Đề tài Nghiên cứu nấm Fusarium spp. gây hại trên cây hồ tiêu ở Quảng Trị

n hồ tiêu và biện pháp phòng trừ. Viện Bảo vệ thực vật. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam] Do bộ rễ bị tổn hại, quá trình thoát nước, vận chuyển muối khoáng bị gián đoạn nên cây mới bị bệnh có biểu hiện sinh trưởng kém, lá bị vàng và rụng dần dần, cây còn nhỏ có thể bị chết khô hoàn toàn. Trường hợp cây tiêu bị bệnh nhẹ thì dây tiêu không chết nhưng sinh trưởng không bình thường và cằn cỗi. 2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh. Có nhiều tác nhân tham gia gây bệnh chết chậm như tuyến trùng vùng rễ, rệp sáp, mối, nấm Fusarium spp, Phytophthora, Pythium….Một số nghiên cứu cho rằng, tuyến trùng ký sinh gây thương tổn cho bộ rễ, sau đó nấm Fusarium và các loại nấm khác ký sinh theo là nguyên nhân gây hiện tượng chết chậm. Ở những vùng có mật độ rệp sáp hại rễ cao và mối gây hại sẽ làm cho triệu chứng của bệnh thêm rõ ràng và phát triển nhanh hơn.[Báo cáo dịch hại chính trên hồ tiêu và biện pháp phòng trừ. Viện Bảo vệ thực vật. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam]. 2.2.3. Biện pháp phòng trừ Các bệnh héo Fusarium nói chung và chết chậm hồ tiêu nói riêng rất khó phòng trừ do bào tử hậu tồn tại qua thời gian dài trong đất, do đó phải: Luân canh các cây trồng có khả năng kháng bệnh ít nhất 2 năm trước khi trồng lại các cây trồng mẫn cảm có thể giúp làm giảm nguồn bệnh. Bón nhiều phân hữu cơ và bón đủ phân NPK và bón thêm vôi cho các gốc tiêu. Đồng thời không để gốc tiêu đọng nước trong mùa mưa. Tiêu hủy các cây bị bệnh và rắc vôi vào gốc diệt mầm bệnh.Tuy nhiên, loại nấm này vẫn có thể tồn tại bằng cách xâm nhiễm vào vỏ rễ các cây trồng không phải là kí chủ và không biểu hiện triệu chứng. Việc này nêu ra sự cần thiết nghiên cứu đặc tính sinh học của loại nấm này ở từng quốc gia, từng vùng, từng địa phương nhằm xác định vai trò của những cây trồng không phải là kí chủ và thời gian tồn tại của bào tử hậu trong đất.Có những giống cây trồng có khả năng kháng bệnh héo Fusarium. Tuy nhiên một giống kháng bệnh không có nghĩa là có khả năng kháng với tất cả các chủng của một dạng loài nào đó.Một số bệnh héo Fusarium đã được phòng trừ thành công bằng phương pháp sử dụng gốc ghép có khả năng kháng bệnh. Ví dụ, phương pháp này đã được áp dụng để phòng trừ bệnh héo Fusarium trên dưa hấu. Hiện nay chưa có thuốc trừ nấm hữu hiệu để phòng trừ. 2.3. Giới thiệu chung về nấm Fusarium spp. Nấm Fusarium spp. Thuộc: Ngành Ascomycota Lớp Deuteromycetes Họ Tuberaulariaceae Bộ Moniliales Chi Fusarium Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như héo do tắc bó mạch, thối rễ, thân và bắp, thối cổ rễ cây con và thối củ. Một số loài gây bệnh cũng sản sinh độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ cốc. Nhiều loài Fusarium khác là hoại sinh phổ biến trong đất. Các loài hoại sinh thường có mặt trên rễ và thân cây bệnh. Những loài hoại sinh này mọc nhanh trên môi trường và được phân lập dễ dàng từ rễ và thân bị bệnh, khiến cho việc phân lập các tác nhân gây bệnh chính trở nên khó khăn. Vì vậy việc lây bệnh nhân tạo các mẫu Fusarium phân lập từ rễ bệnh là rất cần thiết. Đây là phần quan trọng trong quá trình chẩn đoán, và là một trong những lí do tại sao chẩn đoán một bệnh rễ lại khó khăn. Ví dụ, Fusarium oxysporum bao gồm nhiều dạng loài gây các bệnh héo do tắc bó mạch và một số bệnh thối rễ. Tuy nhiên, F. oxysprorum cũng bao gồm nhiều dạng hoại sinh có mặt phổ biến trên rễ cây bệnh sau khi tác nhân gây bệnh đã làm thối mô rễ. Một số loài hoại sinh này cũng có thể sống nội sinh trong các tế bào lớp ngoài của rễ mà không làm tổn thương rễ. Theo các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học, các bệnh héo Fuasarium là vấn đề quan trọng ở Việt Nam. Những bệnh héo này do các dạng loài của F.oxysporum gây ra. Một vài dạng F.oxysporum cũng có thể gây thối dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc dụng cụ gặt hái làm tổn thương. Thối bắp ngô, chủ yếu do F.graminearum và F. verticilliodes gây ra, ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt. Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu như đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trưởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực gố than cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường làm stress và do các bệnh khác. Fusraium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc Việt Nam ( L. Burgess, thong tin chưa xuất bản) và từ cà phê ơ tỉnh Đắc Lắc (TS. Trần Kim Loang). Nghiên cứu sinh địa lý học chỉ ra rằng, các loài Fusarium khác nhau sẽ phân bố ở các vùng địa lý khác nhau. Sự thay đổi trong cấu trúc và đa dạng của nấm có thể do kết hợp với các vùng khí hậu đặc biệt trên thế giới [19]. Phổ kí chủ: Mỗi dạng loài thường chỉ gây héo do tắc bó mạch trên một loài kí chủ nhất định. Chẳng hạn như F. oxysporum f. sp. Niveum chỉ gây héo trên dưa hấu. Thời tiết : Các bệnh héo Fusarium thường nghiêm trọng hơn trong điều kiện thời tiết ấm và ẩm ướt. Bảo tồn : Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium tồn tại dưới dạng bào tử hậu trong đất qua thời gian dài. Bào tử hậu có hình tròn, là các bào tử một tế bào với vách tế bào dày và có sức chống chịu cao, được hình thành trong mô bệnh. Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium cũng có thể có mặt ở vỏ rễ một số cây không phải là kí chủ, kể cả cỏ dại và cây trồng. Bào tử hậu hình thành trong vỏ rễ khi cây chết. Như vậy những cây trồng không phải là kí chủ phải được kiểm tra trước khi được khuyến cáo là cây trồng luân canh để phòng trừ héo Fusarium. Xâm nhiễm: Sợi nấm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem. Nấm bệnh sau đó sẽ phát triển trong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu. Những hợp chất này gây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dấu hiệu dễ nhận thấy của bệnh héo khi cắt ngang thân. Hiện tượng tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cho cây bệnh bị héo rồi chết. Bệnh héo Fusarium thường liên hệ với tuyến trùng nốt sưng. Nấm Fusarium xâm nhiễm vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây ra. 2.3.1. Đặc điểm của nấm Fusarium spp. Fusarium.spp là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ. Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium.spp cũng sản xuất một số chất độc tiết vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium.spp tấn công Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa. Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan. Nấm sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất, cũng gặp trên các vật liệu cellulose.[Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương. 1982. Vi nấm. NXB Khoa học và kỹ thuật. Hà Nội] Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là 25 – 30 0C. Hình thái và màu sắc tản mấm trên môi trường nuôi cấy. Nấm Fusarium phát triển nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ 250C và hình thành tản nấm có hình thể tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lan rộng trên môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nấm có thể có màu trắng, kem, vàng, vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím. Mặt