Đề tài Nghiên cứu quá trình lên men nước uống giải khát từ bánh mỳ hương trái cây

ong đó. Nhân tế bào nấm men là nhân thật, có sự phân hóa, có kết cấu hoàn chỉnh và ổn định, có khả năng biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là sự phân chia tế bào theo hình thức giản phân. Những thành phần, cơ quan con khác: không bào, ty thể, lạp thể, riboxom Nấm men sinh sản bằng 3 hình thức chính, đó là sinh sản bằng cách nảy chồi; sinh sản bằng cách phân đôi; sinh sản bằng bào tử và hình thành bào tử. Thành phần hóa học của tế bào nấm men (bảng 1.3) thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm: nước chiếm 75-85 %, chất khô chiếm 15-25 % (trong đó chất khoáng chiếm 2-14 % hàm lượng chất khô). Ngoài ra các chất khoáng cũng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men như là phospho, lưu huỳnh, magie, sắt, kali và mangan. Phospho có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình len men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn. Lưu huỳnh tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme. Magie, mangan tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. Sắt tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. Kali chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic. Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản là: thẩm thấu bị động và hấp thu chủ động. Trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này. Đây là con đường thẩm thấu bị động Hấp thu chủ động khi các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa. Permaza là một protid hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và permaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp. Nấm men cũng như các vi sinh vật khác cần oxy, hydro, cacbon, nito, phospho, kali, magie ... để sinh trưởng và phát triển. Nguồn cacbon cung cấp là các loại đường 13 khác nhau như: saccharose, maltose, lactosem glucose ... Oxy, hydro được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch. Nấm men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nito ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, ure. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat ... 1.3.2. Ứng dụng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong lên men [3] 1.3.2.1. Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí (kị khí) và lên men hiếu khí. Lên men cồn là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO2. Quá trình này được chia làm hai thời kì chính đó là thời kỳ phát triển sinh khối và thời kỳ lên men chuyển đường thành cồn và CO2. Thời kỳ phát triển sinh khối với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước đồng thời phát triển sinh khối. Thời kỳ lên men chuyển đường thành cồn và CO2 nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành cồn và CO2. Cơ chế của quá trình lên men được thể hiện ở hình 1.5. ADP ATP Glucose Pyruvic NAD+ NDAH Ethanol Acetaldehyde Hình 1.5. Cơ chế lên men ethanol của tế bào nấm men. 1.3.2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Trong sản xuất, ngoài việc lựa chọn chủng nấm men người ta còn phải nghiên cứu các điều kiện phù hợp nhất để đạt hiệu suất lên men cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men gồm: oxy, nồng độ đường, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ rượu và CO2, số lượng tế bào nấm men. 14 Oxy là thành phần quan trọng trong giai đoạn phát triển sinh khối của tế bào nấm men. Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng sản phẩm trong công đoạn tiếp theo. Lên men etanol là một quá trình lên men yếm khí, nhưng lên men trong giai đoạn đầu cần phải cung cấp oxy cho dịch lên men để nấm men sinh trưởng và phát triển (tăng sinh khối). Nhưng oxy chỉ cần thiết ở giai đoạn đầu, khi dịch lên men đã đạt đủ số lượng tế bào nấm men, thì ngăn chặn dịch lên men tiếp xúc với oxy để nấm men tiến hành quá trình lên men chuyển hóa đường thành cồn và CO2. Nấm men chỉ có khả năng lên men các đường đơn giản đặc biệt là maltose và saccharose. Trong dịch lên men ngoài đường, phải bổ sung thêm một số thức ăn cần thiết cho nấm men như các muối amon, các muối photphat và đạm như ure. Nồng độ đường thích hợp từ 18-22 %, nếu cao hơn thì khả năng lên men giảm và ngược lại nếu nồng độ đường thấp sẽ không tạo điều kiện cho quá trình lên men. Thường thì nồng độ đường nằm ở khoảng 30-35 % thì lên men bị đình chỉ. Nhiệt độ có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt động sống của nấm men, cụ thể là nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng ta sử dụng trong quá trình lên men nước uống. Lên men nước trái cây tối ưu ở nhiệt độ 28-30 oC, ở nhiệt độ 50 oC trở lên và dưới 0 oC thì nấm men không hoạt động. Trong thực tế người ta có thể lên men ở nhiệt độ trong khoảng 4-28 oC tùy theo mục đích sản phẩm cuối cùng. pH có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men nước trái cây. Nấm men có thể phát triển trong môi trường pH từ 2-8 nhưng tối ưu ở pH 4-4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi thấp hơn mức pH này thì chỉ có nấm men mới có thể phát triển được. Vì thế trong quá trình lên men thì nên điều chỉnh pH < 4,5. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men một loại axit không gây ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men. Thực tế người ta sử dụng axit citric và NaHCO3 để điều chỉnh pH. Cồn và CO2 có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và khả năng lên men của nấm men. Sự sinh trưởng của nấm men bị kìm hãm khi nồng độ cồn trong môi trường lên men là 1 %, từ 4-6 % có ảnh hưởng xấu. Đa số nấm men sinh trưởng được ở môi trường có nồng độ cồn là 12-14 %, chỉ có một số ít lên men được ở nồng độ cồn cao từ 17-20 %. Khí CO2 ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO2 sẽ làm cho môi trường lên men luôn chuyển động, kéo dài trạng thái lơ lửng của tế bào nấm men nên có thể làm tăng quá trình lên men. Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra hiệu quả và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tốt. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm. Sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì 15 môi trường dịch lên men không đủ dinh dưỡng cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ dần chết và làm cho sản phẩm có mùi lạ, đồng thời cũng làm phí một lượng nấm men đáng kể. Vì vậy, khảo sát những yếu tố trên để đưa ra tham số thích hợp cho quá trình sản xuất nước uống lên men là rất quan trọng. 1.3.2.3. Ứng dụng Saccharomyces cerevisiae trong lên men sản xuất sản phẩm thực phẩm Quá trình lên men ethanol được xúc tác bởi phức hợp enzyme của tế bào nấm men. Để xúc tác cho quá trình này cần có sự tham gia của 12 enzyme, 02 coenzyme, hai phức hữu cơ và hai phức vô cơ. Zimase là một trong những enzyme quan trọng nhất của nấm men, dưới tác dụng của nó hexose được chuyển thành rượu ethanol và carbon dioxide. Trong tế bào nấm men, còn tồn tại những enzyme không tham gia vào quá trình lên men và hô hấp. Trong số đó có các enzyme nội bào - endoenzyme (maltase, oxidase, isomerase, dehydrogenase, v.v.) và ngoại bào - exoenzyme (amylase, esterase, v.v.). Một trong những nhóm enzyme quan trọng của tế bào nấm men là enzyme thủy phân protein. Hệ enzyme oxy hóa khử của nấm men là cytochromes, theo cấu trúc gọi là porphyrin. Cytochromes có vai trò vận chuyển electron từ dehydrogenase đến oxy. Trong những năm gần đây, các nhà sản xuất thường sử dụng chủng nấm men kỵ khí tuỳ tiện Saccharomyces cerevisiae, chúng có khả năng lên men glucose, sucrose, maltose, raffinose. Các tế bào nấm men sau khi nuôi cấy trong 24 giờ ở nhiệt độ 25-30 °C trong dịch chiết bánh mỳ có kích thước 6,5-7,5 x 5-7 µm. Khi các nấm men này được sử dụng cùng với vi khuẩn lactic, có tới 0,04 % ethyl acetate tích tụ trong môi trường lên men giúp cải thiện mùi thơm và hương vị của nước uống lên men thành phẩm. Ethyl acetate và diacetyl khi được sử dụng trong sản xuất nước uống lên men từ bánh mỳ làm tốc độ lên men tạo thành rượu thấp hơn đáng kể so với trong quá trình lên men làm bánh mỳ, vì men rượu có khả năng thích nghi cao hơn với dịch chiết bánh mỳ. Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm trong dịch lên men. Ở nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho sản phẩm có mùi vị đặc trưng riêng biệt. Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. Ngoài ra Saccharomyces cerevisiae còn được sử dụng phổ biến ở các dòng sản phẩm lên men khác như: lên men bánh mì, sản xuất bia, sản xuất rượu vang và sampanh. Sự tự phân hủy của nấm men dẫn đến sự tích tụ các sản phẩm thơm trong nước uống lên men acetaldehyde, este và các loại khác. Ưu điểm của việc sử dụng nấm men là khả năng tích lũy tới 0,04 % ethyl acetate trong môi trường lên men, giúp cải thiện hương vị và mùi thơm của thức uống, cũng như tăng tính ổn định của nước giải khát trong suốt quá trình bảo quản. 16 Trong quy trình sản xuất bánh mì, nấm men đóng vai trò quyết định đến chất lượng bánh mì. S. cerevisiae chuyển hóa đường trong bột mì thành cồn và CO2. CO2 là tác nhân làm nở bánh mì, CO2 tạo thành được giữ trong các mạng gluten của bột mì. Đây là nguyên nhân làm bánh mì nở và có độ xốp. Bia là một loại thức uống giải khát phổ biến hiện nay, có độ cồn nhẹ từ 4-5 %, có vị đắng dễ chịu của hoa hublon. Người ta sử dụng S. cerevisiae dạng biến chủng để lên men bia. Quá trình lên men gồm lên men chính và lên men phụ. Lên men chính được thực hiện ở nhiệt độ cao, dịch đường ban đầu thường có nồng độ từ 9-12 %, sau lên men thì còn khoảng 2-3 %. Giai đoạn lên men phụ được thực hiện ở 0-5 oC. Ở nhiệt độ lạnh CO2 được giữ lại làm cho bia trong hơn. Rượu vang theo nghĩa hẹp là từ dùng chỉ rượu được lên men từ dịch ép của trái nho, nhưng ngày nay rượu được lên men từ các dịch quả như táo, dâu, mận... cũng được gọi là rượu vang kèm tên của dịch trái cây. Quá trình lên men rượu vang gồm lên men chính và lên men thứ cấp. Giai đoạn lên men chính là dùng dịch ép quả để lên men thành rượu, độ cồn từ 12-15 %, sau đó chuyển sang giai đoạn ủ làm cho protein, pectin, tanin lắng xuống làm rượu vang trong hơn. Giai đoạn lên men thứ cấp (giai đoạn ủ) thường từ 3-4 tháng đối với rượu vang, đối với sampanh thường ủ hàng năm. Trong giai đoạn này sẽ tích tụ chất thơm và CO2. Ngoài những ứng dụng trong sản phẩm truyền thống trên, sản xuất nước uống lên men từ ngũ cốc có sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae là một trong những xu hướng được quan tâm. Nước uống lên men bánh mỳ truyền thống là sản phẩm của quá trình lên men rượu được thực hiện bởi nấm men. Quá trình lên men rượu là do hoạt động của nấm men, kèm theo đó là sự giải phóng CO2 và sự tích tụ một lượng nhỏ rượu. Trong quá trình lên men, hình thành mùi thơm và hương vị đặc trưng, kèm theo CO2 tích tụ trong dịch chiết. Đối với quá trình lên men nước uống từ bánh mỳ, có nhiều loại chủng nấm men khác nhau được sử dụng, tuy nhiên đối với mỗi chủng cần có những yêu cầu nghiêm ngặt như: nấm men phải có hiệu suất lên men cao, khả năng tự phân hủy, khả năng keo tụ tốt và đảm bảo sản phẩm đồ uống tạo thành với hương vị dễ chịu. Để lên men đồ uống từ bánh mỳ, nấm men đưa vào sản xuất cần sử dụng loại nấm men khô và thuần chủng. 