Đề tài Nghiên cứu phân lập và tác dụng gây độc của gossypol từ hạt bông (Gossypium Barbadense L) trên một số dòng tế bào ung thư

ợc thêm vào. Dung dịch này sau đó được đậy kín, tránh ánh sáng ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 6 h, sản phẩm G-AA thu được bằng cách lọc qua phễu lọc hút chân không, rửa bằng ete dầu (30-60ºC) cho đến khi dịch ete dầu không mầu. Sản phẩm được sấy trong máy sấy chân không 24 h ở nhiệt độ phòng. Quá trình kết tinh này được lặp lại 3 lần. Trong các lần kết tinh thứ 2 và thứ 3, công đoạn lọc đầu tiên có thể được bỏ qua. Sản phẩm cuối cùng được xác định điểm chảy, phổ tử ngoại, MS và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC. 2.2.4. Xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất mà người ta sử dụng những phương pháp cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh. Ở đây, gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó đều đã biết nên có thể dễ dàng so sánh với các dữ liệu đã công bố. Cấu trúc hoá học của gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó được xác định bằng các phương pháp phân tích hiện đại như: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ tử ngoại, máy đo phổ hồng ngoại, máy đo phổ khối lượng, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H, và 13C, máy đo độ quay cực, máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và so sánh với dữ liệu đã công bố. 2.2.5. Tách đồng phân quang học từ hỗn hợp racemic Tách hai đồng phân này bằng phương pháp tạo dẫn xuất với amine bất đối L-phenylalaninol dựa theo phương pháp đã được mô tả bởi Sampatk D. S. [53]. 2.2.5.1. Điều chế bazơ Schiff gossypol-L-phenylalaninol dienamine (±)-G-AA (0,406 g; 0,70 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 6 ml acetonitrile và L-phenylalaninol (0,233 g, 1,54 mmol). Hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển n-hexane/EtOAc = 7/3. Sau khi phản ứng kết thúc (gossypol phản ứng hết), hỗn hợp này được chuyển vào bình chiết quả lê và thêm vào đó 50 ml nước cất và chiết bằng 50 ml DCM. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần. Gộp các dịch chiết DCM rồi làm khan bằng Na2SO4 khan. Lọc bỏ Na2SO4 qua giấy lọc, phần dịch chiết DCM sau đó được cất loại dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm thu được sản phẩm là hỗn hợp hai đồng phân diastereomer bazơ Schiff của gossypol. 2.2.5.2. Phân tách (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L- phenylalaninol dienamine Hỗn hợp đồng phân diastereomer (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được phân tách trên cột sắc ký sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường cỡ hạt 0,04-0,063 mm. Hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/EtOAc có độ phân cực tăng dần (100/0 – 40/60). Quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck) với hệ dung môi khai triển là n-hexane/ethyl acetate = 5/5, soi bản mỏng trên máy soi UV (CAMAG) tại bước sóng 254 nm. Các phân đoạn có các vết có Rf giống nhau được gộp lại và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Các phân đoạn chứa chất tinh sạch (1 vết trên SKLM) được đem kiểm tra sơ bộ cấu trúc bằng phương pháp phổ khối lượng và đo độ quay cực. 2.2.5.3. Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol (-)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,315 g; 0,40 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 15 ml DEE, 3 ml acetic acid và 0,5 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là n-hexan/EtOAc = 5/5. Sau khi phản ứng kết thúc (chất đầu phản ứng hết), hỗn hợp này được làm nguội về nhiệt độ phòng, chuyển vào bình chiết quả lê và chiết loại tạp chất bằng nước cất. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần (cho đến khi pH = 7). Pha nước sau đó được gộp và chiết lại bằng DEE. Các phân đoạn DEE được gộp lại và làm khan bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm. Sản phẩm thô chứa (-)-gossypol được tinh chế bằng sắc ký cột. Sử dụng sắc ký cột để tinh chế (-)-gossypol, chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0,04-0,063 mm) với khối lượng silica gel sử dụng gấp 30 lần khối lượng mẫu cần tinh chế. Sử dụng hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/EtOAc/acetic acid có độ phân cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1). Quá trình chạy cột được theo dõi bằng SKLM với bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), khai triển bằng hệ dung môi: n-hexan/EtOAc/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20% trong EtOH sau đó đốt trên bếp điện. Các phân đoạn chứa (-)-gossypol sạch (1 vết trên SKLM) được gộp lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và có thể kết tinh lại dưới dạng G-AA trong hỗn hợp DEE/acetic acid băng. Sản phẩm (-)-gossypol hoặc sản phẩm (-)-G-AA sau khi kết tinh được sấy trong tủ sấy chân không 24 h và bảo quản ở nhiệt độ -18ºC. Quá trình điều chế (+)-gossypol từ (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được tiến hành tương tự như với (-)-gossypol. Sản phẩm (+)-gossypol, (-)-gossypol đã qua tinh chế được khẳng định cấu trúc bằng phương pháp phổ tử ngoại, MNR, phổ khối, xác định góc quay cực, điểm chảy, xác định độ tinh sạch bằng HPLC. 2.2.6. Phương pháp HPLC đánh giá độ tinh sạch của sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol Các mẫu (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol được hòa tan trong dung môi acetonitrile, lọc qua màng lọc 0,45mM, hòa loàng đến nồng độ thích hợp sau đó được chuyển vào trong máy phân tích HPLC Điều kiện phân tích HPLC như sau: Máy sắc ký lỏng cao áp của hãng Agilent 1200 (Mỹ), cột sắc ký Inertsil ODS-3 (C18), cỡ hạt 5 µm (Nhật), kích thước cột 4,6 x 250 mm. Quá trình dò được thực hiện bằng detector UV khoảng bước sóng 220-500 nm. Pha động là hỗn hợp 85/15 của acetonitrile và đệm phosphate pH = 3 (10 mM KH2PO4, sau đó chỉnh về pH = 3 bằng H3PO4 đậm đặc). Tốc độ dòng được điều chỉnh ở 1 ml/phút. Thời gian chạy là 12 phút. Quá trình sắc ký được theo dõi bằng phổ tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm. 2.2.7. Xác định tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong hạt bông Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong hạt bông được xác định dựa theo phương pháp của Stipanovic và cộng sự [52]. Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo bazơ Schiff là dẫn xuất của gossypol trong hạt bông với amin bậc 1 bất đối là (R)-(-)-2-amino-1-propanol (D-alaninol). Sản phẩm phản ứng là các bazơ Schiff, là các đồng phân diastereomer có thể phân tách trên HPLC, trong khi các đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)-gossypol không thể tách ra khỏi nhau trên HPLC trong cùng điều kiện. Dựa theo tỷ lệ diện tích pic của 2 đồng phân diastereomer là (-)-gossypol–(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol trên HPLC có thể xác định được tỷ lệ của (+)-gossypol và (-)-gossypol tương ứng. - Chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử (R)-(-)-2-amino-1-propanol Dùng pipet lấy chính xác 2 ml (R)-(-)-2-amino-1-propanol (Sigma-Aldrich, tinh khiết 98%, d = 0,963 g/ml) vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml acetic acid băng, dùng