Đề tài Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro và in vivo giống hoa Loa kèn màu mới nhập nội

dựa trên nguyên tắc dùng các tác nhân lý, hoá như: Nhiệt độ thấp, thay đổi thời gian chiếu sáng, bổ sung chất kích thích sinh trưởng (GA3) để cân bằng dịch chuyển về phía tích luỹ nhiều GA3. Năm 1994, bộ môn sinh lý thực vật, Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã thành công với nghiên cứu phá ngủ củ Loa kèn trắng bằng xử lý lạnh kết hợp với phun GA3 đã điều khiển được cây Loa kèn ra hoa trái vụ [5]. 2.3.2. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào (in virto) [10]: 2.3.2.1. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro: Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp mới, hiện đại và đã được áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau trong đó có cây hoa Loa kèn, quy trình nhân giống chung gồm các giai đoạn sau: + Giai đoạn chuẩn bị: Nhằm tạo ra cây giống tốt, bước đầu tiên rất quan trọng là phải chọn cây mẹ khoẻ, sạch bệnh, có đủ những đặc tính mà ta quan tâm. Trên cây mẹ, có thể sử dụng nhiều cơ quan, bộ phận khác nhau làm mô nuôi cấy như: Đỉnh chồi, mắt ngủ, mô lá non, vẩy củ, bao phấn… + Giai đoạn 2: Khử trùng mô nuôi cấy Do mô nuôi cấy đưa từ ngoài vào có chứa rất nhiều vi sinh vật. Vì vậy cần khử trùng mô nuôi cấy trước khi đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo nhằm tạo ra nguyên liệu thực vật vô trùng có tỷ lệ nhiễm vi sinh vật thấp, tỷ lệ mẫu sống sinh trưởng tốt và cao. Giai đoạn này phụ thuộc vào hai nhân tố là thời gian khử trùng và nồng độ chất khử trùng. Các hoá chất thường được sử dụng để khử trùng là HgCl2 0,1% từ 5 đến 10 phút, Ca(OCl)2 5 á 7% từ 15 đến 20 phút, NaClO 1% từ 15 á 20 phút. + Giai đoạn 3: Nuôi cấy khởi động ở giai đoạn này mô nuôi cấy sau khi được khử trùng được chuyển vào môi trường thích hợp về tỷ lệ và hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng để kích thích mẫu cấy hình thành chồi bất định, các phôi vô tính hay kích thích các chồi nách, mắt ngủ bật mầm. + Giai đoạn 4: Nhân nhanh Là giai đoạn quan trọng của quá trình nhân giống in vitro vì giai đoạn này xác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro. Môi trường nuôi cấy nhân tạo có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng thời phải chú ý đảm bảo những điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kỳ... + Giai đoạn 5: Tạo cây hoàn chỉnh Là giai đoạn chuyển những chồi đã hình thành trong giai đoạn nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để hình thành cây có đủ rễ, thân, lá, đủ tiêu chuẩn là cây giống. Môi trường tạo rễ thường bổ xung auxin để kích thích hình thành rễ. + Giai đoạn 6: Đưa cây in vitro ra đất Đây là bước quyết định để đánh giá thực tiễn của quy trình nhân giống in vitro. Nên các loại giá thể trồng cây in vitro phải đảm bảo độ sạch vi khuẩn, xốp và thoáng khí giúp cây con đạt tỷ lệ sống cao. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào có một số ưu điểm đó là có hệ số nhân giống rất cao, nhân nhanh được các giống cây sạch bệnh, đa dạng hoá nguồn gen, đáp ứng được nhu cầu thưởng thức của người tiêu dùng. 2.