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Để xây dựng quy trình lên men nước giải khát từ bánh mỳ trái cây trong khuôn khổ của đề tài sử dụng những nguyên liệu sau: - Bánh mỳ đen được mua ở siêu thị Lotte; - Chanh dây tươi Đà Lạt được ép lọc lấy dịch; - Nấm men khô Saccharomyces cerevisiae của thương hiệu Mauripan Việt Nam; - Đường vàng khoáng chất thương hiệu Biên Hoà. 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Viện Kỹ thuật & Kinh tế biển Trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu và Phòng thí nghiệm Trường Cao đẳng Kỹ thuật Công nghệ, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu từ tháng 03/2018-06/2019 2.3. Bố trí thí nghiệm Để khảo sát các chỉ tiêu hoá lý và các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nước giải khát từ bánh mỳ chanh dây trước khi tiến hành lên men nhóm nghiên cứu đã bố trí sơ đồ thí nghiệm ở hình 2.1. 2.3.1. Xác định chỉ tiêu hóa lý: oBx, pH, acid tổng, độ nhớt Mục đích: khảo sát sự thay đổi tính chất của nguyên liệu đầu vào. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một yếu tố là nồng độ chất khô tan (hoặc pH, acid tổng, độ nhớt), thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nghiệm thức làm song song 3 mẫu. 2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô tan đến chất lượng sản phẩm Mục đích: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến độ cồn và hàm lượng ester tạo thành sau lên men. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một yếu tố là nồng độ chất khô tan, mỗi nghiệm thức làm song song 3 mẫu. Nhân tố cố định: - Thời gian lên men: 24 giờ; - pH= 4,2; - Lượng S.cerevisiae bổ sung: 2,0 g/l nấm men khô với mật độ là 2.106 tế bào/ml. Nhân tố khảo sát: 18 - Nồng độ chất khô tan: 14 oBx, 18 oBx, 22 oBx, 26 oBx. Xác định: nồng độ cồn (%V), lượng ester (mg/l) Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm. Bánh mỳ đen Ngâm trong nước nóng, (78 ± 2 °C, 3giờ) Xác định chỉ tiêu hóa lý: oBx, pH, acid tổng, độ nhớt Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất khô tan: 14 oBx, 18 oBx, 22 oBx, 26oBx Khảo sát ảnh hưởng của pH: 3,6; 3,8; 4,0; 4,2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống: 1 g, 2 g, 3 g, 4g Dịch chiết Lên men Nấm men khô Lắng lọc Sản phẩm Nướng 170 oC, 10 phút Điều chỉnh dịch lên men Chiết rót, tàng trữ Bã Cặn Đánh giá chất lượng sản phẩm Dịch chanh dây 19 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến chất lượng sản phẩm Mục đích: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến nồng độ cồn còn lại, độ cồn và hàm lượng ester. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một yếu tố là pH, mỗi nghiệm thức làm song song 3 mẫu. Nhân tố cố định: - Thời gian lên men: 24 giờ; - Nồng độ chất khô tan: kết quả từ 2.3.2; - Lượng nấm men S. cerevisiae bổ sung: 2 g/l nấm men khô với mật độ là 2.106 tế bào/ml. Nhân tố khảo sát: pH Điều chỉnh pH ở: 3,8; 4,0; 4,2; 4,4. Xác định: nồng độ cồn (%V), lượng ester (mg/l) 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men đến chất lượng sản phẩm Mục đích: khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến độ cồn và hàm lượng ester. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một yếu tố là tỷ lệ nấm men, mỗi nghiệm thức làm song song 3 mẫu. Nhân tố cố định: - Thời gian lên men: 24 giờ; - Nồng độ chất khô tan: kết quả từ 2.3.1; - pH: kết quả từ 2.3.3; Nhân tố khảo sát: - Tỷ lệ nấm men S. cerevisiae bổ sung: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 g/l với mật độ 1.106, 2.106, 3.106 tế bào/ml. Xác định: nồng độ cồn (%V), lượng ester (mg/l) 2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến chất lượng sản phẩm Mục đích: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến nồng độ chất khô tan còn lại, độ cồn, hàm lượng ester, pH và tính chất cảm quan của sản phẩm. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một yếu tố là thời gian lên men, mỗi nghiệm thức làm song song 3 mẫu. Nhân tố cố định: - Nồng độ chất khô tan: kết quả từ 2.3.2; 20 - pH: kết quả từ 2.3.3; - Lượng nấm men S. cerevisiae bổ sung: kết quả từ 2.3.4; Nhân tố khảo sát: - Thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Xác định: nồng độ cồn (%V), lượng ester (mg/l) 2.4. Phương pháp nghiên cứu [1] 2.4.1. Phương pháp vi sinh a. Xác định E. coli Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactozơ. Trên môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, coliforms lên men đường lactozơ tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucshin-sulfit và giải phóng fucshin. Fucshin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. Nếu khuẩn lạc màu hồng có ánh kim có thể giả định là E. coli thì kiểm tra có sinh Indol hay không. Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10 -1, 10 -2, 10 -3. Gieo cấy: Cấy 1 ml giọt mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa có chứa môi trường thạch Endo, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa lặp lại. Tráng đều mẫu trên mặt thạch. Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tử ấm ở nhiệt độ 37 oC trong thời gian 48-72 giờ. Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim để tiến hành khẳng định đó là E. coli. Kiểm tra hình thái Nhuộm gram, soi kính để xác định Gram (-), trực khuẩn nhỏ dài. Từ ống canh trường ria sang môi trường Endo hoặc EMB đặt trong tủ ấm ở 37 oC trong 24 giờ. Nếu phát hiện thấy những khuẩn lạc đỏ ánh kim (hay không có ánh kim), cấy tiếp sang môi trường thạch thường để thực hiện phản ứng IMVIC (các phản ứng này thực hiện độc lập nhưng đồng thời). Thử Indol Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm có chứa môi trường EC dương tính sang các ống nghiệm có chứa Trypton. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 44 oC trong thời gian 48 giờ. Thêm 0,5 ml thuốc thử Indol vào các ống nghiệm có chứa Trypton để nuôi cấy, lắc đều và sau 1 phút thì quan sát và ghi nhận số lượng các ống có màu đỏ (kết quả 21 dương tính chứng tỏ có Indol) cho mỗi độ pha loãng. Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli đã đếm được trên các đĩa, tổng số ống nghiệm thử Indol dương tính (có màu đỏ) và tổng số ống thử Indol để tính toán kết quả. Số lượng E. Coli có trong 1ml (1g) mẫu được tính theo công thức: N = ΣC.R(CFU/ml,CFU/g) (n1 +0,1n2).f1.V, (2.1); Trong đó: - ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất các các đĩa; - n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất); - n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo); - f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1; - V: Thể tích mẫu cấy của mỗi đĩa petri; - R: Số ống thử Indol dương tính (có màu đỏ)/tổng số ống thử Indol. b. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10 -1, 10 -2, 10 -3. Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử và cho vào 2 đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 1ml nếu mẫu thử là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù nếu mẫu thử ở các dạng khác. Lặp lại quá trình này ở các dịch pha loãng tiếp theo. Đổ vào mỗi đĩa 12-15 ml môi trường thạch để đếm đĩa ở 44-47 oC. Trộn đều dịch nuôi cấy với môi trường thạch bằng cách xoay nhẹ đĩa petri theo hai chiều trái, phải. Để đĩa trên mặt phẳng cho thạch đông đặc lại. Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4 ml thạch màng lên trên bề mặt. Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 30 oC trong thời gian 72giờ. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút. Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức: Tính tổng số vi sinh vật trong 1 g hoặc 1 ml mẫu theo công thức : CS = [N/(n1 V1 F1) + (n2 V2 F2) ++ (ni Vi Fi)].VS, (2.2); 22 Trong đó: - CS: Tổng số vi sinh vật trong 1 g hoặc 1 ml mẫu (CFU/g hoặc ml); - N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa; - n1, n2,ni: Số đĩa đếm được ở mỗi nồng độ tương ứng (ở phương pháp này n=1); - V1,V2,..Vi: Số ml dịch mẫu được cấy; - F1, F2,Fi Nồng độ pha loãng tương ứng; - VS: Thể tích tham chiếu được lựa chọn để biểu hiện kết quả có trong 1 g hay 1 ml mẫu. c. Xác định Cl. perfringens Rót khoảng 5 ml TSC agar vào những đĩa vô trùng và đảm bảo sự phân phối bằng nhau. Sau khi agar trở nên đông đặc. Dùng pipette hút 0,1 ml hoặc 1 ml dung dịch mẫu đã được pha loãng ở nồng độ thích hợp. Sau đó rót khoảng 15 ml TSC agar ở 45,0 oC ± 1,0 oC và trộn đều dịch mẫu và môi trường nuôi cấy bằng cách lắc tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Ủ đảo ngược những đĩa pettri trong bình yếm khí ở 37,0 oC ± 1,0oC trong (24 ± 3) giờ. Đếm các đĩa có số khuẩn lạc từ 10-100 sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc Cl. perfringenes đặc trưng trên môi trường TSC có màu đen, xung quanh có quầng đen. Chọn 3-10 cụm khuẩn lạc đen từ những đĩa chứa 10-100 cụm khuẩn lạc. Trải ra trên Blood agar (thạch máu) và ủ kỵ khí trong (24 ± 3) giờ ở 37,0 oC ± 1,0 oC. Sau đó cấy đâm sâu vào môi trường di động và môi trường lactose. Ủ kỵ khí trong (24 ± 3) giờ ở 37,0 oC ± 1,0 oC. Kết quả thử nghiệm sinh hoá để khẳng định Cl. perfringenes là dương tính trên thạch máu và môi trường lactose. d. Xác định tổng số nấm men – nấm mốc Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào một đĩa thạch DRBC. Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10-2 (sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC thứ hai. Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0,3 ml dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa. Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng. Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường. Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳng 23 đứng trong tủ ấm ở 25 oC ± 1 oC trong 5 ngày. Để yên các đĩa thạch trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày. Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 2 ngày đến 5 ngày. Chọn các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc/chồi/mầm và đếm chúng. Nếu trên các đĩa có nấm mốc quá nhanh thì có thể đếm các khuẩn lạc/chồi/mầm sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày. 2.4.2. Phương pháp hóa lý a. Xác định hàm lượng chất khô tan (oBx) Dùng dung dịch nước cất nhỏ lên mặt kính khúc xạ kế rồi đậy nắp kính lại xem nền xanh trở về vị trí không chưa, nếu chưa thì dùng tua vít chỉnh cho về không. Dùng ống nhỏ giọt hút dịch quả nhỏ 1-2 giọt vào mặt kính khúc xạ kế, đậy tấm chắn sáng để dịch phủ đều trên lăng kính rồi đưa lên mắt ngắm điều chỉnh độ phóng đại sau cho xem được rõ nhất và đọc số trên thang đo được. b. Xác định pH Hiệu chỉnh máy đo bằng dịch chuẩn pH= 4,0, rửa đầu cực bằng nước cất rồi ngâm ngập đầu cực đo pH trong dung dịch cần đo, đọc giá trị hiển thị ổn định trên máy. c. Xác định acid tổng Nghiền nhỏ 3-5 g mẫu trong cối sứ, sau đó chuyển sang tam giác 250 ml, thêm nước cất sao cho đạt thể tích 150 ml. Đun 30 phút cách nhiệt ở nhiệt độ 80-90 oC, thỉnh thoảng lắc. Khi dung dịch đã nguội, lọc qua giấy lọc vào bình định mức 250 ml, thêm nước cất định mức đến vạch, lắc đều dịch. Lấy 50 ml dịch trên cho vào bình tam giác 250 ml, cho thêm 1-2 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho tới khi xuất hiện màu hồng. Lượng acid hữu cơ hòa tan trong mẫu tính ra %: X = , (2.3); Trong đó: - a: số ml NaOH 0,1N cần để chuẩn độ; - 0,0067: số gam acid tương ứng với 1ml NaOH 0,1N (0,0067 là hệ số đối với acid malic, nhưng lượng acid tổng số cũng tính theo hệ số này vì acid malic có nhiều trong rau quả); - T: hệ số điều chỉnh đối với NaOH 0,1N;