acetonitrile định mức đến 100 ml. Thuốc thử được bảo quản trong bình tối mầu ở 4ºC và được đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. - Chuẩn bị mẫu (-)-gossypol-(R)-(-)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-(-)-2-amino-1-propanol đối chiếu: (-)-Gossypol và (+)-gossypol đã tinh sạch bằng phương pháp trên được sử dụng làm chất đối chiếu. Cân khoảng 1 mg (-)-gossypol vào ống nghiệm loại 10 ml. Thêm vào đó 5 ml hỗn hợp thuốc thử (R)-2-amino-1-propanol đã được chuẩn bị ở trên vào ống nghiệm chứa (-)-gossypol. Các ống nghiệm này sau đó được bịt kín bằng nút nhựa, lắc đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 70ºC trong 30 phút. Sau khi làm nguội về nhiệt độ phòng, hỗn hợp này được lọc qua màng lọc 0,45 µM, pha loãng đến nồng độ khoảng 10-15 µg/ml trước khi phân tích bằng HPLC. Tiến hành tương tự với (+)-gossypol để tạo dẫn xuất (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. Căn cứ vào thời gian lưu và phổ tử ngoại của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol để xác định vị trí pic tương ứng của chúng trong mẫu hạt trên HPLC. Chuẩn bị tương tự đối với mẫu đối chiếu là hỗn hợp (±)-gossypol ([a]D ≈ 00) để xác định tỷ lệ diện tích pic của các đồng phân diastereomer (-)-gossypol–(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol trên HPLC - Chuẩn bị mẫu hạt bông để phân tích HPLC: Hạt bông của các giống nghiên cứu được tách loại vỏ, phần nhân được nghiền thành bột đồng nhất bằng chày và cối sứ. Cân khoảng 2-3 mg bột nhân hạt bông vào ống nghiệm 5 ml, thêm vào đó 2 ml hỗn hợp thuốc thử (R)-2-amino-1-propanol. Các ống nghiệm này sau đó được bịt kín bằng nút nhựa và ủ trong bể ổn nhiệt trong vòng 30 phút ở 70ºC. Hỗn hợp sau đó được vortex và ly tâm. Phần dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 µm, hòa loãng đến nồng độ thích hợp bằng acetonitrile và được chuyển sang phân tích trên máy HPLC với điều kiện chạy theo mục 2.2.6. 2.2.8. Độc tính tế bào của gossypol 2.2.8.1. Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 được nuôi cấy trong trong môi trường Rothwell Park Memorial Institue 1640 (RPMI 1640) có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (Foetal Bovine serum, FBS) và 2 mM L-glutamine. Dòng tế bào LU-1 được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) có bổ xung thêm 10% FBS 2 mM L-glutamine. Các dòng tế bào này được nuôi cấy ở 37ºC, 5% CO2, độ ẩm 98% trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính. 2.2.8.2. Phương pháp MTT Độc tính tế bào của gossypol và các đồng phân quang học của nó trên các dòng tế bào ung thư được xác định bằng phương pháp MTT (MTT assay). Phương pháp MTT được tiến hành dựa trên phản ứng khử của MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, một tetrazole) có mầu vàng thành formazan có mầu tím trong ty thể của tế bào sống. Phản ứng khử này chỉ xảy ra chỉ khi các enzyme reductase trong ty thể hoạt động và do đó sự thay đổi này liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống. Khi so sánh lượng formazan mầu tím được tạo thành từ các tế bào đã được xử lý với một chất thử với lượng formazan tạo thành từ các tế bào đối chứng không được xử lý thì có thể suy ra tác động gây chết tế bào của chất thử thông qua việc xây dựng một đường cong phụ thuộc theo liều dùng [48]. Cấy 200 ml dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 với dòng Hep-G2 và MCF-7, môi trường DMEM với các mẫu thử trên dòng LU-1. Các tế bào được nuôi ổn định sau 24 h ở 370C, 5% CO2. Các mẫu thử: gossypol racemic, (+)-gossypol, (-)-gossypol và mẫu đối chứng dương là vincristine được pha trong DMSO. Pha loãng các mẫu thử tạo thành dãy các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy tương ứng. Các dung dịch mẫu thử sau đó được thêm dung dịch tế bào sao cho nồng độ pha loãng cuối cùng đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30 µM với (±)-gossypol và (-)-gossypol; nồng độ đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 60 µM với (+)-gossypol và nồng độ đạt 0,5; 5; 50; 500 nM với vincristine. Mẫu đối chứng không được bổ xung thuốc thử. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các tế bào được ủ ở 370C, 5% CO2. Sau 72 h, môi trường nuôi cấy tế bào được loại bỏ và thêm vào mỗi giếng 50 ml MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh). Sau khi ủ ở 370C trong 4 giờ, dung dịch MTT được loại bỏ và thêm vào mỗi giếng 100 ml DMSO. Lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào được tính theo công thức: % ức chế = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng. Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập gossypol từ hạt bông 3.1.1. Chiết xuất gossypol từ hạt bông Hạt bông Gossypium barbadense L., giống HD139, được nghiền bằng máy xay và rây ở các cỡ lần lượt 1 mm và 0,2 mm để tách phần nhân hạt ra khỏi phần vỏ và xơ bông. Sau quá trình này chúng tôi thu được nhân hạt bông dưới dạng bột mầu trắng xám (độ ẩm 7,9%) với các tuyến chất mầu có thể quan sát được bằng mắt thường. Khối lượng nhân thu được bằng 62,6% tổng khối lượng hạt. 100 g nhân hạt bông HD139 được chiết trong 300 ml ete dầu (nhiệt độ sôi 300C-600C) ở nhiệt độ 60ºC trên bếp cách thủy bằng máy soxhlet cho đến khi dịch chiết ete dầu trở nên không mầu. Điều này đạt được sau khoảng 24 h chiết. Cuối giai đoạn này, bột hạt bông được lấy ra, làm khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết ete dầu được thu hồi để lấy dung môi trên máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40ºC đến tối đa, thu được 23,5 g dầu mầu nâu. Bột nhân hạt bông sau khi đã được chiết loại dầu được tiếp tục chiết bằng 300 ml DEE ở nhiệt độ 40ºC trong 24 h trên máy soxhlet. Dịch chiết DEE được lọc, thu hồi dung môi trên máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng, thu được 2,07 g cao chiết DEE mầu nâu. Cao chiết DEE được định tính sự có mặt của gossypol bằng phương pháp phổ tử ngoại và SKLM. Kết quả cho thấy, phổ tử ngoại của phần cao chiết DEE có hình dạng và cực đại hấp thụ tại 368 nm, phù hợp với hình dạng và cực đại hấp thụ của gossypol đã được công bố trước đó (365 nm) [17]. Mặt khác, kết quả SKLM cao chiết DEE hệ dung môi: n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4 cho 4 vết chính trong đó chỉ 1 vết (Rf=0,67) có mầu đỏ với thuốc thử H2SO4 20% trong EtOH và mầu xanh đậm với thuốc thử là FeCl3. Từ kết quả trên chúng tôi bước đầu khẳng định rằng trong dịch chiết DEE có chứa gossypol với Rf = 0,67 Ete dầu (300C-600C) là một dung môi kém phân cực, do đó được dùng để loại các tạp chất kém phân cực trong nhân hạt bông trong đó chủ yếu là dầu béo đã được xác định là chiếm khoảng từ 13-24% trong nhân hạt bông. Để chứng minh gossypol không bị mất đi trong quá trình loại tạp bằng ete dầu, chúng tôi tiến hành định tính gossypol trong phần dịch chiết ete dầu bằng phổ tử ngoại (đo trong CHCl3). Phổ tử ngoại của dịch chiết ete dầu không thấy đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 365 nm hay ở các bước sóng lân cận (đỉnh đặc trưng cho nhóm -CHO của gossypol). Điều này đã khẳng định tính đúng đắn khi lựa chọn ete dầu để loại tạp chất. Cao DEE sau đó được tách lấy gossypol bằng sắc ký cột hoặc bằng kết tinh. Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế gossypol được trình bày trong hình 3.1. Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất và tinh chế G-AA bằng phương pháp kết tinh 3.1.2. Tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel Từ kết quả định tính gossypol trong cao chiết DEE bằng sắc ký bản mỏng (mục 3.1.1) cho thấy gossypol cho một vết đậm ở Rf = 0,67 và có sự phân tách với vết lân cận Rf = 0,72 do đó chúng tôi nhận thấy có thể tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel để bước đầu xác định cấu trúc và dùng làm chất đối chiếu cho các thử nghiệm về sau. a b Hình 3.2. Sắc ký đồ cao DEE (a) và gossypol tinh sạch Rf = 0,67 (b) phân lập từ hạt bông G. barbadense L. HD139. Bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), hệ dung môi : n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20%. Do gossypol có các nhóm –OH phenol có khả năng tạo thành các liên kết hydro với các nhóm –OH trên chất hấp phụ silica gel gây ra hiện tượng gossypol kéo dài trên cột trong quá trình rửa giải. Để tránh hiện tượng này, dung môi rửa giải đã được thêm vào một lượng nhỏ acetic acid (1%), vừa có tác dụng tránh sự kéo dài của gossypol trên cột, vừa có thể có tác dụng làm bền gossypol. Từ 2,07 g cao chiết DEE của hạt bông HD139 khi tiến hành sắc ký qua cột sillica gel (60 g silica gel), hệ dung môi rửa giải được sử dụng là n-hexan/ethyl acetate/acetic acid với độ phân cực tăng dần: 100/0/1-80/20/1, cuối cùng chúng tôi thu được 0,558 g chất rắn mầu vàng. Sản phẩm được kết tinh dưới dạng G-AA bằng cách hoà tan lại trong 5 ml DEE sau đó thêm 1,7 ml acetic acid băng. Sau 24 h, sản phẩm kết tinh được lọc bằng phễu lọc hút chân không, rửa bằng 3 x 5 ml ete dầu, sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 250C trong 24 h thu được 0,45 g chất rắn mầu vàng là G-AA. Các số liệu về điểm chảy, phổ UV, IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm thu được trùng với các dữ liệu đã công bố của G-AA [21]. Hình 3.3. Phổ tử ngoại của G-AA từ hạt bông G. barbadense L. G-AA có 3 đỉnh hấp thụ cực đại ở 242, 288 và 364 nm (đo trong CHCl3) Điểm chảy: 178-180ºC UV (lmax, CHCl3): 242, 288, 364 nm (Hình 3.3) [α]D = + 140 (c = 0,25; CHCl3) IR (KBr, cm-1): ν = 3514, 3436 (-OH), 2943, 2886 (-COOH), 1708 (C=O), 1615, 1579 (C=C), 1444, 1381, 1339, 1270 (CAr-O), 1171, 1061, 911, 948, 776. (Phụ lục 1) 1H NMR: d = 15,21 (s, 2H, -OH); 11,15 (s, 2H, -CHO); 7,79 (s, 2H, -Ar-H); 6,45 (br s, 2H, -OH); 5,74 (s, 2H, -OH); 3,91 (s, 2H, -CH(CH3)2); 2,16 (s, 6H, -Ar-CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3 acetic acid); 1,56 (d, J = 7Hz, 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 2) 13C NMR: d = 199,4 (-CHO); 175,2; 156,2; 150,4; 143,6; 134,1; 133,7; 129,8; 118,2; 115,7; 114,7; 111,9; 27,9 (-CH(CH3)2); 20,4; 20,3 ppm. (Phụ lục 3) Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của G-AA tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong DEE/acetic acid băng. G-AA cho một pic có thời gian lưu 7,94 phút, diện tích pic S>98% (254 nm). Kết quả phân tích trên HPLC (Hình 3.4, Phụ lục 4) cho thấy sản phẩm G-AA đã phân lập được bằng phương pháp sắc ký cột chỉ cho duy nhất 1 pic có thời gian lưu là 7,9 phút ở bước sóng 254 nm. Cùng với các số liệu về điểm chảy, phổ khối, phổ tử ngoại, NMR, kết quả này đã chứng tỏ sản phẩm G-AA mà chúng tôi đã phân lập được có độ tinh khiết rất cao (theo diện tích pic HPLC ở bước sóng 254 nm). Do đó sản phẩm G-AA này được chúng tôi sử dụng làm chất đối chiếu để định tính, định lượng các sản phẩm gossypol hoặc G-AA sau này. Sản phẩm thu được