dưới nó có thể không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tía sẫm, hay màu nâu. [18]. Nghiên cứu về phân loại Fusarium bắt đầu từ năm 1809 nhưng việc xác định số loài Fusarium luôn thay đổi trên một phạm vi rộng lớn: từ 9 loài theo Snyder và Hansen (1945) đến 44 loài và 7 giống theo Booth (1971) [8], 65 loài và 55 giống theo Wollenweber và Reinking (1935) [20], hơn 70 loài và hơn 55 giống theo Gerlach và Nirenberg (1982) [13]. Cho đến bây giờ, hệ thống phân loại Fusarium vẫn còn mơ hồ và không chắc chắn nên không cho phép giải thích sự phát sinh loài một cách phù hợp [15]. 2.3.2. Hình thức sinh sản. Fusarium có 2 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính. Do thiếu giai đoạn sinh sản hữu tính trong vòng đời nên người ta gọi chung là nấm không hoàn chỉnh hay nấm bất toàn.[6]. 2.3.2.1. Sinh sản sinh dưỡng Sợi nấm : Từ 1 sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và phân nhánh thành hệ sợi nấm. Bào tử hậu (bào tử màng dày, bào tử áo : Bào tử hậu là những tế bào hơi tròn, có tế bào chất được cô đặc lại [17], có màng dày bao bọc [5], thỉnh thoảng có bào tử hậu với vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố [18]. Ở bào tử này, chất dinh dưỡng được chuyển từ tế bào kề bên sang tế bào ưu tiên làm tế bào này phồng lên, chứa nhiều chất dự trữ và có thể chịu đựng những điều kiện bất lợi trong một thời gian khá dài. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng sẽ nảy mầm và phát triển thành sợi nấm mới. Bào tử hậu có thể nằm ở giữa sợi nấm hoặc ở đầu tận cùng của nó [5], [17]; có thể ở dạng đơn lẻ, dạng cặp đôi, dạng chuỗi hay dạng cụm. Ở các loài như F. solani và F. oxysporum, bào tử hậu thường ở dạng đơn, đôi, thỉnh thoảng dạng ba và ít khi có dạng cụm. Tuy nhiên, có một số loài (đặc biệt là F. proliferatum) có sợi nấm khí sinh với chuỗi những tế bào phình to, rất dễ bị nhầm là bào tử hậu [18]. Bào tử hậu có thể quan sát dưới kính hiển vi sau 10-14 ngày. Nhưng nhiều loài Fusarium có thời gian hình thành bào tử hậu chậm hơn (20- 42 ngày) và có khi không tạo ra chúng [12], [18]. Một số loài Fusarium có tạo bào tử hậu như F. chlamydosporum, F. napiforme, F. oxysporum, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichoides, F. equiseti, F. tricinctum.[12], [18]. 2.3.2.2. Sinh sản vô tính Bào tử đính thường được hình thành ở các loài nấm bất toàn. Đa số bào tử đính thường sắp xếp thành chuỗi, có khi thành từng khối. Một số bào tử đính nằm đơn độc từng cái một trên cuống bào tử đính. Cuống bào tử đính có thể đơn bào hoặc đa bào, không phân nhánh hoặc phân nhiều nhánh, mọc riêng lẻ hay sắp xếp từng cụm [1]. Ở các loài Fusarium thì bào tử đính thường là bào tử ngoại sinh, có 2 loại: bào tử đính lớn và bào tử đính nhỏ. Bào tử đính lớn ( bào tử lớn) : Bào tử trong suốt, được hình thành từ thể bình trên cành bào tử có nhánh hay không có nhánh [9]. Bào tử lớn có kích thước 3 - 8 x 11 - 70 µm. Kích thước bào tử thường dùng để phân biệt giữa các loài Fusarium quá dài (F. avenaceum, F. coccophilum, F. decemcellulare..) và quá ngắn (F. xylarioides, F. larvarum, F. poae..). Hầu hết các loài Fusarium có bào tử lớn từ 3 - 7 vách ngăn, tuy nhiên có nhiều loài có từ 1 - 3 vách ngăn (F. dimerum, F. dlamini, F. poae..) hoặc nhiều hơn 7 vách ngăn (F. decemcellulare, F. coccophilum..). Bào tử lớn có hình lưỡi liềm hay hình trụ. Các loài Fusarium khác nhau có thể phân biệt được tùy theo mức độ cong của bào tử lớn (thẳng ở bên phải và cong rõ ràng ở bên trái); tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng của bào tử (thon nhọn ở đầu và