Đề tài Nghiên cứu quy trình chế biến trà từ lá dâu tằm

hàm lượng polyphenol và đánh giá tác dụng chống Oxy hóa của các mẫu bột chiết lá dâu”[4] vào năm 2005 và TS.BS.Nguyễn Quang Trung, bệnh viện Uông Bí – Quảng Ninh khi thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng bột chiết lá dâu trên các chỉ số lipid và trạng thái chống oxy hóa trong máu ở chuột nhắt trắng gây rối loạn lipid máu và đái tháo đường thực nghiệm” vào năm 2006 [5], tuy nhiên đây chỉ là những nghiên cứu về dược tính của một thành phần khác trong lá dâu. Trước những tác dụng của lá dâu nói chung và hợp chất DNJ nói riêng, cần phải ứng dụng được sản phẩm bột lá dâu tằm giàu DNJ này để tạo ra một số sản phẩm chức năng mang tính hàng hóa với mục đích phòng chống, hỗ trợ điều trị cho người bệnh tiểu đường với tiêu chí dễ sử dụng, giá thành hạ nhằm đa dạng hóa các sản phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường ở trên thị trường Việt Nam, đây đang là vấn quan tâm của các cơ quan chức năng. 23 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và nguyên vật liệu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Lá dâu tằm thu hái tại các địa phương có diện tích và sản lượng lớn là Thái Bình, Hà Nội, Sơn La, Lâm Đồng tập trung chủ yếu vào 4 giống là Hà Bắc, Quế, VH13 và Sa nhị luân 3.1.2. Hoá chất Các hoá chất xuất xứ từ Nhật, Trung Quốc, Đức bao gồm: axit formic, axetonitril, ammonium axetat, axit sulfuric, chloroform, diethylether, NH4OH đậm đặc, Na2SO4 khan, HC, axit axetic, Ethanol, Đường asprtame, maltodetrin, enzyme Ultra SPL,… 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị - Dụng cụ: ống đong, phễu thuỷ tinh, phễu chiết, bình định mức…. - Thiết bị:  Máy HPLC- FL, Shimadzu, cột ODS-3.  Cân điện tử Presisa 62A, Thụy Điển.  Thiết bị lọc chân không  Bình hút ẩm  Máy đo hàm ẩm  Micropipet cầm tay – Đức  Máy hút chân không - TQ.  Máy đo màu MINOTA- CHROMAMETER CR200/231  Cân phân tích - SHIMADZU & MONO BLOC - Nhật Bản 3.2. Nội dung - Nghiên cứu xác định giống, độ già và phương pháp bảo quản thích hợp - Nghiên cứu quy trình sản xuất bột lá dâu có hàm lượng DNJ cao - Nghiên cứu tỉ lệ phối chế bột triết lá dâu với bột lá dâu khô và với chất điều vị 24 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1.Phương pháp chung Về mặt tổng thể đề tài sử dụng phương pháp thực nghiệm, có sự hỗ trợ của các lý thuyết toán học để xác định các điều kiện tối ưu trên mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng đồng thời và kiểm chứng các cơ sở giả thuyết. Phương pháp toán học các thực nghiệm trong nghiên cứu tìm tối ưu Tối ưu hoá một số quá trình, đặc biệt là quá trình trích ly đối với lá dâu mà cụ thể là xác định các giá trị tối ưu của các biến số nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Bằng ngôn ngữ, tối ưu hoá quá trình là tìm giá trị của các yếu tố X i để tại đó quá trình trích ly đạt hiệu suất cao nhất (tức là hàm lượng DNJ được chiết tách lớn nhất), nghĩa là các hàm mục tiêu Yi đạt cực trị. Để đạt được mục đích nghiên cứu chúng tôi chọn ma trận DOEHLERT. Ma trận này cho phép tìm được vùng tối ưu trong