Đề tài Nghiên cứu nuôi cấy Meristem cây tỏi

á đứng có dạng lòng máng, củ non và già đều có màu tím dạng củ tròn và dẹt, thời gian sinh trưởng 130-135 ngày. 2.4.4. Giống tỏi tía: Lá xanh xẩm, lá đứng phiến lá dày dạng lòng máng, cuống lá xanh, cây cao to, củ non có màu tím xẩm củ già có màu tía hình dạng tròn đều. Thời gian sinh trưởng 125-130 ngày. 2.5. Kỹ thuật trồng trọt. 2.5.1. Luân canh tăng vụ Tuỳ theo điều kiện của người sản xuất hoặc của các trang trại có thể bố trí công thức luân canh phù hợp nhằm tăng hiệu quả sử dụng ruộng đất, tăng thu nhập cho người lao động, đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng. Thường áp dụng các công thức luân canh cho tỏi như sau: Lúa xuân - Lúa mùa sớm - Tỏi ta T2- T6 T6- T10 T10- T2 Lúa xuân - Mạ mùa - Rau muống - Tỏi ta T2-T6 T6 - T7 T7- T9 T10-T2 Rau xuân hè - Lúa mùa sớm - Tỏi ta T2-T6 T6-T9 T10-T2 Lạc xuân - Lúa mùa sớm - Tỏi ta T2-T6 T6-T9 T10-T2 Cà chua xuân hè - Lúa mùa sớm - Tỏi ta T2-T6 T6-T9 T10-T2 2.5.2. Thời vụ - Thời vụ sớm nhất cho đất chuyên canh rau vùng Đồng bằng sông Hồng trồng vào cuối tháng 9, năng suất vụ này không cao, cũng không ổn định, cung cấp cho thị trường sớm nên giá bán cao - Thời vụ tập chung chính vụ từ 15-20/10. - Thời vụ muộn trồng cuối tháng 10 đầu tháng 11. Thời vụ này cây sinh trưởng khó khăn, tỏi dễ bị bệnh hại xâm nhiễm. 2.5.3. Đất đai và phân bón Đất đai cho trồng tỏi cần phải làm kỹ. Mặt luống rộng từ 1,2-1.5m, chiều cao 15-20cm, rãnh rộng 25cm. Phân bón cho tỏi như sau: - Phân chuồng: Một sào Bắc Bộ bón từ 5,5-7 tạ phân chuồng - Phân đạm: 6-8 kg - Phân lân : 10 -15 kg - Phân kali: 7-8 kg 2.5.4. Chuẩn bị củ giống Trước khi trồng từ 5-7 ngày dỡ bỏ giống tỏi từ trên giá hoặc từ trên gác bếp xuống, sau 2-3 ngày thì làm vệ sinh củ giống như sau: Tẩy đế: dùng tay dứt bỏ những rễ củ từ năm trước, tiếp đến tách bóc bẹ lá bọc phía ngoài củ và lớp màng mỏng ngăn cách giữa các nhánh. Không được bóc vỏ của mỗi nhánh tỏi, không dùng những nhánh quá nhỏ để làm giống. Trước khi trồng ngâm giống trong dung dịch phân lân 1-2% từ 1-2giờ, sau đó vớt ra để giáo nước rồi trồng. Như vậy sẽ kích thích rễ tỏi mọc sớm. Một sào trồng từ 25-30kg, 1ha trồng 700-810kg giống. 2.5.5. Khoảng cách và mật độ trồng Trên luống từ 5-6 hàng, khoảng cách hàng 18-20cm, khoảng cách cây từ 8-10cm, 1ha trồng khoảng 50 vạn cây, 1 sào trồng khoảng 1,8 vạn cây. Khi trồng dùng ngón cái và ngón trỏ cầm nhánh tỏi ấn nhẹ để 1/3 đến 1/2 nhánh tỏi nằm trong đất. Trồng sâu cây khó mọc. Sau khi trồng khỏa nhẹ đất vào các chân nhánh tỏi và ấn nhẹ cho nhánh tỏi đứng vững. 2.5.6. Chăm sóc sau trồng - Phủ rơm rạ: Sau trồng dùng rơm rạ vụ trước phủ kín mặt luống, tốt nhất nên để rơm rạ từng lớp sóng, không rũ rối, 1ha dùng 2-3 tấn rơm rạ, 1 sào dùng 70-100 kg rơm rạ. Rơm rạ có tác dụng giữ ẩm, giữ nhiệt, làm cho đất luôn tơi xốp, hạn chế cỏ dại. - Tưới nước:Tỏi thuộc cây ưa mát nên cần phải tưới nước đều nên để nguyên lớp rơm rạ khi tưới để giữ ẩm cho đất. Mặt khác việc để cả lớp rơm rạ còn tránh nóng cho cây và không cho cỏ dại mọc. Khoảng nửa tháng sau khi cây mọc nên tưới đạm với liều lượng 30- 40kg/ha. Khi tưới cho nước chảy vào sát gốc, không nên tưới trực tiếp vào gốc hoặc lên lá. Trong vòng sinh trưởng của tỏi nên tưới 4 -5 lần. Muốn cho củ to, chắc thì nên bón thêm lân, kali hoặc cho bếp. ở vùng Miền Bắc người ta tưới cho tỏi bằng nước tiểu pha với nước với tỷ 1/10, tưới vào buổi sáng và buổi chiều. - Trừ cỏ:Phải thường xuyên nhổ cỏ dại thao tác phải nhẹ nhàng. -Tươi thúc: Tươi thúc từ 3-4 lần trong thời gian sinh trưởng của cây tỏi. Lần thứ 1 tưới thúc khi cây có 1-2 lá thật, sau trồng từ 15-20 ngày, liều lượng 1-2kg/sào, 28-56 kg phân ure 1ha. Lần 2 thúc sau trồng 30-35 ngày, liều lượng 2-2,5 kg/sào Bắc Bộ. Lần này cần kết hợp bón phân kali lần