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống: * Môi trường nuôi cấy: Là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng, phát triển của mô trong nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy bao gồm một số thành phần cơ bản sau: + Các nguyên tố đa lượng: Gồm N, P, K, S, Mg, Ca. Chúng có chức năng là nguyên liệu để xây dựng nên các thành phần cấu trúc của mô tế bào và mô thực vật. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng phải > 30 mg/ l mặc dù tỷ lệ giữa các nguyên tố này có thể biến đổi. + Các nguyên tố khoáng vi lượng: Bao gồm Fe, Bo, Mn, I, Mo, Cu, Zn. Chúng tham gia vào thành phần của các enzim xúc tác cho phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào. Hàm lượng các yếu tố vi lượng thường < 30 mg/ l. + Nguồn cacbon hữu cơ: Trong nuôi cấy mô, cây sinh trưởng, phát triển được nhờ sự kết hợp cả 2 phương thức: Dị dưỡng và tự dưỡng. Chính vì vậy, bổ xung nguồn cacbon hữu cơ vào môi trường là cần thiết. Nguồn cacbon hữu cơ thường sử dụng là đường saccaroza 2 á 3%. + Các vitamin: Các mô tế bào khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợp vitamin nhưng lượng đó không đủ để cung cấp cho hoạt động sống của cây do đó phải bổ xung các vitamin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng thích hợp. Thường bổ xung các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6. + Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật: Là các chất đảm bảo cho việc điều khiển sự phân hoá và phản phân hoá trong nuôi cấy in vitro, thường sử dụng 2 nhóm Auxin và Cytokinin. + Các hợp chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch nghiền của khoai tây, chuối được bổ xung vào môi trường nhằm làm tăng cường thêm các axit amin, vitamin cũng như nhiều yếu tố dinh dưỡng khác. + Agar: Là chất làm đông cứng môi trường tạo điều kiện cho mẫu cấy sinh trưởng, phát triển tốt. + PH môi trường: PH thích hợp cho phần lớn các mô nuôi cấy là 5,5 á 5,8. 2.3.2.3. Cơ sở sinh lý của các biện pháp nhân giống in vitro: Là tính toàn năng của tế bào thực vật thể hiện qua quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Mỗi tế bào của bất kì sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là tính toàn năng của tế bào. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển từ các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Sự phản phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào chuyên hoá trở lại dạng tế bào phôi sinh. Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Tính toàn năng của tế bào được thể hiện qua quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào trong những điều kiện nhất định. Trong môi trường nuôi cấy mô, sự phối hợp hàm lượng và tỷ lệ của các chất điều tiết sinh trưởng thuộc 2 nhóm Auxin và Cytokinin có tác dụng điều chỉnh quá trình phân hoá và phản phân hoá của mô nuôi cấy. 