khoảng giới hạn đã chọn. Ma trận cho phép phân chia rất cân đối các điểm thí nghiệm trong giới hạn theo bất kỳ hướng nào. Dựa vào ma trận, ta có thể thêm các biến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận. Trong ma trận này, số lần thí nghiệm N và các biến số K được xác định như sau: N= K 2 + K+1. Trong trường hợp K= 3 thì số điểm thí nghiệm cần thực hiện là N=13. Với 3 yếu tố ảnh hưởng, ma trận được xác định như hình sau: 25 Tất cả các điểm đã chọn được xác định theo phương trình hồi quy có dạng sau: Y= b0+ b1X1+ b2X2+ b3X3 + b11X1 2 + b22X2 2 + b33X3 2 + b12X1X2+ b13X1X3 + b23X2X3. Trong đó : Y- Hàm mục tiêu ( hay các đại lượng cần xác định) b- Các hệ số hồi quy X- Các biến số. Quá trình tính toán và kết quả được xử lý bằng máy tính theo chương trình NEMROD- New Efficient Methodology For Research Using Optimal Design. 3.3.2. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu - Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp yếu tố ngẫu nhiên hoàn toàn - Kiểm tra giả thiết thống kê theo ANOVA 3.3.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý - Xác định màu sắc của nguyên liệu và sản phẩm trong quá trình nghiên cứu bằng máy đo màu MINOTA. - Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng refactometer (chiết quang kế) theo TCVN 5610-1991. - Xác định độ ẩm theo TCVN 5613-1991. - Xác định hàm lượng alcaloit toàn phần bằng sắc ký lỏng cao áp. - Xác định hàm lượng DNJ bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp: Xác định hàm lượng DNJ bằng phương pháp tạo dẫn xuất với 9-fluorenylmethyl chloroformat trên hệ thống HPLC pha ngược. - Xác định số lượng nấm men, nấm mốc theo TCVN 4886-89. 3.3.4. Phương pháp đánh giá cảm quan Sử dụng phép thử thị hiếu để đánh giá mức độ ưa thích đối với sản phẩm (theo thang điểm hedonic 1-9) 3.3.5. Phương pháp cụ thể Các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần. Nội dung 1: Nghiên cứu giống, độ già lá dâu và phương pháp bảo quản thích hợp 26 Trên cơ sở khảo sát, ta lựa chọn 4 giống có năng suất và diện tích trồng lớn, phân tích xác định giống có hàm lượng DNJ cao. Về độ già: Tiến hành xác định ở các độ già khác nhau từ lá non (lá 1 – 4 từ nõn trở xuống) thuần thục (từ lá thứ 5 – tới lá thứ 9) lá già (từ lá thứ 9 xuống gốc) Thí nghiệm1: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu đến sự thay đổi hàm lượng DNJ Tiến hành phân tích chất lượng của lá dâu sau khi thu hái ở hai trạng thái CT1: Lá dâu tươi CT2: Lá dâu khô, độ ẩm ≤ 10% Bảo quản lá dâu ở điều kiện thường trong khoảng thời gian từ 1-10 ngày. Sau đó, xác định hàm lượng alkaloid TS trong lá dâu trong khoảng thời gian bảo quản, kiểm tra 2 ngày/lần. Thí nghiêm 2: Xác định phương pháp làm khô thích hợp Tiến hành làm khô lá dâu sau thu hái bằng 3 phương pháp CT1: Phơi nắng CT2: Sấy đối lưu ở nhiệt độ 60-70oC CT3: Sấy lạnh đến độ ẩm đến khi lá dâu có độ ẩm 10% Sau đó lá dâu khô được đóng trong bao bì PE buộc kín và bảo quản trong điều kiện thường. Tiếp tục theo dõi sự thay đổi hàm lượng alkaloid TS trong lá dâu khô ở 3 phương pháp trong thời gian bảo quản 3 tháng, kiểm tra 