to ở giữa). Phần to nhất của bào tử lớn cũng có thể là một đặc điểm để nhận dạng các loài Fusarium. Ví dụ như F. culmorum và F. sambucinum có phần đầu bào tử to nhất, giống hình cái nêm còn F. acuminatum có phần cuối bào tử to nhất [18]. Phần đầu và phần cuối bào tử lớn có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau. Phần đầu bào tử có thể có dạng: cái móc, hình núm vú, hình đầu tù, hình nón. Phần cuối bào tử có thể có dạng: hình đầu tù, hình núm vú, hình bàn chân, hình bàn chân được kéo dài, hình thon dài với vết khía hình chữ V [12], [18]. Bào tử đính nhỏ ( bào tử nhỏ) : Kích thước 2-4 x 4-8 µm, được hình thành từ cành bào tử phân sinh phân nhánh hoặc không phân nhánh, mọc trực tiếp từ sợi nấm hoặc tụ lại thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi [4]. Bào tử có 0-1 vách ngăn (đặc biệt có loài có 2-3 vách ngăn). Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như: hình cầu, hình gần cầu, oval, hình cầu với một đầu nhọn, hình thoi, hình quả thận, hình hạt chanh, hình liềm, hình trứng, hình trứng ngược, hình chùy [12]. Các loài Fusarium khác nhau thì có hình dạng bào tử nhỏ khác nhau. Tuy nhiên, có những loài Fusarium mà bào tử nhỏ của chúng có nhiều hơn một hình dạng. Sự có mặt bào tử nhỏ hình cầu là đặc điểm để nhận dạng F. poae cũng như để phân biệt F. sporotrichioides và F. chlamydosporum. Còn bào tử nhỏ hình hạt chanh được tạo ra với số lượng lớn thì chỉ có thể là bào tử của F. tricinctum [18]. 2.3.3. Chu kỳ sống của Fusarium Nấm Fusarium có 2 giai đoạn tồn tại trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích cực và giai đoạn tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ). Ở điều kiện thích hợp, môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm sẽ sinh trưởng tích cực. Ngược lại, khi gặp điều kiện bất lợi, lượng dinh dưỡng trong đất còn rất ít thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc này, các loài Fusarium sẽ hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào tử hậu. Cũng trong giai đoạn này, cường độ hô hấp và nguồn dinh dưỡng dự trữ được tích lũy trong hệ sợi nấm sẽ được các loài Fusarium sử dụng ở mức thấp nhất, nhằm đảm bảo sự tồn tại của chúng trong thời gian dài. Một số loài Fusarium không sản sinh bào tử hậu thì chúng sẽ tiếp tục tồn tại bằng cách làm chậm lại các hoạt động hoại sinh hay ký sinh trong cơ thể vât chủ. Vì thế, sau khi thu hoạch vụ mùa với các cây bị bệnh do Fusarium thì khả năng trong đất còn sót lại Fusarium là rất cao. 2.3.4. Cơ sở lý luận và thực tiễn 2.3.4.1. Cơ sở lý luận. Trong sản xuất nông nghiệp, con người luôn tìm cách để nâng cao năng suất cây trồng tạo ra nhiều sản phẩm đa dạng đáp ứng ngày càng nhiều, càng tố hơn nhu cầu của con người. Khi con người tiến hành các hoạt động sản xuất nông nghiệp đã tác động vào tự nhiên, rõ hơn là tác động vào hệ sinh thái nông nghiệp bằng nhiều biện pháp như: canh tác, hoá học, sinh học,… nhằm tạo ra nhiều sản phẩm thu lợi theo ý muốn chủ quan của mình. Làm cho sâu bệnh gây hại cây trồng cũng tăng lên không kém, phát sinh nhiều loại sâu bệnh mới nguy hiểm hơn, nhiều loại đã xuất hiện hiện tượng kháng thuốc, quen thuốc bảo vệ thực vật. Nếu không có một phương thức canh tác hợp lý, khoa học thì chính hoạt động sản xuất đó rất dễ dàng làm phá vỡ cân bằng vốn rất mỏng manh của hệ sinh thái nông nghiệp. Sự phát sinh thành dịch của một số dịch hại tàn phá mùa màng, cây trồng chính là biểu hiện của sự mất cân bằng trong hệ sinh thái nông nghiệp, là hậu quả của một quá trình sản xuất “thiếu nhìn xa trông rộng của con người”. Hướng phát triển của một nền