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước: Năm 1969, Gauthret nghiên cứu hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng có vai trò trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào khi nuôi cấy mô hoa Loa kèn. Năm 1980, Van Aartrifk và Blom, đã tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy Loa kèn là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm một nửa sẽ cho khả năng tái sinh chồi cao. Khi nghiên cứu nguồn vật liệu nuôi cấy ban đầu Robb (1957) và Allen (1974) đã chỉ ra bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất với cây Loa kèn là vẩy củ. Khi nuôi cấy vẩy củ đã rút ngắn thời gian tái sinh chồi và tỷ lệ tái sinh chồi luôn cao hơn các bộ phận khác. Năm 1993, Stanilova. M và Zagorska (Bungari) cũng khẳng định vẩy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi từ mô nuôi cấy trên môi trường Skoog có bổ xung 0,5 mg aNAA/ l và 0,1 mg Kinetin/ l, tạo ra các cây giống đồng đều về chất lượng. Năm 1981, Van và Blom đã xác định được vai trò của aNAA trong sự tái sinh chồi. Ngoài ra còn có BA cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của chồi. Năm 2000, J. Suh và J. Lee đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và chất lượng ánh sáng đến sự hình thành củ Loa kèn con và cho thấy ở nhiệt độ 20 á 250C, số lượng, khối lượng và đường kính của củ con tăng hơn so với ở nhiệt độ 300C, số lượng củ con cũng cao hơn khi ở dưới ánh sáng đỏ [15]. Các nghiên cứu về sự xuân hoá củ bằng nhiệt độ thấp cũng được J. Lee, Young A.Kim tiến hành và xác định được thời gian xử lý lạnh từ 4 tuần trở lên ở 50C thì các củ nảy chồi và ra hoa sớm hơn, số lượng hoa cũng tăng lên [16]. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước: ở nước ta hiện nay, những nghiên cứu về nhân giống hoa Loa kèn trắng trong nước hay một số giống Loa kèn màu mới nhập nội chỉ mới tập trung vào biện pháp nhân giống in vitro chứ chưa tập trung đến các biện pháp nhân giống in vivo, vì vậy có rất ít nghiên cứu về biện pháp này. Nhân giống ngoài đồng ruộng in vivo chỉ được nhắc đến như là biện pháp nhân giống cổ truyền trong một số tài liệu giới thiệu về kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa - cây cảnh trong đó có cây hoa Loa kèn [5]. Năm 1993, Mai Xuân Lương và cộng sự đã thăm dò quy trình nhân giống cây hoa Loa kèn trên môi trường đa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như MS, White, Knop cho thấy tốt nhất vẫn là môi trường MS và bổ sung các nguyên tố vi lượng (Theo Heller), vitamin (Theo Morel), 100mg inositol/ l, 20g đường saccaroza và 15g Agar/ l [4]. Năm 1994, Dương Tấn Nhựt đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa Loa kèn bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ. Vẩy củ được khử trùng bằng HgCl2 0,2% trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS có bổ sung các thành phần vitamin, chất hữu cơ và saccaroza. Sau khi tạo được cây con, có thể tiếp tục nhân bằng cách tách các vẩy củ đã được tạo thành đem cấy trên môi trường nhân [6]. Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Phương Thảo đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên giống hoa Loa kèn tím mới nhập nội từ Pháp và đưa ra quy trình nhân giống kể từ khi đưa mẫu vào cho đến khi sản xuất ra củ giống [7]. Năm 2001, Dương Tấn Nhựt và cộng sự nghiên cứu nhân giống hoa Huệ tây sạch bệnh qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi đỉnh của củ Loa kèn, được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút sau đó cấy vào môi trường 1/2 MS. Sau khi tạo được cây hoàn chỉnh có thân chính phân đốt, tiến hành cắt thân chính thành nhiều đốt nhỏ để tiến hành nhân nhanh. Cũng trong năm 2001, Nguyễn