điểm sinh hóa Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hóa sau: Không lên men được các loại đường: glucose, galactose, sucrose, maltose, lactose, raffinose nhưng chúng lại sử dụng được các loại đường này (trừ lactose) để cung cấp nguồn cacbon cho việc xây dựng tế bào. Sử dụng được ethanol như là nguồn cacbon và không đồng hóa KNO3. Tạo enzyme urease. Đồng hóa DBB (Diazonium Blue B). Có khả năng tổng hợp sắc tố carotenoid. Không đồng hóa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula khác với giống nấm men Candida, Cryptococcus. Không tạo thành hợp chất loại tinh bột[5]. Sắc tố của nấm men Rhodotorula Nhiều sắc tố đã được phân lập từ nấm men, đặc biệt là từ Rhodotorula và có nhiều phương pháp hiện đại đã chứng minh sự hiện diện của sắc tố với lượng tương đối cao trong vài loài nấm men. Nakayama, Mackinney và Phaff (1954) đã tìm thấy “nấm men vàng” của Rhodotorula và Cryptococcus có chứa β-carotene như là sắc tố chính. Sắc tố chủ yếu có trong Rhodotorula là torularhodin, torulene, β-carotene và γ-carotene. Hình 2.14: Các sắc tố của nấm men Rhodotorula [20] Carotene là một trong hai nhóm của carotenoid. Nhóm 1- carotene: những hợp chất hydrocacbon carotenoid, nhóm 2- xanthophyll: những dẫn xuất của carotene với nhóm chức chứa oxy. β-carotene là một trong những chất thuộc nhóm carotene, là màu tím đỏ trong bảng màu tự nhiên và được biết như là tiền vitamin A. β-carotene xuất hiện trong tự nhiên trong cà rốt, khoai lang, bơ, lòng đỏ trứng gà, dầu cá β-carotene được sản xuất bởi Rh. flava, Rh. gracilis, Rh. pallid đã được nghiên cứu bởi Deufel và Clark (1958). Hóa tính và hóa sinh chung của các caroteniod được nhiều tác giả đề cập (Goodwin, 1965; Davies, 1965; Porter và Anderson, 1967). Carotenoid của vi khuẩn (Jensen, 1965), của nấm (Goodwin, 1952; Valadon, 1966). Nhiệt độ nóng chảy cao khoảng 130-220°C. Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi. Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong dung môi như cloroform, dichlorothane. Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không phân cực. Dễ bị oxy hóa bởi không khí và nhiệt độ, ion kim loại. Sản lượng β-carotene đạt từ 5,2 – 120,8 μg/g tế bào khô khi nuôi cấy trên môi trường bán tổng hợp. Những nhà nghiên cứu đã tìm thấy sắc tố carotenoid của loại sắc tố đỏ và vàng được tách chiết trực tiếp từ tế bào Rhodotorula với acetone lạnh bằng môi trường tổng hợp Wickerham trong 72 giờ trên máy lắc. Sắc tố được chuyển từ acetone sang ether dầu hỏa và được mô tả bởi phương pháp sắc kí và quang phổ. Sắc tố sẽ thay đổi hoặc bị phá hủy bởi việc xử lý sơ bộ tế bào nấm men bằng HCl và nhiệt[14][26][33]. Ứng dụng của Rhodotorula trong sản xuất chất béo Mặc dù chất béo được sản xuất bởi nhiều loài vi sinh vật trong những điều kiện nuôi cấy đặc biệt . Tuy nhiên trong tự nhiên có một số loài nấm men, điển hình là Rh. glutinis có khả năng sản xuất một số lượng lớn chất béo và đã được nghiên cứu một cách rộng rãi. Rhodotorula glutinis là nấm men được quan tâm một cách đặc biệt bởi vì nó có chứa lượng chất béo cao (63% /100g nấm men khô), hệ số béo cao (hệ số béo đuợc tính là g béo/100g đường ), có khả năng phát triển dễ dàng trong môi trường nuôi cấy chìm, hình thành chất béo một cách nhanh chóng và không bị ràng buộc bởi sự hồi phục từ môi trường nhân giống. Mặc dù Rh. glutinis có thể sử dụng nhiều loại đường như là nguồn cacbon nhưng đường tốt nhất cho quá trình sản xuất chất béo là glucose, fructose, mannose, sucrose và mật rỉ đường (Pan et al., 1949). Xylose là đường kém thích hợp nhất nhưng nó được nấm men này sử dụng một cách hoàn hảo nhất sau khi đã thích nghi (Nielsen và Nilsson, 1950). Nồng độ đường tốt nhất cho việc tạo ra chất béo là 4 – 8%. Khi tăng nồng độ lên khoảng 20% trong môi trường nuôi cấy cũng không làm ảnh hưởng đến lượng chất béo được tạo ra, nhưng nếu tăng cao hơn nữa thì sẽ làm giảm lượng chất béo (Steinberg và Ordal, 1954). Pan và cộng sự (1949) đã nhận thấy rằng việc cung cấp thiếu (NH4)2SO4 và KH2PO4 trong môi trường mật rỉ đường sẽ ảnh hưởng đến khả năng sử dụng đường của Rh. glutinis. Khi 2 thành phần này được cung cấp với lượng 0,5g/l thì khả năng sử dụng đường của nấm men và hệ số chất béo là tốt nhất. Sự thiếu hụt lưu huỳnh hay sắt trong môi trường cũng làm giảm khả năng hình thành chất béo (Nielsen và Rojowski, 1950). Với pH 3 – 8,5 thì tốc độ tạo thành chất béo tăng từ 2,1 – 3,1g chất béo/ 100g nấm men không béo/ 1 giờ (Steinberg và Ordal, 1954). pH của môi trường mật rỉ đường để sản xuất chất béo khoảng 4,6 – 4,8 và nhiệt độ tối ưu khoảng 28°C[26]. Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula Lu, Chun (1993) nghiên cứu các thông số phát triển của nấm men Rhodotorula rubra và sự tạo thành carotenoid của chúng. C.T Shih và Y.D. Hang (1996) nghiên cứu khả năng sinh ra sắc tố carotenoid của Rhodotoruala rubra từ môi trường nước muối dưa cải bắp của Đức. Pietro Buzzini, Alessandro Martini (1999) nghiên cứu sự tạo thành caroteneoid của nấm men Rhodotorula glutisis được nuôi cấy trên môi trường nguyên liệu thô có nguồn gốc từ sản xuất nông nghiệp (nước nho, táo chưa lên men, mật đường glucose, ). Kết quả thu được lượng carotenoid cao nhất khi nuôi cấy Rhodotorula glutisis trên môi trường nước nho đặc chưa lên men: 915,4 µg β-carotene/g nấm men khô, trong đó có 9,2% β-carotene, 9,3% torulene và 78,8% torularhodin[5]. Giới thiệu về vi khuẩn Azotobacter Đặc điểm của vi khuẩn Azotobacter Phân loại Phân loại Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Azotobacter Năm 1901 nhà khoa học người Hà Lan M.W.Beijerinck lần đầu tiên phân lập được Azotobacter. Ông đặt tên cho loài vi khuẩn này là Azotobacter chroococcum. Chúng giữ vai trò làm cho đất thêm phì nhiêu bằng việc cố định nitơ từ khí quyển, thường gặp chúng trong tự nhiên và có nhiều loài khác nhau. Vi khuẩn Azotobacter là vi khuẩn gram âm, tế bào có dạng hình cầu đến hình que. Tế bào có kích thước (2-10) x (1-2) µm. Tế bào sinh sôi nảy nở theo lối