thứ nhất, liều lượng 2-2,5kg/ sào Bắc Bộ. Sau trồng 45-55 ngày tưới thúc đạm lần thứ 3 liều lượng giống như lần 2. Sau trồng 50-60 ngày bón thúc kali lần 2, liều lượng 2-3kg/sào. Nồng độ dung dịch từ 0,5 đến 1-1,5% cho các loại phân trên. Sau khi tưới thúc dùng thùng ô doa tưới nhẹ để rửa lá. 2.5.7. Phòng và chữa bệnh cho tỏi Hiện nay tỏi thường mắc các bệnh như: - Bệnh sương mai: Bệnh này thường xuất hiện cuối tháng 11 khi nhiệt độ thấp độ ẩm cao. Vào những ngày này có sương nên tưới nước lã để rữa lá. Để phòng bệnh sương mai cho tỏi cần phải phun thuốc Boocdo 1% (gần 1 kg phèn xanh, 1kg vôi cục, 100lít nước), Zineb 2- 4% phun khoảng 18 -20 lít/sào Bắc Bộ. - Bệnh than đen: Trên củ tỏi vào lúc sắp thu hoạch thường xuyên xuất hiện các chấm đen. Để phòng bệnh này người ta phun dung dịch Zineb, nếu phát hiện củ bị bệnh thì phải lựa ra để loại bỏ. -Bệnh nghẹt cổ rễ Thời kỳ cây con tỏi thường hay bị bệnh nghẹt cổ rễ, cây thấp bé, còi cọc. Nguyên nhân chủ yếu là do đất bị gí chặt, không tơi xốp thông thoáng. Cần phải tăng cường xỉa xới đất và chăm sóc. 2.6. Thu hoạch và bảo quản Từ khi mọc đến thu hoạch mất khoảng 4 tháng, khi quan sát thấy lá tỏi đã già héo thì có thể tiến hành thu hoạch tỏi, người ta nhổ củ rũ sạch đất bó thành chùm rồi treo lên dây để chổ thoáng. Nếu chọn củ tỏi để làm giống cho vụ sau cần lấy những củ già (thời gian sinh trưởng khoảng 140 ngày), củ to đường kính khoảng 3,5 – 4 cm, nhiều nhánh (12-15), không bị bệnh, bó tỏi chung lại rồi cất ở nơi thoáng mát hoặc trên gác bếp. 2.7. Tình hình sản xuất tỏi trên thế giới và trong nước 2.7.1. Tình hình thế giới. Cây tỏi được trồng hầu hết ở tất cả các nước trên thế giới. Tuy nhiên diện tích không nhiều. Ở nhiều nước cây tỏi chỉ được trồng làm thức ăn và làm thuốc chữa bệnh trong gia đình chưa là cây xuất khẩu ra nước ngoài. Đến nay do nhiều lý do trong đó là do điều kiện khí hậu của các nước không thích hợp nên cây tỏi không phát triển được. Tuy nhiên một số quốc gia có điều kiện khí hậu giống như Việt Nam thì cây cây tỏi chiếm diện tích khá lớn như: Braxin, Đài Loan, Trung Quốc, Mỹ ... Trong những năm gần đây diện tích và năng suất trồng tỏi không ngừng tăng lên, trong đó diện tích trồng hành tỏi ở Châu Á là lớn nhất. Các nước dẫn đầu về diện tìch là Mỹ, về sản lượng là Trung Quốc và về năng suất là Liên Xô. Theo FAO, 1997 sản lượng tỏi trên thế giới đạt 11,8 triệu tấn, Châu Á chiếm 10,4 triệu tấn. Năng suất tỏi trên thế giới bình quân đạt 11,0 tấn/ha, Châu Á năng suất đạt 12 tấn/ha. Ở hầu hết các loại hành tỏi phù hợp với vùng khí hậu mát mẻ nên được trồng nhiều ở Miền Bắc Đài Loan. Năm 2002 khoảng 179.500ha đất được sử dụng trồng rau tập chung chủ yếu ở các tỉnh Vân Lâm, Trương Hoa, Đài Nam và Chiayi sản lượng đạt 3.462.000 tấn với năng xuất trung bình khoảng 19.300kg/ha trong đó có tỏi. Bên cạnh đó Braxin luôn là quốc gia đi đầu trong sản xuất nông sản (2006) với 2,4 triệu tấn trị giá 518 triệu USD, tăng 28% về khối lượng và 11% về giá trị với cùng kỳ năm 2005. Trong đó lúa mỳ đạt 272 triệu USD, Lê đạt 23 triệu USD, tỏi trên 21 triệu. 2.7.2. Tình hình sản xuất trong nước Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa khí hậu mát mẻ rất thích hợp với các loại rau quả trong đó có cây tỏi, đây là điều kiện không phải nước nào cũng có trên thế giới. Sản xuất rau sạch đang là vấn đề được Đảng và Nhà nước quan tâm và đầu tư. Được sự quan tâm của Đảng và Nhà nước trong những năm gần đây các hộ gia đình, các vùng chuyên canh rau lớn như Hà Nội, Mê Linh (Vĩnh Phú), Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Đà Lạt, Quảng Ngãi và các vùng ven đô thành phố Hồ Chí Minh... đã mở rộng diện tích trồng rau, trong đó diện tích trồng tỏi khá lớn. Hàng năm diện tích trồng tỏi của Mê Linh từ 500-600ha. Ở huyện đảo Lý Sơn tỉnh Quảng