Thị Nhẫn và Nguyễn Quang Thạch đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống cây hoa Loa kèn [8]. Phần 3 đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu: + Hai giống Loa kèn màu nhập nội từ Trung Quốc có màu tím - đỏ và màu vàng. + Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu: Vẩy củ loa kèn màu. + Nguyên liệu cho thí nghiệm tạo củ: Cây con được tái sinh từ vật liệu nuôi cấy ban đầu. + Nguyên liệu cho thí nghiệm ngoài vườn: Các cây có đủ số lá và số rễ trung bình trên cây. + Nguyên liệu cho thí nghiệm phá ngủ: Các củ vừa cho thu hoạch hoa. + Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống từ củ mẹ: Những cây đã cho hoa nhưng vẫn tiếp tục trồng để hình thành củ con. + Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống bằng củ con: Những củ con được hình thành từ củ mẹ. Hình 1: Lilium longiflorum x Aziatsche Gr. “Centurion” Hình 2: Lilium Oriental “Sta Gazer” 3.2. Nội dung nghiên cứu: 3.2.1. Nhân giống in vitro: 3.2.1.1. Thí nghiệm khử trùng: Gồm 3 công thức về thời gian khử trùng. CT1: Khử trùng mẫu trong 5 phút bằng HgCl2 0,1%. CT2: Khử trùng mẫu trong 7 phút bằng HgCl2 0,1%. CT3: Khử trùng mẫu trong 10 phút bằng HgCl2 0,1%. 3.2.1.2. Thí nghiệm tái sinh mẫu: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi của vảy củ. + Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của aNAA đến khả năng tái sinh của mô nuôi cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,1 ppm aNAA CT3: MS + 0,3ppm aNAA CT4: MS + 0,5ppm aNAA + Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh của mô nuôi cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,5 ppm BA CT3: MS + 1 ppm BA CT4: MS + 2 ppm BA CT5: MS + 3 ppm BA CT6: MS + 4 ppm BA + Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự tổ hợp BA và aNAA đến khả năng tái sinh của mô nuôi cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,3ppm aNAA + 0,5 ppm BA CT3: MS + 0,3ppm aNAA + 1 ppm BA CT4: MS + 0,3ppm aNAA + 2 ppm BA CT5: MS + 0,3ppm aNAA + 3 ppm BA CT6: MS + 0,3ppm aNAA + 4 ppm BA 3.2.1.3. Thí nghiệm nhân nhanh: + Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sinh trưởng phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 1 ppm BA CT3: MS + 2 ppm BA CT4: MS + 3 ppm BA CT5: MS + 4 ppm BA CT6: MS + 5 ppm BA CT7: MS + 7 ppm BA + Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến sinh trưởng, phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,5ppm K CT3: MS + 1 ppm K CT4: MS + 2 ppm K CT5: MS + 3 ppm K + Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và aNAA đến sinh trưởng, phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy. CT1: MS (ĐC) CT2: MS + 0,3ppm aNAA + 1 ppm BA CT3: MS + 0,3ppm aNAA + 2 ppm BA CT4: MS + 0,3ppm aNAA + 3 ppm BA CT5: MS + 0,3ppm aNAA + 4 ppm BA CT6: MS + 0,3ppm aNAA + 5 ppm BA CT7: MS + 0,3ppm aNAA + 7 ppm BA 3.2.2. Nhân giống in vivo: 3.