1tuần/lần. Các chỉ tiêu kiểm tra hàm lượng alkaloid tổng số Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giàu DNJ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định phương pháp trích ly thích hợp Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ sau khi xử lý enzim ở các điều kiện thích hợp (có được từ thí nghiệm 1) tiếp tục được khảo sát hiệu suất trích ly bằng 3 phương pháp trích ly phổ biến áp dụng với việc chiết dược liệu, gồm 3 công thức TN 27 - Công thức 1: Phương pháp ngâm với dung môi - Công thức 2: Phương pháp ngấm kiệt bằng dung môi - Công thức 3: Phương pháp trích ly Soxhlet * Các chỉ tiêu kiểm tra: Hàm lượng alkaloid và DNJ trong dịch chiết (hay hiệu suất trích ly) Thí nghiệm 2: Nghiên cứu lựa chọn loại và nồng độ dung môi trích ly thích hợp. * Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau rồi tiến hành trích ly trong cùng một khoảng thời gian, cùng nhiệt độ, cùng tỷ lệ dung môi/nước chiết và cùng phương pháp trích ly với các loại dung môi có các nồng độ sau: Loại dung môi: Do sản phẩm cuối cùng của quá trình tách chiết được sử dụng làm thực phẩm chức năng nên để đảm bảo độ an toàn vệ sinh thực phẩm và đơn giản cho quá trình chiết tách dự kiến sử dụng 03 loại dung môi là nước, ethanol trung tính, ethanol đã axit hóa (đây là các dung môi thường được sử dụng trong quá trình chiết xuất các dược liệu) Nồng độ dung môi (đối với dung môi ethanol trung tính và ethanol đã axit hóa): 30%V- 96%V. Trên cơ sở xác định hàm lượng DNJ có trong dịch chiết ở các mẫu mà xác định được loại dung môi cũng như nồng độ dịch chiết thích hợp nhất. Tuy nhiên trong quá trình này cũng cần chú ý tới hiệu quả kinh tế, đây cũng được coi là một tiêu chuẩn để lựa chọn loại dung môi thích hợp. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và thời gian trích ly thích hợp. * Phương pháp: Tiến hành xác định miền ảnh hưởng của từng yếu tố trong quá trình trích ly (nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, thời gian trích ly) bằng cách thực hiện các thí nghiệm thăm dò đơn yếu tố nhằm xác định vùng dừng của từng tham số công nghệ, cụ thể: + Nhiệt độ trích ly (X): Từ 300C- 1000C. 28 + Thời gian trích ly (Y): 4 – 24 giờ. + Tỷ lệ lá dâu/dung môi (Z): 1/6, 1/8, 1/10, 1/12. Từ đó sử dụng phương pháp toán học (như đã nêu) để tìm miền tối ưu của các yếu tố trên. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu xác định số lần trích ly thích hợp. * Phương pháp: Tiến hành trích ly với các lần trích ly n =1 - 4 lần ở các điều kiện đã chọn (có được từ thí nghiệm 4). Dựa vào hiệu suất trích ly (hay hàm lượng DNJ có trong dịch chiết) kết hợp với hiệu quả kinh tế để xác định số lần trích ly thích hợp. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu xác định chất mang và nồng độ chất mang thích hợp Dịch chiết lá dâu được cô cạn tới 19.60bx. Sau đó lấy mỗi mẫu dịch chiết có thể tích là 100ml được bổ sung các chất mang: maltodextrin, đường isomalt, tinh bột biến tính ở ba nồng độ khảo sát lần lượt là: 4,5,6% được sấy phun ở cùng một chế độ sấy như nhau. Xác định Hàm lượng DNJ/g sản phẩm, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khả năng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước từ đó xác định được chất mang và nồng độ chất mang thích hợp. Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện sấy phun: - Lưu lượng nhập liệu: 432ml/h - Áp suất khí nén: 8bar - Nhiệt độ đầu vào: 125oC Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ sấy phun thích hợp Dịch lá dâu sau khi trích ly được cô cạn tới 19.6oBx, sau đó tiến hành lấy mỗi mẫu dịch chiết có thể tích là 100ml được bổ sung chất mang và nồng độ chất mang thích hợp từ thí nghiệm 1 rồi tiến hành sấy phun ở các khoảng nhiệt độ khác nhau: 115,125,135,145,155. Xác định Hàm lượng DNJ/g sản phẩm, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khả năng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước từ đó xác định được nhiệt độ sấy thích hợp. Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện sấy phun: 29 - Lưu lượng nhập liệu: 432ml/h - Áp suất khí nén: 8bar Thí nghiệm 7: Xác định lưu lượng nhập liệu thích hợp cho sấy phun bột chiết lá dâu tằm Dịch lá dâu sau khi trích ly được cô cạn tới19.6oBx, sau đó tiến hành lấy mỗi mẫu dịch chiết có thể tích là 100ml được bổ sung chất mang và nồng độ chất mang thích hợp từ thí nghiệm 1 rồi tiến hành sấy phun ở các lưu lượng nhập liệu khác nhau: Xác định Hàm lượng DNJ/g sản phẩm, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khả năng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước từ đó xác định được lưu lượng nhập liệu thích hợp. Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện sấy phun: - Nhiệt độ đầu vào: nhiệt độ thích hợp được tìm từ thí nghiệm 2 - Áp suất khí nén: 8bar * Các chỉ tiêu xác định: Hàm lượng DNJ/ml sản phẩm, màu sắc, mùi vị sản phẩm. Nội dung 3: Nghiên cứu tỉ lệ phối chế giữa bột chiết lá dâu với bột lá dâu khô và chất điều vị Thí nghiêm 1: Nghiên cứu tỷ lệ phối chế bột lá dâu và lá dâu khô Từ hàm lượng DNJ có trong lá dâu khô và trong bột chiết lá dâu ta phối chế để được hàm lượng DNJ theo yêu cầu rồi đem đánh giá cảm quan CT Tỷ lệ bột lá dâu khô(%) Tỷ lệ bột chiết (%) Hàm lượng DNJ (mg/túi 3g) CT1 98 2 7.5 CT2 96 4 8.4 CT3 94 6 9.4 CT4 92 8 9.8 CT5 90 10 11.4 CT6 88 12 12.3 CT7 86 14 13.3 CT8 84 16 14.3 CT9 82 18 15.2 CT10 80 20 16.2 30 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tỉ lệ phối chế các chất điều vị. Sử dụng trà được phối chế thu được ở thí nghiệm trên. Ta bổ xung chất điều vị là đường Isomailt theo các tỷ lệ 4 - 10% theo các công thức dưới đây rồi đánh giá cảm quan. CT Tỷ lệ đường Iso malt (%) CT1 4.0 CT2 4,5 CT3 5.0 CT4 5.5 CT5 6.0 CT6 6.5 CT7 7.0 CT8 7.5 CT9 8.0 CT10 8.5 CT11 9.0 CT12 9.5 CT13 10 31 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu giống và độ già lá dâu thích hợp Theo số liệu thống kê năm 2000 của Cục trồng trọt – Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thì có thể thấy là cây dâu tằm được trồng trên hầu khắp các miền của đất nước ta, trong đó sản lượng tập trung chủ yếu nhất tại miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Trong đó mỗi địa phương trồng loại giống cây khác nhau, cho năng