Ngãi với hơn 300 ha trồng tỏi nhiều hộ gia đình đã đi lên từ cây tỏi, với 8 sào đất trồng tỏi lãi xuất lên tới 30-40 triệu đồng. Những năm trước nhờ địa phương làm tốt công tác khuyến nông nên sản lượng tỏi mỗi năm một tăng. Nếu như năm 2001 năng xuất tỏi của Lý Sơn đạt 42tạ/ha sản lượng đạt hơn 1300 tấn thì đến năm 2005 năng xuất tăng hơn 10 tạ/ha. Tổng sản lượng đạt gần 1500 tấn/ha trên cùng một diện tích. Xã Nam Trung huyện Nam Sách tỉnh Hải Dương nhờ trồng tỏi kết hợp với hai vụ lúa đã đưa diện tích bình quân của xã đạt hơn 55 triệu/ha/năm, vụ tỏi 2004- 2005 xã thu hoạch khoảng 4,4 tỷ đồng đến năm 2005 – 2006 tăng 7,5 tỷ đồng. Nhờ biết tận dụng và phát huy thế mạnh của địa phương nên nếu năm 2000 thu nhập bình quân theo đầu người của xã chỉ đạt 4,5 triệu đồng/người/năm thì đến 2005 thu nhập bình quân đầu người đạt 6,3 triệu đồng/người/năm. Có đến 60- 70% gia đình giàu lên nhờ cây tỏi, có những hộ đã đưa được thương hiệu hành tỏi của quê hương vượt khỏi lũy tre làng. Ở xã đã thành lập nhiều cơ sở sản xuất chế biến tỏi và các sản phẩm được chế biến từ tỏi đã được xuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản. Bên cạnh đó tỉnh Thái Bình cũng là nơi có diện tích trồng tỏi lớn của cả nước. Riêng xã Quỳnh Hải Huyện Quỳnh Phụ là xã luôn dẫn đầu huyện về phong trào trồng cây vụ đông. Năm 2005 toàn xã phấn đấu gieo trồng 275 ha cây nông nghiệp trong đó diện tích trồng tỏi chiếm 15 ha. Huyện Trường Phù tỉnh Sơn La vụ ba năm 2006 có 112,16 ha trồng rau trong đó diện tích trồng tỏi chiếm 67,75% ha chiếm 60% diện tích đất trồng rau. Như vậy có thể nói cây tỏi là cây chủ lực của nhiều địa phương, diện tích trồng tỏi mỗi năm một tăng, kinh tế nhiều gia đình ngày càng ổn định và đi lên. 2.8. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 2.8.1. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thưc vật Năm 1838 trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học ngời Đức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào. Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tại độc lập. Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt hoá về chức năng khác nhưng không thành công. Điều đó đã giảm sự tin tưởng của các nhà khoa học đối với phơng pháp nuôi cấy mô tế bào trong thời gian dài. Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thí nghiệm của ông. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hoà thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, saccaroza, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tải trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua tên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng, dịch chiết nấm men. Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B: Thiamin (B1), nicotinic axit (B3), pyridioxin (B6). Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cà rốt, đây cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn. Bằng cách thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hoá trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng. Sau này người ta mới thấy rằng cllus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn. Đến năm 1948 Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp như Naphthylaxetic axit (NAA), 2,4 – Diclophenoxy axetic axit (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy. Năm 1955 Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là 6 – Furfuryl aminopurin (kinein). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng giai đoạn thứ hai. Năm 1957 Miller và Skoog công bố cá kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan mô sẹo có khuynh hớng tạo chồi, ngược lại tỉ lệ auxin/kinetin tăng mô sẹo có khuynh hướng tạo rể. Hiện nay cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh các cơ quan của mô, tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Miller và Shoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật. Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỷ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai tây và hoa lan. Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy tế bào thực vật đó là vi nhân giống. Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 2.8.2. ý nghĩa Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó khăn bằng các phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. 2.8.3. Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy thực vật in vitro là quá trình nuôi cấy thực vật trong điều kiện nhân tạo. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi cấy hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào thực vật. Người ta đã chứng minh mỗi tế bào thực vật riêng rẽ của cơ thể thực vật đều chứa toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN), nếu gặp điều kiện thích hợp thì những tế bào có thể phát triển thành những cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế bào thực vật được thể hiện qua khả năng phân hoá và phản phân hóa của nó. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào phân hóa đảm nhận các chức năng trong cơ thể. Tuy nhiên các tế bào khi đã phân hóa chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình mà trong trường hợp cần thiết ở điều kiện thích hợp chúng có thể quay lại dạng phôi sinh có khả năng phân chia tạo tế bào mới đó chính là sự phản phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là kết quả của quá trình hoạt hóa, phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của các cá thể hay trong điều kiện nhất định một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây những gen này bị ức chế) để cho các đặc tính mới, một số gen khác đình chỉ hoạt động đặc điểm vốn có trước đó điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc ADN của mỗi tế bào (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2000). Trong nghiên cứu in vitro vấn đề điều khiển hoạt hóa hay ức chế các gen được điều khiển bằng môi trường nuôi cấy đặc biệt các chất điều tiết sinh trưởng thực vật ở trong môi truờng. Trên cơ sở đó người ta điều khiển sự phân chia tế bào, tái phân hóa tế bào, bắt một tế bào chuyên hóa phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. 2.8.4. ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong chọn tạo giống cây trồng - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống. - Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt. - Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác. -Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản tập đoàn gen. Ngày nay khi cây trồng đang bị nhiễm rất nhiều bệnh khó chữa nhất là các bệnh do virus thì ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào lĩnh vực sạch bệnh đã tạo ra rất nhiều giống có chất lượng cao không nhiễm bệnh phục vụ cho quá trình sản xuất trong nước. Một trong các phương pháp làm sạch bệnh đó là nuôi cấy Meristem in vitro. 2.8.5. Các bước chính trong nhân vô tính in vitro Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: - Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân nhanh in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng mẫu cấy in vitro. 2.8.6. Cơ sở của phương pháp nuôi cấy Meristem in vitro. Virut tồn tại ở mọi tế bào sống. Những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1952) cho thấy. Nồng độ virus trong các cây bị bệnh phụ thuộc tốc độ phân chia và khả năng sinh trưởng của tế bào, tốc độ sinh trưởng càng mạnh thì nồng độ virus càng thấp những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus. Do đó sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy là tốt nhất. Theo Mathews (1970), Wanget Hu (1980): Meritem (mô phân sinh đỉnh) không chứa virus có thể do: + Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh. +Trong sự phân chia các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus. + Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép của virus. + Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng Meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây. 2. 