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sự ngủ nghỉ và khả năng hình thành củ con từ củ mẹ vừa cho thu hoạch: CT1: trồng củ mẹ không qua xử lý lạnh (ĐC) CT2: trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 5 tuần CT3: trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 6 tuần CT4: trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 7 tuần CT5: trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 8 tuần Nhiệt độ xử lý lạnh là 40C. 3.2.2.2. Nghiên cứu khả năng tăng trưởng của củ nhỏ (thu từ củ mẹ khi trồng): - Trồng trong hai loại giá thể: Trấu hun và đất - Gồm 2 CT: CT1: trồng trong điều kiện bình thường (ĐC) CT2: trồng trong điều kiện nhà khí hậu (18 á 220C) 3.3. Phương pháp nghiên cứu: 3.3.1. Cách bố trí thí nghiệm: - Các thí nghiệm trên đều được bố trí 3 lần lặp lại . + Với phần nuôi cấy in vitro: Mỗi lần nhắc lại gồm 3 ống nghiệm. + Với phần nghiên cứu phá ngủ và tạo củ: Mỗi lần nhắc lại trung bình gồm 15 củ. 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi và cách đo đếm: S mẫu sạch * Tỷ lệ mẫu sạch (%) = x 100% S mẫu đưa vào S mẫu sạch tái sinh chồi * Tỷ lệ tái sinh (%) = x 100% S mẫu đưa vào S mẫu nhiễm * Tỷ lệ mẫu nhiễm (khuẩn và nấm) = x 100% S mẫu đưa vào S mẫu chết * Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100% S mẫu đưa vào S chồi tạo thành * Hệ số nhân (lần) = S chồi đưa vào S chiều cao * Chiều cao trung bình (cm) = S số cây theo dõi * Tỷ lệ sống của cây nuôi cấy sau mỗi tuần: Theo dõi tỷ lệ sống của cây nuôi cấy sau mỗi tuần khi đưa ra vườn ươm. * Theo dõi thời gian xuất hiện lá mới của cây con. S số củ con thu được * Tỷ lệ củ con thu được từ củ mẹ (%) = x 100 S số củ mẹ theo dõi S trọng lượng của củ con * Trọng lượng trung bình của củ con (g) = S số củ con * Xác định thời gian xử lý lạnh thích hợp nhất để phá ngủ củ. 3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng chương trình xử lý thống kê irristat. Phần 4 kết quả nghiên cứu và thảo luận 4.1. Nhân giống in vitro: 4.1.1. Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu: 4.1.1.1. ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch thu được: Đây là giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ bên ngoài (Vô số vi sinh vật) vào điều kiện nuôi cấy in vitro (Vô trùng). Vì vậy đối với tất cả các loại mẫu nuôi cấy khác nhau việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân in vitro. Trong quá trình khử trùng, loại chất, nồng độ, thời gian khử trùng đều ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm nấm, khuẩn hay mẫu chết. Nồng độ, thời gian khử trùng lớn quá hay nhỏ quá đều ảnh hưởng đến sự tái sinh mẫu trong quá trình nhân in vitro. Với nguồn mẫu là vẩy củ, chúng tôi chọn HgCl2 là chất khử trùng, chất này có khả năng thấm sâu vào bên trong mẫu cấy. Nồng độ HgCl2 là 0,1% ở 3 ngưỡng thời gian 5 phút, 7 phút và 10 phút, kết quả thu được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu nuôi cấy bằng HgCl2 0,1% (Sau 2 tuần nuôi cấy) tới kết quả khử trùng CT Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) 1 5 51 49 0 2 7 64 28 8 3 10 27 27 46 Hình 3: Hiệu quả của thời gian khử trùng mẫu Kết quả trên cho thấy: + Hiệu quả của HgCl2 phụ thuộc vào thời gian ngâm mẫu. Tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn tỷ lệ nghịch với thời gian ngâm mẫu; Khi tăng thời gian khử trùng từ 5 lên 10 phút, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 49% xuống còn 27%; Ngược lại, tỷ lệ mẫu chết lại tăng từ 0 á 46%. Cho thấy tỷ lệ mẫu sạch thu được không những phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu nhiễm mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu chết. Trong 3 mức thời gian khử trùng, công thức 2 (Thời gian 7 phút) cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 64%. Như vậy, với vẩy củ Loa kèn màu, khi sử dụng HgCl2 0,1% thời gian ngâm mẫu 7 phút là tối ưu nhất. 4.1.