là hỗn hợp racemic vì có [α]D = + 140 (c 0,25; CHCl3). Tuy nhiên, trên SKLM chỉ có 1 vết duy nhất (Rf = 0,67) và trên HPLC chỉ có 1 píc duy nhất tại t = 7,9 phút. Do đó có thể kết luận rằng rất khó phân tách cũng như định tính hay định lượng các đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hỗn hợp (±)-gossypol bằng các phương pháp SKLM và HPLC một cách trực tiếp. 3.1.3. Tinh chế gossypol bằng phương pháp kết tinh Gossypol dễ dàng bị ôxi hoá trong không khí nên nó thường được chuyển về dạng G-AA bền hơn. Sản phẩm G-AA khá bền, nó đã được chứng minh là vẫn đạt độ tinh khiết trên 98% sau 30 năm bảo quản ở nhiệt độ -60C [22]. G-AA là phức hợp gồm 1 phân tử của gossypol và 1 phân tử acetic acid được liên kết với nhau bởi liên kết hydro. Kết tinh gossypol dưới dạng G-AA cũng là một phương pháp thường được sử dụng khi phân lập gossypol từ hạt bông và một số sản phẩm trong quá trình tinh chế dầu bông [16, 39]. Trong các nghiên cứu trên, G-AA được phân lập bằng phương pháp kết tinh cho hiệu suất và độ tinh khiết cao mà không cần thông qua phương pháp sắc ký. Phương pháp tinh chế gossypol bằng phương pháp sắc ký cột silica gel (Mục 3.1.2) là bước nghiên cứu đầu tiên giúp chúng tôi thu được sản phẩm gossypol tinh khiết, sử dụng làm chất đối chiếu cho các nghiên cứu về sau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu phương pháp kết tinh trực tiếp G-AA từ cao chiết DEE từ hạt bông G. barbadense HD139 nhằm tìm ra được điều kiện tinh chế gossypol đơn giản với hiệu suất cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE đến quá trình kết tinh gossypol dưới dạng G-AA. Để chuẩn bị cho quá trình trên, chúng tôi tiến hành chiết 3 kg bột hạt bông theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.1, thu được 60 g cao DEE. Để đảm bảo sự đồng nhất của mẫu, cao chiết DEE từ 3 kg bột hạt bông được hoà tan trong 3 lít dung môi CHCl3. Dung dịch này sau đó được chia đều thành 30 mẫu có thể tích bằng nhau. Các mẫu sau khi thu hồi CHCl3 đến kiệt dưới áp suất giảm thu được cao chiết với khối lượng 2,0 ±0,1 g/mẫu tương ứng với khối lượng cao chiết từ 100 g bột hạt bông. Các mẫu cao này được sử dụng để nghiên cứu quá trình kết tinh. 3.1.3.1. Khảo sát nhiệt độ kết tinh Chúng tôi tiến hành khảo sát tác động của nhiệt độ đến quá trình kết tinh ở 2 điều kiện: Nhiệt độ phòng (20-25ºC) và 4ºC (trong tủ lạnh). Ban đầu chúng tôi thực hiện kết tinh cao chiết DEE từ 100 g bột nhân hạt bông trong 6 ml DEE, sau đó thêm từ từ 2 ml acetic acid băng (tỷ lệ acetic acid/diethyl ete = 1/3). Hỗn hợp được đặt trong tủ lạnh ở 4ºC hay nhiệt độ phòng (20-25º). Kết quả được trình bày trên bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy khối lượng G-AA thu được ở nhiệt độ thấp 40C cao hơn khi kết tinh ở nhiệt độ phòng nhưng sản phẩm thu được ở 40C lại kém tinh khiết hơn ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Mặt khác, chúng tôi cũng nhận thấy không có khác biệt trong độ tinh khiết của sản phẩm khi kết tinh ở các nhiệt độ khác nhau. Lượng G-AA trung bình thu được cao hơn khi kết tinh ở 4ºC so với ở nhiệt độ phòng nhưng sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh G-AA Thông số 6 ml DEE/2 ml acetic acid băng Nhiệt độ phòng 4ºC Khối lượng G-AA thô (g) 0,50±0,02 0,52±0,02 Độ tinh khiết (%) 78,3±1,5 76,3±1,1 Khối lượng G-AA thực (g) 0,39±0,02 0,40±0,01 Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số Kết tinh trong điều kiện nhiệt độ thấp là phương pháp được các tác giả trước đây sử dụng để tinh chế gossypol [39]. Tuy nhiên, kết quả ở đây cho thấy khi kết tinh trong điều kiện nhiệt độ phòng, hiệu suất kết tinh cũng như độ tinh khiết của sản phẩm không thua kém so với khi kết tinh ở nhiệt độ thấp (4ºC). Khi nghiên cứu quá trình kết tinh G-AA từ soap stock (một phụ phẩm trong quá trình tinh chế dầu bông), Michael Dowd và cộng sự cũng nhận thấy kết tinh ở 4ºC hay 50ºC đều không làm tăng hiệu suất của quá trình kết tinh [16]. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt là khi đưa vào sản xuất ở quy mô lớn. Do đó, các thí nghiệm nghiên cứu kết tinh về sau đều được tiến hành ở nhiệt độ phòng. 3.1.3.2. Khảo sát thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE Để nghiên cứu các yếu tố này, cao DEE được hoà tan lại trong một thể tích nhất định DEE (3, 6 và 9 ml). Sau đó, acetic acid băng được thêm vào dung dịch với tỷ lệ acetic acid băng/DEE = 1/3 và 1/5. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Theo đó, độ tinh khiết của sản phẩm G-AA khi kết tinh trong các điều kiện khác nhau khác biệt không có ý nghĩa (P>0,05). Điều này cho thấy độ tinh sạch của sản phẩm ít chịu ảnh hưởng bởi thể tích DEE và lượng acetic acid thêm vào. Trong khi đó, khối lượng gossypol tuyệt đối thu được lại dao động khá lớn (0,30-0,43 g). Có thể nhận thấy khối lượng G-AA kết tinh được càng nhiều khi nồng độ cao DEE càng đặc, tương ứng với lượng dung môi DEE sử dụng càng ít. Khối lượng sản phẩm G-AA tuyệt đối thu được nhiều nhiều nhất (0,43 g và 0,42 g) khi lượng DEE được sử dụng là ít nhất (3 ml) cho dù lượng acetic acid băng được thêm vào theo tỷ lệ tương ứng là 1/5 hay 1/3. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE đến quá trình kết tinh G-AA AcOH băng/ DEE (v/v) Thông số Thể tích DEE 3 ml 6 ml 9 ml 1/5 Khối lượng G-AA thô (g) 0,57±0,02 0,47±0,02 0,37±0,02 Độ tinh khiết (%) 76,1±1,6 78±2,0 79,2±2,3 Khối lượng G-AA thực (g) 0,43±0,02 0,37±0,02 0,30±0,02 1/3 Khối lượng G-AA thô (g) 0,56 ±0,02 0,50±0,02 0,47±0,03 Độ tinh khiết (%) 75,5±1,5 78,3±1,5 78,3±1,5 Khối lượng G-AA thực (g) 0,42±0,01 0,39±0,02 0,37±0,02 Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số Lượng acetic acid cũng tác động đến khối lượng sản phẩm G-AA kết tinh từ dung dịch theo xu hướng lượng sản phẩm thu được tăng lên khi lượng acetic acid sử dụng nhiều hơn (1/3). Sự khác biệt này thể hiện rõ rệt nhất khi kết tinh trong dung dịch loãng (sử dụng 9 ml DEE, P0,05). Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi đã tìm được kiện kết tinh G-AA từ cao chiết DEE với hiệu xuất cao như sau: cao chiết DEE từ 100 g bột hạt bông (G. barbadense L., HD139) được hòa trong 3 ml DEE, thêm 0,6 ml acetic acid (tương ứng 1/5 thể tích DEE) trong điều kiện nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng. Kết quả này rất có ý nghĩa, đặc biệt là khi nâng quy trình tinh chế gossypol lên quy mô lớn. 3.1.3.3. Kết tinh lại sản phẩm G-AA thô Sản phẩm G-AA thô (sản phẩm kết tinh lần 1) được kết tinh lại nhiều lần để thu được các sản phẩm G-AA tinh khiết. 10 g sản phẩm G-AA thô từ quá trình nghiên cứu kết tinh nêu trên sau khi kết tinh lần 2 thu được 7,1 g (hiệu suất 71%), kết tinh lại lần 3 thu được 6,2 g (hiệu suất 87%), kết tinh lại lần 4 thu được 5,6 g G-AA tinh khiết có mầu vàng sáng (hiệu suất 90%, độ tinh khiết > 98% theo diện tích pic HPLC). Như vây, hiệu suất của cả quá trình tinh chế (3 lần kết tinh lại) từ sản phẩm G-AA thô là 56% . Sản phẩm gossypol acetic acid tinh sạch cho một vết duy nhất có Rf = 0,67 trên SKLM silica gel GF254 với hệ dung môi khai triển n-hexane/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4; có điểm chảy 178-180ºC và phổ UV (lmax, CHCl3): 242, 288, 363 nm phù hợp với