8.7. Một số công trình nghiên cứu trên cây tỏi Trung tâm nghiên cứu sự phát triển Công nghệ làm vườn tiến tiến, Trường đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, 361-763, Nam Hàn đã nghiên cứu sự tăng trưởng của chồi cây tỏi và đã kết luận rằng trên môi trường MS có bổ sung 2% đường và 0,5 mg/l 1.2 iP cho kết quả tốt nhất. Trên môi trường MS chứa đựng 11% mg/l chất đường là môi trường tối ưu trong sự phát triển nhánh tỏi và những nhánh tỏi này được nuôi cấy trong môi trường trong 9 tuần. Tốc độ nhân cao nhất là 135 nhánh tỏi/ vật phẩm nuôi cấy. Ngoài ra người ta còn tiến hành nuôi cấy những nhánh tỏi trên môi trường MS có bổ sung 11% đường và 0,1 mg/l ỏ - NAA cho kết quả tốt nhất. PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu Đề tài được thực hiện nghiên cứu trên giống tỏi trắng. Đặc điểm của giống: Lá màu xanh ngà, to bản, củ to,lúc nhỏ có màu phớt trắng, khi củ già có lớp vỏ lụa màu trắng, đường kính củ 4- 4,5 cm. 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu cho thí nghiệm in vitro đó là đỉnh sinh trưởng của giống tỏi trắng. 3.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến quá trình tạo mẫu sạch để đưa vào nuôi cấy in vitro. - Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước Meristem đến sự tái sinh chồi. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tái sinh chồi từ Meristem. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và ỏ- NAA đến sự tái sinh chồi từ Meristem. - Nghiên cứu của nồng độ BA đến hệ số nhân chồi. 3.3. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng các biện pháp nuôi cấy mô tế bào hiện hành. Cách bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi, điều tra đều theo phương pháp nghiên cứu nông sinh học thông thường. Môi trường nuôi cấy là MS đặc + 30g/l đường glucozo pH môi trường là 5,7, có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng với các nồng độ khác nhau tùy mỗi thí nghiệm và tùy vào mỗi công thức. 3.3.1. Bố trí thí nghiệm Tất cả các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại mỗi lần 3 bình, mỗi bình 3- 4 mẫu. 3.3.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến quá trình tạo mẫu sạch. Chất khử trùng được sử dụng trong thí nghiệm là HgCl2 0,1% thời gian khử trùng mẫu là 4 phút, 6 phút, 10 phút. Thí nghiệm sử dụng môi trường nuôi cấy là MS đặc +30g/l đường gồm 3 công thức. CT1: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút CT2: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút CT3: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút 3.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu của Meristem đến sự tái sinh chồi. Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức, môi trường sử dụng trong thí nghiệm là MS + 30 g/l đường. CT1: Cắt Meristem với kích thước 0,3 mm. CT2: Cắt Meristem với kích thước 0,5 mm. CT3: Cắt Meristem với kích thước 0,8 mm. 3.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ Meristem Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức: CT1 : MS + 30g/l đường (ĐC) CT2 : ĐC + 0,5mg/l BA CT3 : ĐC + 1,0 mg/l BA CT4 : ĐC + 1,5mg/l BA CT5 : ĐC + 2mg/l BA 3.3.1.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và ỏ - NAA đến sự tái sinh chồi từ Meristem Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức. CT1 : MS + 30mg/l đường + 1mg/l BA. (ĐC) CT2 : ĐC + 0,1 mg/l ỏ - NAA CT3 : ĐC + 0,25 mg/l ỏ - NAA CT4 : ĐC + 0,5 mg/l ỏ - NAA 3.3.1.