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi của mô vẩy củ hoa Loa kèn: Trong giai đoạn này, lần lượt tiến hành nghiên cứu tác dụng của một số loại phytohormon riêng lẻ và kết hợp bổ sung lên mô cấy nhằm mục đích tìm ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình tái sinh các giống nghiên cứu. * Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của aNAA đến sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy. ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ aNAA từ 0,1 á 1ppm, kết qủa được trình bày ở bảng 2. Bảng 2: ảnh hưởng của aNAA đến khả năng tái sinh chồi của vẩy củ Loa kèn (sau 4 tuần) CT aNAA (ppm) Vàng Đỏ % tái sinh Chồi/mẫu % tái sinh Chồi/mẫu 1 (ĐC) 0 33,3 5,7 0,0 0,0 2 0,1 66,7 7,3 13,3 1,5 3 0,3 93,3 9,3 46,7 2,7 4 0,5 93,3 8 73,3 4,7 5 1 100 5,3 80 3,3 Hình 4: ảnh hưởng của aNAA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy (Sau 4 tuần) Nhận xét: + Giống hoa vàng: Có khả năng tái sinh chồi mạnh, ngay ở môi trường MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng, mẫu cấy đã đạt tỷ lệ tái sinh 33,3% và 5,7 chồi/ mẫu. Khả năng tái sinh chồi tăng rõ rệt khi bổ sung aNAA vào môi trường nuôi, tỷ lệ tái sinh tăng từ 66,7 á 100% khi bổ sung aNAA từ 0,1 á 1ppm. Trong đó công thức 3 và 4 (0,3 á 0,5ppm aNAA) cho tỷ lệ tái sinh cao 93,3% nhưng công thức 3 có số chồi/ mẫu nhiều hơn (9,3 chồi/ mẫu). Khi tăng nồng độ aNAA lên 1ppm thì tỷ lệ tái sinh cao hơn đạt 100% nhưng số chồi hình thành ít hơn công thức 3 và 4 (5,3 chồi/ mẫu). Như vậy, khả năng tái sinh chồi ở mẫu cấy giống hoa vàng thích hợp với nồng độ aNAA là 0,3ppm. + Giống hoa đỏ: Có khả năng tái sinh chồi kém hơn giống hoa vàng, ở môi trường MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng mẫu cấy không có khả năng tái sinh chồi (0%). Khả năng tái sinh chồi chỉ xuất hiện khi bổ sung aNAA vào môi trường, tỷ lệ tái sinh tăng từ 13,3% ở công thức 2 đến 80% ở công thức 5. Số chồi hình thành từ các mẫu cấy cũng tăng khi có aNAA, công thức 4 (0,5 ppm NAA) có tỉ lệ tái sinh cao (73,3%), số chồi/ mẫu cao nhất (4,7 chồi/ mẫu) do đó tổng số chồi tạo thành là lớn nhất. Kết quả cho thấy giống hoa đỏ có khả năng tái sinh chồi thấp hơn giống hoa vàng, khi nuôi cấy nhất thiết phải bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường, với aNAA riêng lẻ, nồng độ bổ sung cần cao hơn giống hoa vàng (0,5 ppm). * Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy. ở thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng BA ở các mức nồng độ 0,5 á 4ppm, kết quả được trình bày ở bảng 3. Bảng 3: ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi của vẩy củ Loa kèn (Sau 4 tuần) CT BA (ppm) Vàng Đỏ % tái sinh Chồi/mẫu % tái sinh Chồi/mẫu 1 (ĐC) 0 33,3 5,7 0,0 0,0 2 0,5 80 9 26,7 0,5 3 1 93,3 10,3 46,7 1 4 2 93,3 11 80 2,5 5 3 86,7 11 93,3 4 6 4 86,7 10,5 93,3 1,5 Hình 5: ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh mẫu cấy Kết quả trên cho thấy: + giống hoa vàng: Mẫu cấy có khả năng tái sinh ở tất cả các công thức kể cả ĐC (không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng). Tỷ lệ tái sinh cao nhất đạt được ở công thức 3 và 4 (93,3%) và số chồi hình thành trung bình trên một mẫu cấy ở 2 công thức này cũng khá cao (10,3 á 11 chồi/ mẫu). ở các công thức 5 và 6 tỷ lệ tái sinh đạt 86,7% và có 10,5 á 11 chồi/ mẫu, tuy không chênh lệch đáng kể so với công thức 3 và 4 nhưng chất lượng chồi hình thành ở 2 công thức này có chất lượng kém hơn, lá dài mỏng và yếu, chồi nhỏ. Như vậy mẫu cấy của giống hoa vàng thích hợp với môi trường nuôi cấy có bổ sung 2 ppm BA cho tỷ lệ tái sinh cao, số chồi/ mẫu nhiều và chất lượng chồi tốt. + Giống hoa đỏ: Công thức ĐC không có khả năng tái sinh (0%) nhưng khi bổ sung BA vào môi trường thì tỷ lệ tái sinh tăng và xuất hiện chồi trên mẫu cấy. Ngay ở môi trường có mức BA thấp nhất là 0,5 tỷ lệ tái sinh đã đạt 26,7% cho thấy ý nghĩa quyết định của BA đến tỷ lệ tái sinh chồi. Tỷ lệ tái sinh đạt cao nhất ở công thức 5 và 6 (3 á 4ppm BA) 93,3%, nhưng số chồi/ mẫu của công thức 6 thấp hơn công thức 5 (1,5 chồi/ mẫu so với 4 chồi/ mẫu); Chất lượng chồi ở công thức 5 cũng là tốt nhất, số chồi nhiều, đã hình thành ngay dạng củ mập ở phần chồi, lá to bản. Thí nghiệm đã cho thấy nồng độ BA thích hợp cho sự tái sinh chồi ở mẫu cấy giống hoa đỏ là 3 ppm. * Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của tổ hợp aNAA và BA đến khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy. Khi cố định aNAA ở nồng độ 0,3ppm và thay đổi nồng độ BA từ 0,5 á 4ppm , kết quả được trình bày ở bảng 4. Bảng 4: ảnh hưởng của tổ hợp aNAA và BA đến khả năng tái sinh chồi của vảy củ hoa Loa kèn (Sau 4 tuần) CT Chất điều tiết sinh trưởng (ppm) Vàng Đỏ aNAA BA % tái sinh Chồi/mẫu % tái sinh Chồi/mẫu 1 (ĐC) 0 0 33,3 5,7 0,0 0,0 2 0,3 0,5 93,3 9,3 86,7 3,7 3 0,3 1 93,3 11,5 93,3 8,5 4 0,3 2 93,3 9 93,3 6,7 5 0,3 3 100 8,3 93,3 5 6 0,3 4 100 7,3 100 4,3 Hình 6: ảnh hưởng của tổ hợp aNAA và BA đến khả năng tái sinh mẫu cấy (Sau 4 tuần) Kết quả thí nghiệm cho thấy sự phối hợp của aNAA và BA đã cho tỷ lệ tái sinh và số lượng chồi cao hơn so với sự tác động riêng rẽ của BA hay aNAA. + ở cả 2 giống hoa tỷ lệ tạo chồi đạt từ 93,3 á 100% khi bổ sung aNAA và BA vào môi trường nuôi. Tỷ lệ tái sinh đạt cao nhất (100%) ở công thức 5 và 6 ở giống vàng, công thức 6 ở giống đỏ. Số lượng chồi cũng hình thành nhiều nhất ở công thức 3. + Với giống hoa vàng tuy công thức 5 và 6 có tỷ lệ tạo chồi cao nhất nhưng số lượng chồi lại ít hơn so với công thức 3; Các chồi ở công thức 5 và 6 nhỏ và ngắn, lá dòn, dễ gẫy, chất lượng kém. Chất lượng chồi ở công thức 3 tốt hơn hẳn, đã có dạng củ phình to, lá khá nhiều và to. Như vậy nồng độ tối ưu của tổ hợp aNAA và BA là 0,3ppm aNAA + 1ppm BA đối với giống hoa vàng. + Với giống hoa đỏ, nồng độ NAA và BA thích hợp nhất cũng là 0,3ppm aNAA + 1ppm BA cho tỷ lệ tạo chồi 93,3% và số chồi/ mẫu là 8,5. Trong giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu ban đầu, cả 3 thí nghiệm về khả năng tái sinh mẫu đều cho thấy ý nghĩa quyết định của aNAA và BA đối với sự tái sinh chồi của mẫu cấy ở cả 2 giống dù tác động riêng rẽ hay tổ hợp. Nhưng ở 2 giống khác nhau ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng cũng khác nhau. Dạng chồi hình thành ở 2 giống rất khác nhau, chồi giống hoa vàng nhìn chung nhỏ hơn giống hoa đỏ, ít hình thành ngay dạng củ nhưng số lượng chồi lại nhiều hơn hẳn so với giống hoa đỏ; Chồi giống hoa đỏ mập hơn, đã tạo dạng củ to, lá cũng cứng cáp hơn. Hình 7: Sự tái sinh và hình thành chồi của mẫu cấy giống hoa vàng Hình 8: Sự tái sinh và hình thành chồi của mẫu cấy giống hoa đỏ 4.1.2. Giai đoạn nhân nhanh: ở giai đoạn này chúng tôi sử dụng môi trường dinh dưỡng có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng BA, aNAA, Kinetin ở các ngưỡng nồng độ khác nhau nhằm tìm ra loại chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh, tạo ra số chồi nhiều, có chất lượng chồi tốt trong thời gian nuôi cấy ngắn nhất. Mẫu sử dụng trong giai đoạn này được lấy từ giai đoạn 1 (Giai đoạn tạo nguồn mẫu cấy). * Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sinh trưởng phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy. ở thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng môi trường MS có bổ sung BA từ 1 á 7ppm, kết quả thu được trình bày ở bảng 5. Bảng 5: ảnh hưởng của BA đến tốc độ nhân chồi của Loa kèn màu (sau 6 tuần) CT BA (ppm) Vàng Đỏ Chồi/ bình Hệ số nhân (lần) Chồi/ bình Hệ số nhân (lần) Ban đầu Sau 6 tuần Ban đầu Sau 6 tuần 1 (ĐC) 0 5 6 1,2 5 6 1 2 1 5 11 2,2 5 9 1,8 3 2 5 14,5 2,9 5 14,5 2,9 4 3 5 13,5 2,7 5 12 2,4 5 4 5 12 2,4 5 11 2,2 6 5 5 10 2 5 10 2 7 7 5 9 1,8 5 9 1,8 Hình 9: ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân Kết quả bảng trên cho thấy: + Mẫu cấy giống hoa màu vàng khi đưa vào nuôi cấy ở môi trường dinh dưỡng MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng (BA) vẫn có khả năng sinh trưởng phát triển và nhân chồi nhưng hệ số nhân ở môi trường này thấp, chỉ đạt 1,2 lần sau 6 tuần. Với giống hoa màu đỏ, mẫu cấy trong môi trường MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng không tạo chồi được mà chỉ tiếp tục phát triển. + Khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy đã cho thấy hệ số nhân tăng lên rất rõ rệt. ở công thức 3 (2 ppm BA) cho hệ số nhân cao nhất 2,9 lần với cả 2 giống hoa vàng và đỏ. + Nếu tăng nồng độ BA lên 4 và 5 ppm hệ số nhân đã giảm đi chỉ còn 1,8 lần, đồng thời nồng độ BA cao cũng đã làm giảm chất lượng chồi, lá mọng nước, dễ gẫy, chồi nhỏ. Qua thí nghiệm này, chúng tôi rút ra được nồng độ tối ưu khi bổ sung BA riêng rẽ cho môi trường nhân nhanh là 2 ppm BA cho cả 2 giống Loa kèn màu. *Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến sự sinh trưởng phát triển của mẫu cấy. Kinetin là một Cytokinin có khả năng kích thích tạo chồi mạnh và thường được sử dụng trong nhân giống in vitro. Thay đổi nồng độ Kinetin từ 0,5 á 3ppm, kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 6. Bảng 6: ảnh hưởng của Kinetin đến sinh trưởng phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy (Sau 6 tuần) CT Kinetin (ppm) Vàng Đỏ Chồi/bình Hệ số nhân (lần) Chồi/bình Hệ số nhân (lần) Ban đầu Sau 6 tuần Ban đầu Sau 6 tuần 1 (ĐC) 0 5 6 1,2 5 6 1,2 2 0,5 5 7,5 1,5 5 7 1,4 3 1 5 8 1,6 5 7,5 1,5 4 2 5 9,5 1,9 5 8,5 1,7 5 3 5 8 1,6 5 8,5 1,7 ảnh Hình 10: ảnh hưởng của Kinetin đến h