nông nghiệp hàng hoá bền vững là không làm phá vở mối cân bằng đó mà lợi dụng nó để tác động theo hướng có lợi cho con người. Khả năng gây bệnh của ký sinh vật lên cây trồng là do các đặc tính như: tính xâm lược, tính gây bệnh và tính độc quyết định. Bình thường mổi loại ký sinh vật có một phổ ký chủ, một môi trường sống nhất định nhưng chúng cũng có khả năng tiến hoá để thích ứng khi môi trường thay đổi, thức ăn thay đổi.Do đó khả năng gây bệnh của chúng cũng sẻ thay đổi theo, phổ ký chủ có thể mở rộng hay thu hẹp. Sự xuất hiện những bệnh hại mới trên cây trồng cũng là vì thế. Hiện nay, trái đất đang chịu sự thay đổi bất thường của khí hậu, kéo theo sự thay đổi của hệ sinh thái, đồng thời nhu cầu của con người với nông nghiệp là rất lớn và thực tế sản xuất luôn đi trước khoa học. Chính vì vậy công tác điều tra, kiểm soát và quản lý dịch hại trên cây trồng phải được tiến hành một cách thường xuyên, liên tục. Mặt khác, cây tiêu là loại cây lâu năm, sâu bệnh hại tiêu mà đặc biệt là bênh hại diễn biến rất phức tạp, nguy cơ phát sinh bênh mới và bùng phát dịch bệnh là rất cao. Vì vậy công tác điều tra, thu thập số liệu, thông tin về bệnh hại tiêu là cần thiết để làm cơ sở cho những cải thiện về kỷ thuật sản xuất, đề ra biện pháp phòng trừ và có hướng quản lý thích hợp hơn để từ đó nâng cao năng suất, tăng thu nhập cho người trồng tiêu. Ở Quảng trị cần phải thực hiện nghiên cứu này bởi nơi đây tiềm năng cho cây tiêu phát triển là rất lớn, cho chất lượng hạt tiêu cao.Đồng thời tại đây đang gặp phải một số trở ngại về kinh tế, điều kiện tự nhiên, đặc biệt là phương thức sản xuất hồ tiêu của nông dân ở đây còn lạc hậu,chưa lien kết lại với nhau, phần lớn sản xuất theo kiểu truyền thống, kinh nghiệm, điều đó đã không đáp ứng được nhu cầu sản xuất hàng hoá và làm cho bênh hại tiêu có diễn biến phức tạp hơn. 2.3.4.2. Cơ sở thực tiễn. Từ xa xưa, hạt tiêu đã được xem là một sản phẩm quý dung làm lễ vật triều cống, bồi thường chiến tranh trong thời La Mã cổ đại. Thời nay hạt tiêu lại càng khẳng định hơn nữa giá trị của nó. Là một loại gia vị quan trọng trong công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến đồ hộp, dược sử dụng trong y dược, trong công nghệ hương liệu, ngoài ra còn được dùng để phòng trừ côn trùng gây hại,… Trong phong tục ẩm thực của người phương Đông hạt tiêu là gia vị không thể thiếu được trong việc bêp núc, làm tăng thêm hương vị thơm ngon của món ăn, là bí quyết thành công của những người nội trợ. Trong y dược, do hạt tiêu có chứa chất Piperin, tinh dầu và nhựa nên kích thích được tiêu hoá, chữa đau bụng, ói mữa khi ăn nhầm món lạ,… Trong công nghiệp, chất Piperin là nguyên liệu để sản xuất Piperonal cùng với tinh dầu và sản xuất được chiết xuất từ nhựa hạt tiêu được sử dụng trong kỹ nghệ sản xuất nước hoa, dầu xoa bóp,… Trong phòng trừ côn trùng, người ta lấy dịch chiết từ hạt tiêu để tổng hợp các chế phẩm có khả năng ngăn côn trùng phá hại đồ gia dụng. Việc phát triển nhanh chóng cây hồ tiêu cần phải tiến hành song song với công tác bảo vệ. Điều quan trọng là phải tiến hành điều tra tình hình sâu bệnh hại ở mổi địa phương, xác định các đối tượng gây hại chính và có biện pháp phòng trừ hiệu quả nhằm góp phần nâng cao năng suất sản lượng hồ tiêu. Tuy nhiên trong những năm qua công tác phòng trừ bệnh hại tiêu nói chung và bệnh chết chậm hồ tiêu nói riêng chưa được chú trọng. Kiến thức về bệnh này của đội ngủ cán bộ kỹ thuật cũng như nông dân còn nhiều mặt hạn chế nhất là việc phát hiện sớm và đưa ra phương pháp phòng trừ kịp thời, có hiệu quả, đây là một vấn đề khó khăn cho sản xuất hiên nay. Bệnh chết chậm hồ tiêu là một loại dịch hại khó phòng trừ, vì vậy cho đến nay chưa có biện pháp nào có thể phòng trừ bệnh một cách có hiệu quả để và triệt để có thể sử dụng rộng rãi trong sản xuất. Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu. Nấm Fusarium. spp gây bệnh chết chậm trêm cây tiêu. 3.2.Phạm vi nghiên cứu. Địa điểm: Huyện Cam Lộ - Tỉnh Quảng Trị. Thời gian: Từ tháng 1/2009 – 5/2010 3.3. Nội dung nghiên cứu. Phân lập nấm Fusarium. spp từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh Phân loại các chủng nấm Fusarium spp. dựa vào hình thái và màu sắc tản nấm. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Fusarium spp. Kiểm tra tính gây bệnh của các chủng nấm đại diện trong điều kiện in vivo. 3.4. Phương pháp nghiên cứu.  3.4.1. Phân lập nấm Fusarium spp. từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh. 3.4.1.1.Phương pháp lấy mẫu bệnh. Tiến hành thu thập mẫu rễ ở các vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm tại các vùng trồng tiêu ở các xã Cam Chính , Cam nghĩa huyện Cam Lộ - Quảng Trị . Cách lấy mẫu Đào vùng đất ở gần gốc tiêu cách gốc khoảng 20 – 30cm, chọn những rễ tơ có triệu chứng bị, bệnh biểu hiện là các chấm đen và vết thối trên rễ và đầu mút của rễ, ghi ngày lấy, địa điểm, ký hiệu mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC. 3.4.1.2. Phương pháp phân lập mẫu rễ bị nhiễm bệnh Sau khi thu mẫu về, tiến hành phân lập mẫu rễ trong phòng thí nghiệm. Trong quá trình phân lập không khử trùng bề mặt các rễ con quá mức bởi vì chất khử trùng có thể tiêu diệt tất cả các nấm ký sinh trong rễ con, bao gồm cả nấm gây bệnh. Các bước phân lập: 1. Lau chùi bàn làm việc bằng cồn 70%. 2. Chọn những rễ con có cả phần khỏe (không triệu chứng) và phần bị bệnh, rửa chúng dưới vòi nước đang chảy để loại sạch đất và bụi bấn. 3. Nhúng dụng cụ (kẹp và dao mổ) trong cồn l 96% và hơ khô trên ngọn lửa. 4. Nhúng qua các rễ con trong cồn 70%, rửa nhanh trong nước vô trùng 3 lần và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. 5. Dùng dụng cụ đa khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1-2 mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trường chọn lọc PPA có chứa kháng sinh để hạn chế vi khuẩn phát triển. 6. Ấn nhẹ các miếng cấy lên mặt thạch sao cho chúng tiếp xúc tốt với môi trường phân lập. 7. Đặt đĩa cấy vào tủ định ôn 280C trong 3-5 ngày cho đến khi các tản nấm phát triển. 3.4.1.3. Phương pháp cấy truyền từ các đĩa phân lập. Cấy truyền là bước trung gian giữa phân lập từ mẫu bệnh và làm thuần vi sinh vật gây bệnh. Giai đoạn này giúp xác định vi sinh vật nào đã được phân lập. Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập nấm Fusarium từ rễ và cấy truyền (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) Các bước cấy truyền: 1. Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. 2. Xác định xem có nhiều hơn một loài nấm mọc lên hay không. 3. Cấy truyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ miếng cấy. 4. Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trường PDA. 3.4.1.4.Phương pháp làm thuần mẫu nấm. Sử dụng phương pháp cấy đơn bào tử bằng phương pháp pha loãng. Cấy đơn bào tử là quá trình cấy truyền một bào tử đã nảy mầm để tạo một mẫu nấm thuần. Sơ đồ 3 2: Quy trình cấy đơn bào tử, thao tác chọn lựa một bào tử đúng cách. (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) 3.4.2. Sơ bộ quan sát và đánh giá các chủng nấm Fusarium spp. thông qua hình thái nấm. 3.4.2.1.Quan sát màu sắc tản nấm Fusarium spp. Thành phần môi trường: Sử dụng môi trường PSA Cắt miếng thạch (2 x 2 mm) chứa sợi nấm và áp lên đĩa môi trường PSA Nuôi 12 ngày, ở 28 0C trong điều kiện chiếu sáng Quan sát màu sắc tản nấm ở mặt trên, mặt dưới 3.4.2.2. Quan sát tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường PDA Cắt miếng thạch (2 x 2mm) chứa sợi nấm và áp lên đĩa môi trường PDA Nuôi ở 28 0C Đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm sau 24h, 48h, 72h, 96h. 3.