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA tới hệ số nhân chồi Thí nghiệm gồm 4 công thức: CT1 : MS + 30g/l đường CT2 : MS + 30g/l đường +0,5mg/l BA CT3 : MS + 30g/l đường +1mg/l BA CT4 : MS + 30g/l đường +1,5mg/l BA CT5 : MS + 30g/l đường + 2mg/l BA 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi Tổng số mẫu nhiễm Tổng số mẫu cấy - Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100 Tổng số mẫu chết Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu cấy - Tỷ lệ mẫu chết(%) = x 100 Tổng mẫu sống Tổng số nuôi cấy -Tỷ lệ mẫu sống(%) = x 100 Tổng số mẫu tạo chồi Tổng số mẫu nuôi cấy - Tỷ lệ mẫu tạo chồi(%) = x 100 Tổng chiều cao chồi - Chiều cao TB chồi(cm/chồi) = x100 Tổng số chồi Tổng số chồi tạo thành - Hệ số nhân ( lần) = Tổng số mẫu tạo chồi 3.3.3. Điều kiện thí nghiệm 3.3.3.1. Điều kiện phòng thí nghiệm Các thí nghiệm in vitro được thực hiện trong phòng thí nghiệm với điều kiện nhân tạo cho phép chủ động được các chế độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm. - Ánh sáng: Tất cả các mẫu đều được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ 2000- 2500 lux, thời gian chiếu sáng 13h sáng/ 11h tối. - Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng nuôi cấy luôn được giữ ổn định ở 22- 250C. - Độ ẩm: Luôn được duy trì ở độ ẩm 70%. Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, bộ môn công nghệ sinh học Trường ĐH Nông nghiệp 1. 3.3.4. Phương pháp sử lý số liệu Các số liệu được tính theo phương pháp thống kê toán học, quá trình sử lý số liệu được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Irristat và Excel. PHẦN IVKẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Thí nghiệm in vitro 4.1.1. Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới khả năng tạo mẫu sạch Tạo nguồn vật liệu ban đầu cho công tác nhân giống, công việc đầu tiên là khử trùng mẫu. Đối với các loại cây trồng khác nhau, việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết định tới sự thành công của cả quá trình nghiên cứu tạo cây con giống. Giai đoạn này cây cần đạt các yêu cầu sau: - Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp - Tỷ lệ mẫu sống cao - Mô nuôi cấy sinh trưởng tốt. Các mẫu trước khi được đưa vào nuôi cấy in vitro có thể được khử trùng bằng các biện pháp khác nhau. Phương pháp khử trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn là: Canxihyclorit (Ca(OCl)2), thủy ngân Clorua (HgCl2) hoặc Hyđroxit (H2O2) để khử trùng. Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian sử lý, khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy và khả năng đẩy hết các bọt khí trên bề mặt mô cấy ra ngoài (Nguyễn Văn Uyển, 1993). Với cây tỏi sau khi nghiên cứu các tài liệu chúng tôi thấy dùng HgCl2 0,1% là cho tỷ lệ mẫu sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút, 6 phút, 10 phút với mục đích tìm ra thời gian khử trùng tốt nhất. Các thao tác thực hiện : + Củ tỏi được bóc ra từng múi, bóc hết lớp vỏ lụa bên ngoài, cắt hết phần đầu và phần bên cạnh chỉ lấy phần chứa đỉnh sinh trưởng kích thước khoảng 1cm3 đem rửa bằng nước sạch, sau đó đem ngâm trong nước xà phòng 2 phút rồi rửa sạch xà phòng bằng nước sạch tráng lại bằng nước cất rồi đem khử trùng tại buồng cấy vô trùng. Mẫu cấy được đặt trong bình kín vô trùng tráng qua 2 lần bằng nước cất vô trùng, đổ cồn vào bình đựng mẫu lắc nhẹ trong 30 giây. Đổ hết cồn và tráng lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Chia mẫu ra 3 bình đã được khử trùng rồi đổ dung dịch HgCl2 0.1% đủ ngập lắc nhẹ để trong 4phút, 6phút, 10 phút. Sau đó lấy mẫu ra tráng lại bằng nước cất vô trùng 4- 5 lần để cho khô trước khi tiến hành thí nghiệm. Sau khi mẫu đã được khử trùng tiến hành cắt Meristem trên kính hiển vi và nuôi cấy ở môi trường Ms + 30g/l đường. Sau 2 tuần nuôi cấy thu được ở bảng1. Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch