Đề tài Nghiên cứu quá trình lên men Lactic từ mật rỉ đường

rong phẫu thuật chỉnh hình Trong phẫu thuật chỉnh hình, ngƣời ta thƣờng sử dụng loại vật liệu có tên là purasorb. Purasorb là một hợp chất cao phân tử đƣợc sản xuất từ acid lactic. Thành phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, polylactides, polyglycolide, lactide/glycolide copolyme. Purasorb đƣợc sử dụng nhƣ những định ghim, gắn phần xƣơng lại với nhau; khi xƣơng định hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy [9]. Một loại thanh dẫn có thể mang 20 lớp thuốc khác nhau vừa đƣợc các chuyên gia Singapore sáng chế. Đây là loại thanh dẫn tự tiêu đầu tiên trên thế giới giúp ngƣời bệnh tim mau chóng bình phục đồng thời giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng và phát bệnh trở lại. Các nhà phát minh thuộc Đại học Công nghệ Nanyang cho rằng, với loại thanh dẫn này, bác sĩ có thể kết hợp nhiều loại thuốc phù hợp với từng loại bệnh trạng của từng ngƣời để tăng hiệu quả điều trị. Khi đƣợc đƣa vào cơ thể, thanh dẫn sẽ nhả thuốc vào từng thời điểm khác nhau kéo dài trong nhiều tháng. Khi hết thuốc nó sẽ tự hủy hoàn toàn. Thanh dẫn đƣợc chế tạo bằng PLA và PLGA, khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành acid lactic và có thể hấp thụ vào máu. Không chỉ đƣợc sử dụng trong động mạch vành tim, loại thanh dẫn tự hủy này có thể đƣợc cấy trong não, phôi, đƣờng niệu hoặc bất kì cơ quan nào bị nghẽn mạch máu. Đƣợc biết, các loại thanh dẫn hiện nay đều làm bằng kim loại và chỉ mang đƣợc một loại thuốc duy nhất, có thể gây tụ huyết khối và làm mạch máu tắc nghẽn trở lại [26]. - Ứng dụng acid lactic trong nha khoa [9], [22] Trong nha khoa có hai chế phẩm đƣợc sử dụng nhiều đó là Puramex và puracal. Puramex bao gồm các thành phần sau: amulinium lactat, Fe-lactat (đƣợc sử dụng để điều trị thiếu máu), Mg-lactat, Mn-lactat, Zn-lactat còn puracal chỉ có lactat canxi. Các chế phẩm này thƣờng làm răng khỏe hơn. - Ứng dụng để sản xuất vật liệu sinh học (Biomaterials) Các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic. Các copolyme này có tính năng rất giống những bộ khung xƣơng động vật. Hƣớng này đang đƣợc nghiên cứu và ngƣời ta hy vọng trong tƣơng lai nó sẽ đƣợc ứng dụng nhiều. - Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi Ngƣời ta thƣờng bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dƣỡng, bánh ngọt, bánh nƣớng để tăng lƣợng canxi cho cơ thể [9]. Thiếu calci lại ảnh hƣởng đến 19 hoạt động của cơ tim, tới sự tạo huyết và đông máu, là nguyên nhân của bệnh còi xƣơng ở trẻ em và giòn xƣơng xốp xƣơng ở ngƣời già [27]. 2.5.3. Trong môi trường Các phòng thí nghiệm đang nghiên cứu loại chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo củ khó phân hủy. Chất dẻo mới này là một loại polyme đƣợc gọi là poly acid lactic (PLA). Đó là sản phẩm tạo ra từ phản ứng trùng hợp acid lactic. Ngƣời ta hy vọng trong tƣơng lai nó sẽ thay thế chất dẻo đƣợc sản xuất từ dầu mỏ vì tính chất dễ phân hủy của nó có ý nghĩa rất lớn trong bảo vệ môi trƣờng [9]. 2.5.4. Trong mỹ phẩm [9][22] Các loại lactat kim loại (chẳng hạng nhƣ lactat natri) đƣợc sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da nhƣ punosal và của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [9]. 2.6. Sản xuất acid lactic 2.6.1. Mật rỉ đường [1], [8], [12] Là phế liệu chứa nhiều đƣờng không kết tinh trong sản xuất đƣờng từ mía hoặc củ cải đƣờng. Thông thƣờng tỉ lệ rỉ đƣờng trong sản xuất đƣờng mía chiếm khoảng 3 – 5 % trọng lƣợng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất đƣờng.v.v. Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: Nƣớc chiếm 15 – 20 %; chất khô chiếm 80 – 85 %. Trong chất khô có 60 % là đƣờng (40 % là đƣờng saccharose và 20 % là fructose và glucose) và 40 % chất khô còn lại là chất không phải là đƣờng (phi đƣờng). Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30 – 32 % hợp chất hữu cơ và 6 – 10 % hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có K2O: 3,5 %; Fe2O3: 0,2 %; MgO: 0,1 %; sulfat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; SiO2: 0,5 %; P2O5: 0,5 %; Clorit: 0,4 %. Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leuxin, isoleuxin [2]. Ngoài ra trong rỉ đƣờng có một số vitamin (tính theo μ/g mật rỉ đƣờng ) nhƣ sau: 20 Bảng 2.5 Thành phần vitamin trong rỉ đƣờng Các vitamin Số lƣợng (μg/g) Thiamin Riboflavin Acid nicotinic Acid folic Pyridoxin Biotin Acid pantotenic 8,3 2,5 21,0 0,038 6,5 12,0 21,4 2.6.2. Qui trình sản xuất acid lactic [14] Acid lactic tinh thể Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch acid lactic Vi khuẩn CaCO3 H2SO4 Kết tinh Cô đặc 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005 3.1.2. Địa điểm Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu - Chế phẩm Biolactyl của Pháp - Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc - Đại mạch của trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH, máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nƣớc và bếp điện. - Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống nghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman. 3.2.