suất và chất lượng khác nhau. Tuy nhiên do giới hạn thời gian và phạm vi đề tài nên chúng tôi lựa chọn nguồn nguyên liệu lá dâu của tỉnh Thái Bình với 4 giống dâu là Hà Bắc, Quế, Sa nhị luân và VH13 ở 3 độ già khác nhau là lá non, lá thành thục và lá già. Qua khảo sát thử bằng việc lựa chọn lá dâu đem phân tích nồng độ DNJ bằng phương pháp sắc lỏng cao áp tại Viện công nghiệp thực phẩm, kết quả chỉ ra nồng độ DNJ trong lá dâu ở tỉnh Thái Bình đạt 0,32% Do vậy chúng tôi chọn lá dâu thu hái tại Thái Bình để làm nguyên liệu cho nghiên cứu trong đề tài này vì lá dâu ở vùng này có nồng độ DNJ cao và đây cũng là vùng giàu truyền thống trồng dâu nuôi tằm nên thuận tiện trong việc phát triển vùng nguyên liệu. Tuy nhiên do điều kiện và thời gian thí nghiệm, chúng tôi chỉ xác định được hàm lượng alkaloid TS thay cho việc định lượng chính xác hàm lượng DNJ 4.1.1. Ảnh hưởng của độ già thu hái đến hàm lượng alkaloid TS Trong cùng một giống dâu thì ở các độ non già khác nhau, hàm lượng alkaloid TS chứa trong đó cũng khác nhau. Với giống dâu Quế, khi thu hái chúng tôi phân thành ba loại lá: lá non (lá thứ 1–4 kể từ nõn trở xuống), lá bánh tẻ (lá thứ 5–8 kể từ nõn xuống) và lá già (từ lá thứ 9 xuống gốc). Kết quả phân tích hàm lượng alkaloid TS được chỉ ra trên bảng 4.1 32 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của độ già thu hái đến hàm lượng alkaloid TS trong lá dâu Quế Độ non già Hàm lượng alkaloid TS (%) Lá non 0,48 Lá bánh tẻ 0,46 Lá già 0,23 5%LSD 0,002 CV% 0,3 Từ kết quả ở bảng 4.1, chúng tôi thấy sự sai khác về hàm lượng alkaloid trong lá dâu non và lá bánh tẻ là không lớn. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nitra và cộng sự (2007) khi thực hiện các thí nghiệm so sánh thành phần DNJ trong lá dâu tằm ở các độ già khác nhau và nhận thấy hàm lượng DNJ có trong chồi lá cao hơn lá bánh tẻ [16]. Tuy nhiên do số lượng lá non rất ít, khoảng 3 - 4 lá, hơn nữa là những lá mới hình thành nên khối lượng cũng thấp, sản lượng thu hái không cao. Trong khi đó, lá bánh tẻ có khối lượng nhiều hơn, mặt khác khi thu hái vẫn đảm bảo cây ra lá đều đặn, do vậy chúng tôi sử dụng lá bánh tẻ cho quá trình tách chiết. 4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu đến sự thay đổi hàm lượng DNJ Bảng 4.2. Sự biến đổi hàm lượng alkaloid của lá dâu tươi và lá dâu khô trong 10 ngày theo dõi Ngày Lá dâu tươi (10g) Lá dâu khô (10g) Khối lượng alkaloid toàn phần (g) Độ ẩm (%) Khối lượng alkaloid toàn phần (g) Độ ẩm (%) 0 ngày 0.074 70.62 0.227 10.23 2 ngày 0.137 46.59 0.226 10.23 4 ngày 0.165 33.24 0.224 10.46 6 ngày 0.197 19.06 0.22 10.58 8 ngày 0.213 14.48 0.221 10.72 10 ngày 0.220 12.44 0.220 10.89 33 Dựa trên bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy, khối lượng alkaloid TS trong lá dâu tươi sau thu hái có sự biến động mạnh trong 10 ngày theo dõi. Ở điều kiện thường, cụ thể thời gian bảo quản càng dài thì độ ẩm càng giảm và hàm lượng alkaloid tăng lên có thể thấy độ ẩm của lá dâu tỉ lệ nghịch với hàm lượng alkaloid. Điều này chứng tỏ hàm lượng alkaloid ít bị biến động. Trong 10 ngày theo dõi thì khối lượng alkaloid liên tục tăng. Nguyên nhân là do bảo quản ở điều kiện thường, lá dâu tươi bị mất nước dẫn tới giảm hàm lượng nước. Đến ngày thứ 10 thì lá dâu tươi có độ khô dần tương đương với lá dâu đã được làm khô tới độ ẩm ≈ 10%. Khi lá dâu được làm khô chúng ta cũng dễ bảo quản hơn do ở hàm ẩm thấm vi sinh vật khó phát triển, khối lượng lá nhỏ hơn dẽ dàng cất giữ trong các kho chứa. Mặt khác, trong thực tế không thể sử dụng nguyên liệu tươi làm nguyên liệu cho cả quá trình sản xuất vì nguyên liệu tươi có thời vụ nhất định, nếu muốn giữ được trạng thái tươi trong thời gian dài phải có chế độ bảo quản, gây tốn kém mà chất lượng vẫn giảm. Như vậy, chúng tôi thấy cần sấy khô lá dâu để bảo quản nguyên liệu đơn giản và lâu dài. 4.1.3. Xác định phương pháp làm khô nguyên liệu thích hợp Có rất nhiều phương pháp sấy khô, trong khuôn khổ đề tài và khả năng thực hiện chúng tôi lựa chọn ba phương pháp là: Phơi nắng, sấy đối lưu ở nhiệt độ 60 – 700C và sấy lạnh để đưa nguyên liệu về độ ẩm ≈10%. 34 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Thời gian (tuần) Hà m lư ợn g DN J ( %) Hong héo tự nhiên Sấy đối lưu Lanh đông Hình 4.1. Đồ thi sự biến đổi hàm lượng alkaloid TS qua 1 tháng theo dõi của lá dâu khô Kết quả cho thấy hàm lượng alkaloid tổng số giảm dần theo thời gian bảo quản, tuy nhiên mức độ giảm trong 1 tháng theo dõi là không lớn. Trong ba phương pháp thì phương pháp sấy lạnh đông và sấy đối lưu cho hàm lượng alkaloid ổn định hơn, nhưng sự chênh lệch này rất nhỏ. Điều đó chứng tỏ khi đưa lá dâu về độ ẩm 10% thì thu được hàm lượng alkaloid TS ổn định. Mặt khác, trong các phương pháp sấy khô chúng tôi thấy phơi nắng có nhiều ưu điểm vì không tốn năng lượng, với việc thu hoạch lá dâu ở hai vụ xuân, hè thì thời tiết luôn đảm bảo nhiệt độ 28 – 33oC nên chỉ sau từ 3 – 5 ngày lá dâu có thể đạt tới độ khô cần thiết. Trong khi đó phương pháp sấy đối lưu và sấy lạnh cho chất lượng lá dâu ổn định và đồng đều hơn, nhưng tiêu tốn nhiều năng lượng, nhưng không phụ thuộc vào thờ tiết. Như vậy xét về chất lượng lá dâu và hiệu quả kinh tế, trong mùa nắng nên sử phương pháp phơi nắng. Trong mùa mưa độ ẩm lá dâu lớn, nhiệt độ không thuận lợi chúng ta nên sử dụng phương pháp sấy đối lưu. 35 4.2. Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giàu DNJ 4.2.1. Nghiên cứu phương pháp trích ly thích hợp Trong nghiên cứu của đề tài chúng tôi lựa chọn so sánh hiệu suất chiết giữa ba phương pháp trích ly là phương pháp ngâm nguyên liệu trong dung môi, phương pháp ngấm kiệt và phương pháp trích ly Soxhlet. Kết quả phân tích hàm lượng alkaloid TS, hàm lượng DNJ thu được ở ba phương pháp được thể hiện trong bảng 7 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của các phương pháp trích ly đến hàm lượng alkaloid có trong lá dâu Công thức CT1 CT2 CT3 Công thức Hiệu suất thu hồi alkaloid (%) 67.55 72.25 85.17 Hiệu suất thu hồi alkaloid (%) Hàm lượng DNJ (%) 0,017 b 0,018 ab 0.019 a Hàm lượng DNJ (%) CV (%) 4.605 4.605 4.605 CV (%) Ghi chú : Trong cùng một hàng, các kết quả có chung ít nhất một chữ cái thì không khác nhau có nghĩa ở mức p<0,05 CT1: Phương pháp ngấm kiệt CT2: Phương pháp ngâm trong dung môi CT3: Phương pháp soxhlet Kết quả ở bảng cho thấy hàm lượng alkaloid thu được trong lá dâu bằng phương pháp Soxhlet cho hiệu suất chiết alkaloid cũng như DNJ trong sản phẩm cao hơn so với phương pháp ngấm kiệt và ngâm trong dung môi. Tuy nhiên phương pháp này không thể áp dụng trong quy mô sản xuất vì nó mất nhiều thời gian, tốn năng lượng và đòi hỏi trang thiết bị phức tạp. Trong hai phương pháp còn lại thì phương pháp ngấm kiệt cho hàm lượng alkaloid thu được cao hơn phương pháp ngâm trong dung môi, hơn nữa phương pháp ngấm kiệt có ưu điểm tốn ít dung môi mà vẫn chiết kiệt được hoạt chất. 36 Do vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp ngấm kiệt là phương pháp chiết hoạt chất DNJ trong lá dâu tằm. 4.2.2. Nghiên cứu lựa chọn loại và nồng độ dung môi trích ly thích hợp Sản phẩm chiết xuất được dùng làm đồ uống và thực phẩm nên không được phép dùng các hoá chất độc hại cho sức khoẻ. Vì vậy trong ngành thực phẩm thì loại dung môi duy nhất được sử dụng là dung dịch cồn vì chỉ dung môi này mới đảm bảo được yếu tố an toàn thực phẩm cho người sử dụng. Cồn 90%V có độ phân cực kém nên chỉ hoà tan được các chất khó phân cực, cồn 30%V có độ phân cực gần như tương đương với nước nên có khả năng hoà tan các chất có độ phân cực mạnh, trong khi đó nhiều loại chất có khả năng hoà tan mạnh trong dung môi có độ phân cực ở mức trung bình như cồn 70%V. Dựa trên độ phân cực của cồn bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hiệu suất trích ly các hợp chất alkaloid trong lá dâu. Vì hàm lượng DNJ trong lá dâu tằm rất thấp chỉ xấp xỉ 0,18%, trong khi đó mục tiêu của đề tài là chiết xuất sản phẩm bột chiết lá dâu với hàm lượng DNJ từ 0,5 đến 1% để có thể tạo ra sản phẩm trà dành cho người bị tiểu đường. Vì vậy, việc chiết xuất không chỉ định hướng vào chiết xuất được nhiều alkaloid mà còn phải thu được sản phẩm tan tốt trong nước, cho dung dịch trong, hấp dẫn người sử dụng. Được biết alkaloid dạng bazơ hầu như không tan trong nước, trong khi đó muối của các alkaloid lại tan tốt trong nước. Lợi dụng tính chất tạo muối với các axit của các alkaloid để lựa chọn phương pháp chiết xuất thích hợp, cụ thể là chiết xuất bằng cồn trong môi trường axit có thể cho sản phẩm đạt các yêu cầu nêu trên. Trong số các axit có thể lựa chọn axit axetic – một axit được dùng trong thực phẩm, sẽ an toàn hơn các axit vô cơ khác để axit hoá cồn, ngoài ra đây là axit bay hơi nên có thể dễ dàng loại bỏ khi cô đặc dịch chiết. Do vậy ngoài 3 dung môi cồn 30, 50, 70, 90%V chúng tôi sử dụng cả dung môi cồn bị axit hoá bằng axit axetic 1% ở các nồng độ 30, 50, 70, 90%V để xác định xem loại dung môi nào là thích hợp nhất để trích ly alkaloid trong lá dâu. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.4. 37 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của loại và nồng độ dung môi đến hàm lượng alkaloid TS và DNJ thu được trong lá dâu Công thức Hiệu suất thu hồi alkaloid(%) Hàm lượng DNJ(%) CV(%) CT1 75,18 0.015 de 2,977 CT2 83,99 0.016 dc 2,977 CT3 86,64 0.016 bc 2,977 CT4 72,54 0.014 e 2,977 CT5 80,47 0.017 ab 2,977 CT6 83,41 0.017 ab 2,977 CT7 85,16 0.018 a 2,977 CT8 87,81 0.018 a 2,977 Ghi chú : Trong cùng một hàng, các kết quả có chung ít nhất một chữ cái thì không khác nhau có nghĩa ở mức p<0,05 CT1: Dung môi cồn 30%V CT5: Dung môi cồn 30%V có 1% axit axetic CT2: Dung môi cồn 50%V CT6: Dung môi cồn 50%V có 1% axit axetic CT3: Dung môi cồn 70%V CT7: Dung môi cồn 70%V có 1% axit axetic CT4: Dung môi cồn 90%V CT8: Dung môi cồn 90%V có 1% axit axetic CT1: Dung môi cồn 30%V CT5: Dung môi cồn 30%V có 1% axit axetic Kết quả cho thấy về mặt hiệu suất thì cồn 70%V trung tính và axit hoá đều cho hiệu suất thu hồi alkaloid toàn phần cao (85,15 – 86,67%) nhưng sau quá trình chiết thì việc loại tạp chất để thu dịch trong rất khó khăn (dịch chiết có nhiều sáp, nhựa, chlorophyl vì các chất này hoà tan tốt trong dung môi này do vậy rất khó lọc dịch chiết). Cồn 90%V cho hiệu suất thu hồi thấp nhất, có thể thấy đây không phải là dung môi thích hợp cho việc chiết xuất. Cồn 30% trung tính và axit hoá đều cho dịch chiết lọc dễ dàng, ít nhựa và chlorophly. Đặc biệt nhận thấy dịch chiết cồn đã được axit hoá cho hiệu suất thu hồi alkaloid tăng lên đáng kể so với khi dùng dung môi cồn 30%V trung tính từ 74,85% lên 80,83%, 38 điều này cho thấy tác dụng rất tốt của việc axit hoá dung môi chiết. Nguyên nhân có thể là do khi dùng cồn axit, tạp chất chiết ra ít hơn, do đó ít gây cản trở việc hoà tan chiết xuất alkaloid toàn phần cũng như DNJ từ lá dâu. Ngoài ra về cảm quan sơ bộ sản phẩm thu được thì thấy rằng sản phẩm chiết bằng cồn 70%V trung tính và cồn 70%V đã axit hoá có mùi thơm, vị nhạt, dễ hút ẩm thành dạng chảy nhão, khi hoà trong nước nóng cho dung dịch trong suốt. Còn sản phẩm chiết bằng cồn 30%V trung tính và cồn 30%V đã axit hoá có mùi thơm, vị nhạt, dễ hút ẩm nhưng chỉ bị vón cục chứ không thành dạy chảy nhão như bột chiết bởi cồn 70%V, khi hoà trong nước nóng cũng cho dung dịch trong suốt. Đối với dung môi axit hoá thì theo mức độ tăng dần của nồng độ cồn thì hiệu suất thu hồi alcaloit là tăng lên, tuy nhiên ở nồng độ dung môi cồn càng cao thì việc tách cặn khỏi dịch sau khi chiết là khó khăn hơn nồng độ cồn thấp, điều này cho thấy việc chiết xuất với dung môi cồn 30%V đã giúp thao tác công nghệ được dễ dàng hơn. Khi chiết ở nồng độ cồn 70%V thì hiệu suất thu hồi alcaloit đạt 85,15% trong khi ở nồng độ cồn 30%V thì hiệu suất alkaloid là 80,83%, sự tăng lên về hiệu suất này so với việc tăng giá thành khi dùng dung môi cồn 70%V thay cho 30%V thì là không có hiệu quả kinh tế. Do vậy cân nhắc cả yếu tố chất lượng cảm quan bột chiết và ý nghĩa kinh tế thì có thể thấy việc chọn dung môi cồn 30% V được axit hoá bằng axit nồng độ 1% là hoàn toàn thích hợp cho quá trình tách chiết alcaloit lá dâu. 4.2.3. Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian trích ly thích hợp 4.2.3.1 Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly thích hợp Từ các kết quả nghiên cứu ở phần trên, trong thí nghiệm tiếp theo này chúng tôi chỉ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết suất đến