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử nấm dưới kính hiển vi. Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường PDA Cắt miếng thạch (2 x 2mm) chứa sợi nấm và áp lên đĩa môi trường PDA Nuôi ở 28 0C Làm tiêu bản để quan sát bào tử dưới kính hiển vi. Có thể quan sát bào tử lớn và bào tử nhỏ sau 4 ngày nuôi cấy. Bào tử hậu có thể quan sát sau 10 ngày. 3.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo Các bước lây bệnh nhân tạo được tiến hành theo quy tắc Koch Tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp đưa bào tử nấm vào đất. Chuẩn bị cây tiêu con: Dây tiêu lươn được lấy từ vườn sạch bệnh tại Quãng Trị và được trồng vào ngày: 20 / 9 / 2009 Chọn những dây lươn chắc mập, chiều dài lóng đồng đều. Cắt hom tiêu với độ dài 25 – 30cm, mỗi hom có từ 2 – 3 mắt. Xử lý qua cồn 700. Hỗn hợp đất trồng tiêu được trộn theo tỷ lệ : 2 đất + 1 cát + 1 phân chuồng hoai mục + vôi bột ( tỷ lệ : 15g vôi cho 10kg hỗn hợp trên) đảm bảo pH trung tính. Hỗn hợp đất được phơi nắng 3 ngày để tiêu diệt nguồn bệnh trong đất. Chuẩn bị dịch bảo tử nấm. Chọn lọc những chủng nấm đại diện nuôi cấy trong môi truờng lỏng ½ PDA đến khi sinh bào tử. Sau đó tiến hành thu dịch bào tử và tiến hành tưới trực tiếp vào cây tiêu con. Mổi công thức tưới 250 ml bào tử với nồng độ 105 bào tử/ml. Tiến hành lây bệnh. Chọn 8 chủng nấm đại diện và 1 công thức đối chứng. Mổi công thức được nhắc lại 3 lần. 3.4.4. Xử lý thống kê Số liệu thí nghiệm là kết quả trung bình cộng của 4 lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích Duncan’s test với p<0,05 bằng chương trình SAS. Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập nấm Fusarium spp. từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh 4.1.1. Kết quả phân lập nấm Fusarium spp. Tiến hành phân lập các chủng nấm Fusarium từ 14 vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm tại Cam Chính, Cam Thành - Cam Lộ - Quảng Trị dựa vào các đặc điểm nhận dạng hình thái thông qua màu sắc tản nấm và hình dạng các loại bào tử, đã xác định được 22 chủng là Fusarium spp.. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Qua bảng 4.1, cho thấy hầu hết các mẫu rễ thu thập từ các vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm đều có sự hiện diện của nấm Fusarium.spp. Riêng các chủng nấm phân lập từ các mẫu rễ ở các vườn CC3, CC5, CC6 và CT4 không phải là nấm Fusarium spp. dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước bào tử lớn, bào tử nhỏ). Điều này cho thấy không chỉ có nấm Fusarium spp. trên mẫu rễ mà còn có sự hiện diện của rất nhiều loài nấm khác. Các nấm này có thể là Rhizoctonia, Pythium, Sclerotium, Phytophthora…[9], chúng cùng với Fusarium spp. xâm nhập vào các tế bào ngoài của vỏ rễ mà các tế bào này có thể bị tổn thương do tuyến trùng ký sinh trước đó [10]. Có thể vì nguyên nhân đó nên không thu được Fusarium spp. trong những lần phân lập đầu tiên. Mặt khác, khi phan lập trên môi trường PPA mô có bổ sung thêm chất kháng sinh để ức chế hầu hết các vi khuẩn, cho phép Fusarium mọc chậm, tạo thành các tản nấm nhỏ đường kính 5 - 10 mm sau 5 - 7 ngày. Tuy nhiên một số loài vi khuẩn và loài nấm có khả năng phát triển cạnh tranh với Fusarium spp.