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trƣờng MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36] - Môi trƣờng MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) - Môi trƣờng YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] - Môi trƣờng thử khả năng lên men đƣờng [11] - Môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng - Môi trƣờng thử khả năng phân giải gelatin - Môi trƣờng thạch bán lỏng di động - Môi trƣờng thử khả năng sinh indol Thành phần và tỉ lệ môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày ở mục 1 phần phụ lục. 22 3.2.5.Thuốc nhuộm và thuốc thử - Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] - Thuốc nhuộm Gram [11] - Thuốc thử uphenmen [11] - Thuốc thử DNS [10] - Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử đƣợc trình bày ở mục 2 phần phụ lục. 3.3. Phương pháp thí nghiệm 3.3.1. Phân lập và sơ chọn giống 3.3.1.1. Quan sát đại thể - Môi trƣờng MRS agar và YGC agar + Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc. Giống phân lập trên môi trƣờng YGC agar, CaCO3 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh khuẩn lạc. + Thực hiện * Pha loãng mẫu trong nƣớc cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau. * Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trƣờng MRS agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ. * Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trƣờng YGC agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. - Môi trƣờng MRS broth Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trƣởng trong 24 giờ. 3.3.1.2. Quan sát vi thể Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ở mục 3.2 phần phụ lục). 3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31] - Thực hiện + Cấy vi khuẩn đã phân lập đƣợc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C trong 24 giờ. + Li tâm thu dịch trong. 23 + Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi màu. Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng: + Ống 1: 5 ml môi trƣờng MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. + Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. 3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11] - Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên men có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein. - Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục) 3.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 3.3.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng - Ảnh hƣởng pH Điều chỉnh pH môi trƣờng bằng CH3COOH và NaOH sao cho pH ban đầu là : 4, 5, 6, 7 (pH sau khi khử trùng ). Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % cao nấm men). Nuôi cấy ở 37o C. Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng với các độ pH khác nhau. Chọn pH thích hợp cho sự tích lũy acid của các khuẩn lạc. - Ảnh hƣởng nhiệt độ Sau khi chọn đƣợc pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37o C, 45 o C, 50 o C. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dich nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ mật rỉ Chọn đƣợc pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ nhƣ trên và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ giống Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ. Khảo sát tỉ lệ giống: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy tỉ lệ giống nhƣ trên cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng thời gian Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời 24 điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. 3.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa - Thử phản ứng catalase - Kiểm tra khả năng sinh indol - Xem khả năng di động - Khả năng khử nitrate - Khả năng phân giải gelatin - Khả năng đông vón sữa - Khả năng lên men nguồn carbohydrate Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục) 3.3.5. So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D - Môi trƣờng cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. - Môi trƣờng cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. - Môi trƣờng sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. 3.3.6. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 3.3.6.1. Định lượng đường khử [10] + Nguyên tắc: Có một vài tác nhân đƣợc sử dụng để định lƣợng đƣờng nhờ các đặc tính khử của đƣờng. 3,5 - dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino - 5 - nitrosalicylic có màu đỏ cam. + Thực hiện: (xem mục 3.3 phần phụ lục) 3.3.6.2. Định lượng vi sinh vật [16] - Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Cách tiến hành: (xem mục 3.4 phần phụ lục) - Thiết lập mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm của dịch huyền phù tế bào. 25 + Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Nhƣ vậy, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lƣợng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy. + Tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ đƣợc suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo ở bƣớc sóng 610 nm. + Thực hiện * Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu đƣợc dịch huyền phù có các giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. * Đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng ứng với 5 giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. * Dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x). 3.3.6.3. Qui trình sản xuất Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch H2SO4 Vi khuẩn CaCO3 H2SO4 Dung dịch acid lactic Than hoạt tính 26 - Chuẩn bị môi trƣờng lên men Trƣớc tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H2SO4 vào với tỉ lệ 3,5 ml H2SO4 trong 1000 ml mật rỉ. Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu đƣợc phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5 % cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ƣu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic). - Giai đoạn lên men + Chuẩn bị giống để lên men * Giống cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. * Giống cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. * Giống sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. + Cho 10 % giống sản xuất vào môi trƣờng chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ƣu trong thời gian 7 ngày. - Giai đoạn tạo lactat canxi Trong thời gian lên men, lƣợng acid tạo ra liên tục nên ta phải trung hòa bằng CaCO3 để cho pH ổn định cho khuẩn lạc đó. Sau khi kết thúc quá trình lên men, loại bỏ dịch trên, thu đƣợc phần lactat canxi. Đem trung hòa lƣợng lactat canxi bằng H2SO4 , thu đƣợc phần dịch, đem lọc bằng than hoạt tính thu đƣợc dung dịch acid lactic. 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và sơ chọn giống 4.1.1. Quan sát đại thể 4.1.1.1. Môi trường MRS agar và YGC agar Từ các nguồn: Biolactyl, Antibio, Đại mạch, quá trình phân lập và làm thuần đƣợc 3 dạng khuẩn lạc sinh acid. Ký hiệu A, B, D. Khuẩn lạc A phân lập từ Antibio, khuẩn lạc B từ Biolactyl và khuẩn lạc D từ Đại mạch. Các khuẩn lạc trên đƣợc phân biệt dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích thƣớc của khuẩn lạc. - Trên môi trƣờng MRS agar + Khuẩn lạc A: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: màu trắng sữa, bóng ƣớt, bề mặt phẳng, hơi nhô lên, đƣờng kính khuẩn lạc 1,1 mm. Hình 4. 1: Hình dạng khuẩn lạc A + Khuẩn lạc B: Đƣợc ủ 48 giờ ở 50o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, láng bóng, vun tròn và mép khuẩn lạc có bề phẳng và nhẵn bóng, đƣờng kính khuẩn lạc 1,4 mm. Hình 4. 2: Hình dạng khuẩn lạc B 28 + Khuẩn lạc D: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, màu trắng sữa, bóng ƣớt, đƣờng kính khuẩn lạc 0,5 mm. Hình 4. 3: Hình dạng khuẩn lạc D - Trên môi trƣờng YGC agar Khả năng tạo acid làm tan CaCO3 của 3 khuẩn lạc nhƣ sau: Hình 4. 4: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc A Hình 4. 5: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc B Hình 4. 6: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc D 29 Từ hình 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vòng trong suốt rộng nhất, kế đến khuẩn lạc D, cuối cùng khuẩn lạc B. Do khuẩn lạc A, B và D có khả năng chuyển hóa đƣờng thành acid nên phân giải CaCO3 trong môi trƣờng tạo nên vòng trong suốt. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. 4.1.1.2. Môi trường MRS broth Sau khi nuôi vi khuẩn trên môi trƣờng MRS dịch thể chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 7: Khả năng phát triển trong môi trƣờng MRS dịch thể của các khuẩn lạc A, B và D. Từ hình 4.7 chúng tôi thấy: Khuẩn lạc A: Làm đục môi trƣờng, lắng nhiều sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc B: Làm đục môi trƣờng, lắng ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc D: Làm đục môi trƣờng, lắng rất ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Do khuẩn lạc A thích nghi nhanh trên môi trƣờng MRS, phát triển tốt cho nên tạo sinh khối nhiều hơn khuẩn lạc B và D. 4.1.2. Quan sát vi thể Sau khi tiến hành nhuộm Gram của các khuẩn lạc A, B và D chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 8: Nhuộm Gram của khuẩn lạc A, xem ở vật kính x 100 30 + Khuẩn lạc B: Tế bào hình que, tạo chuỗi dài, Gram dƣơng, không sinh bào tử Hình 4. 9: Nhuộm Gram của khuẩn lạc B, xem ở vật kính x 100 + Khuẩn lạc D: Tế bào hình cầu, đơn hoặc đôi, Gram dƣơng, không sinh bào tử. Hình 4. 10: Nhuộm Gram của khuẩn lạc D, xem ở vật kính x 100 4.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic Sau khi tiến hành định tính acid lactic bằng thuốc thử uphenmen chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Hình 4. 11: Khả năng sinh acid lactic, làm đổi màu thuốc thử uphenmen Từ hình 4.11 chúng tôi thấy màu của khuẩn lạc A, B và D giống với màu của acid lactic tinh khiết, khác với màu của môi trƣờng là do cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng tạo acid lactic, khi kết hợp với thuốc thử uphenmen thì chuyển từ màu xanh dƣơng đậm sang vàng. 31 4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 4.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng Sau khi khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống, thời gian. Chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: 4.3.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự tạo acid tổng Bảng 4. 1: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 1,53 5 37 10 10 24 2,88 6 37 10 10 24 10,17 7 37 10 10 24 9,36 Qua bảng 4.1 chúng tôi thấy khuẩn lạc A tạo acid tổng nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn tối ƣu cho khuẩn lạc A. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 45 10 10 24 1,08 5 45 10 10 24 1,98 6 45 10 10 24 7,65 7 45 10 10 24 5,67 Qua bảng 4.2 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc B. Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 2,25 5 37 10 10 24 13,59 6 37 10 10 24 12,51 7 37 10 10 24 9,45 32 Từ bảng 4.3 chúng tôi thấy ở pH = 5 lƣợng acid tổng nhiều nhất nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc D pH = 5. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 Biểu đồ 4.1Ảnh hƣởng pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc: A, B và D 4.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 6 10 10 24 7,29 37 6 10 10 24 14,04 45 6 10 10 24 9,36 50 6 10 10 24 1,37 Qua bảng 4.4 lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc A: 37o C. Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 6 10 10 24 2,07 37 6 10 10 24 4,59 45 6 10 10 24 7,83 50 6 10 10 24 6,3 33 Từ bảng 4.5 chúng tôi thấy ở nhiệt độ 45o C thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc B: nhiệt độ 45o C. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 5 10 10 24 9,72 37 5 10 10 24 14,13 45 5 10 10 24 1,08 50 5 10 10 24 0,81 Từ bảng 4.6 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc D. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng A ci d tổ ng (g /l) Độ phòng 37 độ C 45 độ C 50 độ C Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc A, B và D 4.3.1.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ (o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 %mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 7,11 10 %mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 16,65 15 %mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 14,22 20 %mât rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 11,16 34 Qua bảng 4.7 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ mật rỉ 10 % nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc A. Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 4,23 10 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 6,84 15 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 3,15 20 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 2,52 Qua bảng 4.8 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ mật rỉ 10 % nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc B. Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 7,47 10 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 12,6 15 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 9,72 20 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 8,64 Qua bảng 4.9 chúng tôi thấy ở tỉ lệ mật rỉ 10 % thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men cho khuẩn lạc D. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) Mật rỉ 5 % Mật rỉ 10 % Mật rỉ 15 % Mật rỉ 20 % Biểu đồ 4.3 Ảnh hƣởng mật rỉ lên sự tạo acid tổng từ các khuẩn lạc A, B và D 35 4.3.1.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng Bảng 4.10: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 6 37 10 24 9,45 10 6 37 10 24 13,23 15 6 37 10 24 14,76 20 6 37 10 24 14,94 Qua bảng 4.10 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ giống 20 %. Tuy nhiên, với lƣợng giống nhiều sẽ tốn kém cho nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc A Bảng 4.11: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 6 45 10 24 3,69 10 6 45 10 24 6,57 15 6 45 10 24 7,38 20 6 45 10 24 7,47 Qua bảng 4.11 chúng tôi thấy ở tỉ lệ giống 20 % lƣợng acid tổng nhiều nhất. Tuy nhiên, về kinh tế chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men. Bảng 4.12: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 5 37 10 24 8,01 10 5 37 10 24 14,13 15 5 37 10 24 16,02 20 5 37 10 24 16,29 36 Qua bảng 4.12 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ giống 20 %. Tuy nhiên, về kinh tế thì tốn kém nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng A ci d tổ ng (g /l) Giống 5 % Giống 10 % Giống 15 % Giống 20 % Biểu đồ 4.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc A, B và D 4.3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian lên sự tạo acid tổng Bảng 4.13: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 6 37 10 10 1,62 24 6 37 10 10 13,14 36 6 37 10 10 14,58 48 6 37 10 10 14,85 Qua bảng 4.13 chúng tôi thấy khuẩn lạc A ở 12 giờ acid tổng tạo thành ít, tạo acid tổng mạnh ở thời gian 24 giờ. Ở thời gian 36 giờ và