Đề tài Nghiên cứu quy trình xử lý bã dâu làm phân hữu cơ - Vi sinh

là 45-500C, nhiệt độ tối thiểu là 270C với pH=5. Chúng sinh trưởng, phân giải xenluloza nhanh nhưng hoạt tính của xenluloza trong dịch lọc thấp. I.3.2. Vi khuẩn Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật được quan tâm nghiên cứu nhiều. Nó có khả năng phân giải xenluloza mạnh nhưng cường độ không bằng nấm, do lượng enzym tiết ra môi trường ít hơn và các thành phần của enzym không đầy đủ. ở trong đất thường có ít vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ 3 loại enzym xenlulaza, do đó, để có thể phân giải xenluloza tự nhiên thì phải phối hợp các loài vi khuẩn khác nnhau lại để cùng phân giải trong mối quan hệ hỗ sinh. Từ thế kỷ 19, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải xenluloza. Những năm đầu thế kỷ 20, người ta đã phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này, trong đó niêm vi khuẩn là quan trọng nhất. Chúng có hình que nhỏ bé, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu là các giống Cytophaga, Sporocytophaga, Soragium. Ngoài ra còn thấy các loại thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân giải xenluloza. Trong điều kiện yếm khí, các loại vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt thuộc giống Clostridium và Bacillus hoạt động phân giải xenluloza. Chúng phát triển trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải xenluloza thành đường glocoza và xenlobioza, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon, kèm theo việc tạo thành axit hữu cơ, CO2 và H2O. I.3.3. Xạ khuẩn Trong tự nhiên, xạ khuẩn cũng được các nhà nghiên cứu chú ý đến. Xạ khuẩn là nhóm đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất và phát triển trong điều kiện hiếu khí. Dựa vào nhiệt độ sinh trưởng mà người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng sau đây: Xạ khuẩn ưa ấm: phát triển tốt ở nhiệt độ T=25-300C. Xạ khuẩn ưa nhiệt: phát triển tốt ở nhiệt độ T=50-700C. Xạ khuẩn có mặt quanh năm trong tất cả các loại đất, số lượng của chúng phụ thuộc vào tính chất và loại đất. Xenlulaza của xạ khuẩn là enzym ngoại bào, chúng thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Các môi trường có dịch chiết nấm nem, pepton, dịch thuỷ phân casein thường thuận lợi cho sự sinh trưởng của xạ khuẩn. Viegia và cộng tác viên đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vùng vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp xenlulaza và sinh trưởng tốt trên môi trường chứa 3,5% NaCl. Một số xạ khuẩn có hoạt tính phân giải xenluloza là: Streptomyces, Streptosporagium, Actinomyces nocardia, Micromonospora. I.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật Nhiệt độ Nhiệt độ gây ảnh hưởng rất khác nhau đến sự phát triển và sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật. Phần lớn, vi sinh vậy ưa ấm phát triển tốt ở nhiệt độ 28-:-300C, một số loài ưa nhiệt thì có thể phát triển ở nhiệt độ 55-:-650C. Vi khuẩn ưa nhiệt hoạt động mạnh mẽ và quan trọng nhất trong khoảng nhiệt độ 60-:-700C, chiếm ưu thế ở trung tâm đống ủ. Đạt nhiệt độ cao trong quá trình ủ có thể giảm được số vi sinh vật gây bệnh, giảm lượng nước có trong nguyên liệu tươi, thúc đẩy quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ nhanh hơn. Nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy rằng ở nhiệt độ lớn hơn 700C sẽ làm giảm nhanh quá trình phân huỷ chất hữu cơ, do hầu hết các vi sinh vật đều bị chết ở nhiệt độ lớn hơn 700C. Quá trình phân giải xenluloza tự nhiên bắt đầu từ 50C cho đến 650C. Vì vậy, tuỳ từng loại vi sinh vật mà lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển. Độ ẩm Để duy trì hoạt động sống , vi sinh vật cần nước và không khí. Độ ẩm chi phối hoạt động sinh học trong đất nói chung và của vi sinh vật phân giải xenluloza nói riêng. Khi độ ẩm quá cao (>90%) sẽ ngăn cản dòng khí thổi vào đống ủ do nguyên liệu quá ướt, các khe hở sẽ bị lấp đầy nước, làm giảm diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với không khí, vi sinh vật hiếu khí không phát triển được. Ngược lại quá trình yếm khí xảy ra, gây mùi khó chịu, đồng thời kéo dài thời gian ủ. Nhưng nếu độ ẩm quá thấp (<40%) thì không đủ nước cho vi sinh vật hoạt động, làm giảm quá trình phân huỷ. Nói chung, độ ẩm từ 50-:-60% là thích hợp nhất cho quá trình phân giải xenluloza, ở độ ẩm này nấm mốc phát triển rất tốt. Tuy nhiên, ở khoảng độ ẩm 40-:-60%, tốc độ của quá trình phân giải xenluloza lại phụ thuộc vào nguồn gốc của hợp chất hữu cơ ban đầu. Môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng đảm bảo cho sự phát triển của vi sinh vật phải có đầy đủ các chất chứa các nguyên tố như: C, N, H, O và các chất vô cơ khác như: Mn, Ca, P, S, Fe, K và một số chất khác. Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp xenlulaza của nấm mốc và vi khuẩn. Nguồn nitơ có thể là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Các hợp chất hữu cơ có thể là những nguyên liệu giàu đạm như nước chiết ngô, bộ mì, bột đậu tương, cám, pepton,... Nhưng nguồn nitơ hữu cơ có ảnh hưởng không giống nhau đến các loài vi sinh vật. Pepton làm kích thích sinh tổng hợp xenlulaza ở Penicillus oxalicum, T.koningi, nhưng lại ức chế quá trình sinh tổng hợp ở Aspergillus, Chaetomicum. Cao ngô với một lượng 0,5% sẽ làm kích thích sự tổng hợp xenlulaza của T.koningi, A.niger, nhưng ức chế sự tổng hợp này ở nấm chịu nhiệt. Nguồn nitơ vô cơ thường là các muối amôn, urê. Nitrat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp để tổng hợp xenlulaza ở rất nhiều loài nấm sợi khác nhau như: Aspergillus, Fusarium và Tricoderma... muối amôn thường làm ức chế tổng hợp enzym xenlulaza ở Aspergillus, Tricoderma và một số nấm khác. Các nguyên tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như đến sự sinh tổng hợp xenlulaza. Các nguyên tố có ảnh hưởng nhiều nhất là: Fe, Mn, Zn, Co. Nồng độ thích hợp đối với đa số các loài nấm là: Zn=0-:-2mg/l; Fe=3,4-:-27,2mg/l; các nguyên tố vi lượng từ 0,11-:-2,2mg/l. pH Các loài vi sinh vật khác nhau thì có độ pH thích hợp cho mỗi loài là khác nhau. Do đó, tuỳ từng loài vi sinh vật mà lựa chọn môi trường có độ pH thích hợp. Đại đa số các loài nấm sợi phát triển và tổng hợp xenlulaza mạnh mẽ ở pH=4-:-6. Cũng có một số loài nấm sợi có thể phát triển và phân huỷ xenluloza ở pH=1,8-:-2,0 chẳng hạn như: Fusarium oxysporum và trichoderma konungi. Độ cấp khí Vi sinh vật phát triển tốt trong môi trường có đủ không khí, do vậy, quá trình cấp khí có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật. Những vi sinh vật hiếu khí bắt buộc phải có đầy đủ không khí trong môi trường sống thì mới có thể phát triển được. Tuy nhiên, mức độ thông khí cho mỗi loài vi sinh vật là khác nhau. I.4. Phân hữu cơ vi sinh I.4.1. Khái niệm phân hữu cơ vi sinh Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón có vai trò rất quan trọng đối với cây trồng, quyết định cả về năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc sử dụng các loại phân hoá học quá nhiều đã gây ra hậu quả nặng nề đối với đất đai, ảnh hưởng đến sức khoẻ của cộng đồng. Ngược lại, phân hữu cơ vi sinh đang ngày càng góp phần thúc đẩy sự phát triển của nền nông nghiệp trên toàn cầu, khắc phục được tình trạng lãng phí phân bón của cây trồng, đồng thời tạo ra được một nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững. Phân hữu cơ là loại phân bón có thành phần chủ yếu là bã thải thực vật, nhờ hoạt động trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật, cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, góp phần nâng cao chất lượng và năng suất sản phẩm. Nó không có tác dụng xấu đến sức khoẻ con người, động vật và môi trường sinh thái. Phân hữu cơ vi sinh là phân hữu cơ nhưng được bổ sung thêm các chủng vi sinh vật sống hữu ích đã được phân lập, tuyển chọn, tồn tại dưới dạng sinh dưỡng hoặc tiềm sinh. Thông qua những hoạt động của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được như N, P, K... hoặc các hợp chất sinh học khác, làm tăng năng suất, chất lượng nông phẩm. Mặc dù nó không ảnh hưởng xấu đến con người nhưng nó có tác dụng chậm đối với cây trồng. Tuy vậy, cho đến nay phân hữu cơ vi sinh vẫn được sử dụng rộng rãi trong nền nông nghiệp nước ta bởi đặc tính ưu việt của nó. Chính vì thế mà công nghệ sản xuất phân hữu cơ và phân hữu cơ vi sinh bằng phương pháp ủ vẫn không ngừng được nâng cao và dần dần chất lượng được cải thiện. Đó chính là vấn đề mà nhiều nhà khoa học đã và đang quan tâm nghiên cứu. I.4.2. Nguyên tắc lựa chọn vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh Việc lựa chon vi sinh vật để sản xuất chế phẩm làm phân hữu cơ được dựa vào các nguyên tắc sau: Vi sinh vật phải có hoạt tính sinh học cao như khả năng sinh tổng hợp phức hệ enzym xenlulaza cao và ổn định, hoặc phân giải tốt các hợp chất photpho khó tan thành dễ tan. Sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện thực tế của sản xuất, có tính cạnh tranh với vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt có sẵn trong nguyên liệu. Có tác dụng cải tạo đất, có lợi cho thực vật khi bón phân vào đất, tức là có khả năng phát huy công dụng sau khi đã bón vào đất. Không độc cho người và cây trồng, động vật và vi sinh vật hữu ích trong đất. Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường tự nhiên, thuận lợi cho quá trình sản xuất chế phẩm. I.4.3. Phân ủ sinh học I.4.3.1. Bản chất quá trình ủ phân sinh học Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật phân huỷ các hợp chất hữu cơ với sự có mặt của O, C, N, P, S và một số chất dinh dưỡng khác để xây dựng nguyên sinh chất của tế bào. Các phản ứng chính xảy ra trong quá trình hiếu khí: Đường, xenluloza, hemixenluloza: (CH2O)X + xO2 xCO2 + xH2O + E Protein (Nitơ hữu cơ) NH3 NO2- NO3- + E Lưu huỳnh hữu cơ: S + xO SO42- Photpho hữu cơ H3PO4 Ca(HPO4)2. Trong quá trình phân huỷ yếm khí, đầu tiên các nhóm vi sinh vật sinh axit sẽ phân huỷ các hợp chất hữu cơ thành các axit béo, andehit, rượu,... Sau đó các nhóm vi sinh vật khác sẽ chuyển tiếp thành khí CH4, NH3, CO2, H2. Oxy cũng cần cho quá trình ủ yếm khí nhưng thường lấy từ các hợp chất hoá học và bằng con đường khuếch tán. Các vi sinh vật sử dụng nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác để xây dựng cơ thể với lượng sinh khối ít hơn. Trong quá trình ủ yếm khí, sự phân huỷ các hợp chất hữu cơ là không hoàn toàn, do đó sinh ra ít khí CO2 nhưng lại sinh ra các sản phẩm trung gian như axit hữu cơ, NH3. Sự đồng hoá cacbon của vi sinh vật giảm do vậy sinh ra nhiều khí CH4 và H2S. Trong quá trình ủ yếm khí năng lượng được sinh ra ít hơn so với quá trình ủ hiếu khí. Các phản ứng sinh hoá xảy ra trong quá trình ủ yếm khí: (CH2O)X xCH3COOH CH3COOH CH4 + CO2 Nitơ hữu cơ NH3 2H2S + CO2 + ánh sáng (CH2O)X + S2 + H2O ủ phân sinh học được coi là một quá trình ổn định sinh hoá để phân huỷ các hợp chất hữu cơ tự nhiên (chủ yếu là xenluloza) tạo thành sản phẩm cuối cùng là chất mùn nhờ hoạt động của các quần thể vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, động vật nguyên sinh... dưới tác động của độ ẩm, nhiệt độ, không khí... với thao tác sản xuất là kiểm soát một cách khoa học, tạo ra môi trường tối ưu đối với quá trình ủ. Quá trình ủ hữu cơ là một phương pháp truyền thống, được áp dụng phổ biến ở các quốc gia đang phát triển và ở Việt Nam. Phương pháp này được áp dụng rất hiệu quả. Chỉ sau một vài tháng đến hàng năm, sản phẩm tạo thành được sử dụng làm phân bón hữu cơ. Những đống lá hoặc đống phân có thể để đến hàng năm và thành chất thải hữu cơ, thành phân tử ổn định nhưng quá trình có thể tăng nhanh trong vòng 1 tuần hoặc ít hơn. Quá trình ủ được coi như là một quá trình xử lí tốt hơn được hiểu và so sánh với quá trình lên men yếm khí bùn hoặc quá trình hoạt hoá bùn. Sản phẩm cuối cùng thu được không có mùi, không chứa vi sinh vật gây bệnh và hạt cỏ. Để đạt được mức độ ổn định như lên men, việc ủ đòi hỏi phải có một phần nhỏ năng lượng để tăng dòng không khí qua các lỗ xốp, độ ẩm của khối ủ coi như là một máy nén thổi khí qua các tấm xốp phân tán khí trong bể Aeroten. Trong quá trình ủ, oxy sẽ được hấp thụ rất nhiều lần so với bể Aeroten. Quá trình ủ áp dụng với chất hữu cơ không độc hại, lúc đầu là khử nước sau đó là xử lý cho tới khi nó thành xốp và ẩm. Độ ẩm và nhiệt độ được kiểm soát để giữ cho vật liệu luôn luôn ở trạng thái hiếu khí trong suốt thời gian ủ. Quá trình tự tạo ra nhiệt riêng sẽ làm tăng nhiệt độ của đống ủ nhờ quá trình oxy hoá, sinh hoá các chất thối rữa. Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân huỷ là CO2, nước và các hợp chất hữu cơ bền vững như lignin, xenluloza, sợi. I.4.3.2. Các phương pháp ủ phân Phương pháp Indore: Nguyên liệu để ủ là hỗn hợp chất thải nông nghiệp, được rải từng lớp xuống một hố sâu 1m, rộng 1,5-:-2m, mỗi lớp nguyên liệu dày 10-:-15cm. Trên mỗi lớp rải đều 4,5kg phân; 3,5kg nước tiểu và 4,5kg phân ủ được 15 ngày. Đống ủ được tưới nước đủ ẩm và được đảo trộn 3 lần trong suốt thời gian ủ. Lần thứ nhất là sau 15 ngày ủ, lần thứ hai cách lần đầu 15 ngày, lần thứ ba cách một tháng. Thời gian ủ là 3-:-4 tháng. Phương pháp Banglore: Nguyên liệu được rải xuống hố tương tự như phương pháp Indore, nhưng thành và đáy hố có lớp chống thấm nước. Sau khi đầy hố, miệng hố được phủ một lớp bùn. Phương pháp này không cần đảo trộn và tưới thêm nước. Sau giai đoạn đầu phân huỷ hiếu khí (8-:-10 ngày) là giai đoạn phân huỷ nửa kỵ khí. Thời gian ủ là 6-:-8 tháng. phương pháp này không bị thất thoát chất hữu cơ và nitơ. Phương pháp ủ đống (heap method): Trên mỗi lớp nguyên liệu có nguồn gốc Cacbon (lá, cỏ, rơm rạ,...) dày 20cm giải một lớp nguyên liệu giàu nitơ (phân chuồng, bùn thải,...) dày 10cm. Cứ như vậy cho đến khi đống ủ cao 1,5m. Đống ủ có thể được phủ bằng đất hay cỏ khô để giữ nhiệt. Đảo đống ủ sau 6 tuần và 12 tuần. I.4.3.3. ưu nhược điểm của các phương pháp ủ phân sinh học Ưu điểm: Rác thải hay than bùn không bị bỏ đi mà sẽ được tái chế thành sản phẩm cung cấp cho nông nghiệp. Một nhà máy chế biến đặt ở trung tâm làm giảm chi phí vận chuyển so với việc chôn lấp; tiết kiệm được đất sử dụng cho chôn lấp, tăng khả năng chống ô nhiễm môi trường. Dễ dàng thu gom các nguyên liệu tái chế được như kim loại, nilon, thuỷ tinh, nhựa, giấy, bìa... Có thể xử lý được nước thải cống rãnh với chi phí thấp hơn nhà máy xử lý nước thải hiện đại. Các nguyên tắc trong sản xuất phân ủ từ rác đô thị và chế phẩm nông nghiệp có thể áp dụng cho xử lý rác công nghiệp. Phân ủ là một loại mùn vụn có tác dụng giữ nước cao. Ưu điểm lớn nhất của nó là giúp cải tạo đất, phân ủ có giá trị đặc biệt đối với vùng đất nhiều sét. Nhược điểm: Gặp nhiều khó khăn trong tiếp thị sản phẩm. Vốn và chi phí vận hành tương đối lớn, diện tích cũng khá lớn. Đòi hỏi người vận hành phải được đào tạo theo trình độ phù hợp. Thiếu kinh nghiệm trong vận hành máy hiện đại. Các phương pháp ủ rất hiện đại, đòi hỏi trình độ cao, chi phí lớn. Nhà máy nếu không được bố trí tốt có thể gây ô nhiễm môi trường, gây bệnh phổi cho người công nhân đứng trực tiếp sản xuất. Việc phân loại và tuyển chọn rác thải được chú trọng để tránh các mảnh kim loại, thuỷ tinh rơi vào phân... Mức độ tự động của công nghệ chưa cao, việc phân loại chất thải, tinh chế và pha trộn, đóng bao vẫn thực hiện theo phương pháp thủ công nên ảnh hưởng đến sức khoẻ, chất lượng lại không đồng đều. I.4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ phân Nghiền nguyên liệu: Nghiền có tác dụng làm kích thước của nguyên liệu nhỏ đi, do đó tăng diện tích tiếp xúc với không khí tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập và phân huỷ dễ dang. Nghiền nguyên liệu là quá trình xử lí sơ bộ xenluloza làm giảm kích thước tiểu phần và làm lỏng lẻo cấu trúc tinh thể, đồng thời cắt ngắn chuỗi xenluloza giúp enzym xenlulaza của vi sinh vật hoạt động có hiệu quả hơn. Độ ẩm và độ thông khí: Độ ẩm cao sẽ ngăn cản không khí vào đống ủ. Do đó làm giảm diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với không khí, các vi sinh vật hiếu khí không phát triển được, quá trình ủ yếm khí xảy ra sẽ gây mùi khó chịu, đồng thời kéo dài thời gian ủ. Nếu độ ẩm quá thấp sẽ không đủ nước cho các hoạt động trao đổi chất của các vi sinh vật. pH: Giá trị pH ban đầu của đống ủ thường hơi axit (pH=6,0). Sự tạo ra các axit hữu cơ thường làm giảm pH xuống 4,5-:-5,0 nhưng trong quá trình ủ khi nhiệt độ tăng cao thì pH tăng lên đến độ hơi kiềm (7,5-:-8,5). Việc khống chế pH trong ủ hiếu khí là không quan trọng lắm, nhưng nếu xảy ra quá trình ủ yếm khí sẽ sinh nhiều axit hữu cơ, do đó làm giảm pH của đống ủ. Tro, cacbonat, vôi và các chất có tính kiềm khác trong nguyên liệu có vai trò chất đệm làm cho pH không xuống quá thấp, nhưng nếu bổ sung thêm vào đống ủ sẽ gây ra hiện tượng mất nitơ dưới dạng khí NH3 bay lên trong điều kiện pH cao. Tỷ lệ C/N: Đây là tỷ lệ giữa tổng lượng cacbon và tổng lượng nitơ có trong thành phần nguyên liệu có thể được vi sinh vật sử dụng trong quá trình phân huỷ nguyên liệu. Đối với quá trình làm phân ủ thì tỷ lệ C/N là 30/1. Tỷ lệ C/N lớn hơn 50/1 sẽ kéo dài quá trình ủ. Nếu tỷ lệ C/N thấp thì nitơ sẽ bị mất đi dưới dạng khí N2 hoặc NH3 hoặc trong điều kiện thuận lợi thì bị oxy hoá thành nitrit, nitrat. Tỷ lệ C/N quá thấp thì sản phẩm được bón vào đất có thể gây hại cho cây trồng và xuất hiện hiện tượng “đói nitơ” của cây. Người ta có thể tăng thêm nitơ cho đống ủ bằng cách trộn thêm các nguồn chất hữu cơ giàu nitơ như bùn thải hoạt tính, các phần rễ cây họ đậu, bèo lục bình, chất thải lò mổ,... Nhiệt độ và sự biến động của vi sinh vật: Theo Goluek giải nhiệt độ tối thích nhìn chung là 35-:-550C bởi vì có nhiều loại vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu cho sự oxy hoá hợp chất hữu cơ thành CO2 và nước là 600C. Theo Finstein và cộng sự thì nấm và vi khuẩn sinh axit xuất hiện ở giai đoạn nhiệt độ 25-:-300C, khi nhiệt độ tăng hơn 400C chúng được thay thế bởi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt. Vi khuẩn ưa nhiệt có bào tử phát triển ở nhiệt độ quá 700C, sau cùng khi nhiệt độ hạ xuống thì nấm và vi khuẩn ưa ấm sẽ xuất hiện trở lại. Phần ii: nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu II.1. Nguyên vật liệu Bã dâu nhận được sau khi xử lý ép tách dịch quả dâu sử dụng trong sản xuất rượu vang. Các chủng vi sinh vật được lựa chọn từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học. Hoá chất: CMC (cacboxyl metyl celluloza). Pepton Cao nấm men Agar Và các chất vô cơ khác. Thiết bị: Cân điện tử Máy đo pH Nồi hấp thanh trùng Tủ ấm, tủ cấy, buồng cấy vô trùng. II.2. Môi trường nghiên cứu II.2.1. Môi trường giữ giống Môi trường vi khuẩn: CMC : 5g Pepton : 7g NaCl : 3g Cao nấm men : 3g Agar : 20g Nước cất : 1000 ml PH : 7 Môi trường xạ khuẩn: K2HPO4 : 0,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KNO3 : 1g NaCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,1g Tinh bột tan : 20g Agar : 20g Nước cất : 1000 ml pH : 7 Môi trường nấm mốc: Saccaroza : 30g NaNO3 : 2g KH2PO4 : 1g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g Agar : 20g Nước cất : 1000 ml pH : 7 II.2.2. Môi trường nhân giống nấm mốc Saccaroza : 30g NaNO3 : 2g KH2PO4 : 1g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g Nước cất : 1000 ml Pepton : 1g pH : 7 Ghi chú: Các môi trường được khử trùng hơi nước ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 20 phút. II.3. Các phương pháp phân tích II.3.1. Xác định hoạt tính xenlulaza của vi sinh vật Tách chiết enzym: Để thu enzym từ môi trường nuôi cấy đặc: Cân 5g mẫu nuôi, nghiền nhỏ, cho vào bình định mức 100 ml với 70 ml nước cất. Để vào tủ ấm 300C trong 30 phút (thỉnh thoảng lắc), định mức đến vạch, lắc đều, lọc. Dịch trong thu được là dịch enzym thô để dùng cho các thí nghiệm. Nếu là môi trường lỏng thì chỉ cần lọc bỏ sinh khối là thu được dịch enzym thô. Xác định hoạt tính xenlulaza (hiển thị bằng hoạt tính CMC_aza): Theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Hoà tan 20g thạch và 1g CMC bằng cách đun nóng trong 500 ml nước cất. Sau đó thêm 500 ml dung dịch đệm xitrat_photphat 0,2M pH=5. Đổ dịch lỏng vào các hộp Petri với bề dày 3mm. Dùng khoan đục lỗ tròn với đường kính 7mm. Nhỏ vào lỗ 0,1 ml dịch enzym, lỗ đối chứng nhỏ nước cất. Để vào tủ lạnh trong 12 giờ cho enzym khuếch tán. Sau đó cho vào tủ ấm 400C trong 6 giờ để cho enzym tác dụng với cơ chất (CMC). Cho vào mỗi đĩa 5 ml dịch Lugol, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết dịch Lugol đi. Đo vùng CMC bị phân giải xung quanh lỗ. Hoạt tính CMC _ aza biểu thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ khoan: D-d (mm). II.3.2. Xác định độ ẩm nguyên liệu Cân chính xác 10g mẫu trên cân phân tích cho vào hộp nhôm đã được sấy khô tuyệt đối. Đặt hộp nhôm có chứa mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 100-:-1050C, khi sấy phải mở nắp hộp nhôm ra. Sau 2-:- 3 giờ sấy, cân khối lượng mẫu một lần, sấy cho đến khi cân thấy khối lượng mẫu giữa hai lần cân không chênh nhau quá 0,05g thì dừng lại. Đậy nắp hộp nhôm, cho vào bình hút ẩm, để nguội mẫu đến nhiệt độ phòng, đem cân hộp nhôm và mẫu. Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: W(%) =x100 Trong đó : m1 – khối lượng hộp nhôm và mẫu trước khi sấy (g). m2 – khối lượng hộp nhôm và mẫu sau khi sấy (g). m – khối lượng mẫu đem phân tích (g). II.3.3. Xác định hàm lượng xenluloza của nguyên liệu Cân 1g mẫu vật đã được nghiền nhỏ và sấy khô đến trọng lượng không đổi vào bình tam giác 250ml. Thêm vào bình 16,5ml hỗn hợp gồm 1,5ml axit Nitric và 15ml axit axetic băng. Gắn bình với ống sinh hàn, đun sôi mạnh hỗn hợp trong thời gian 30 phút, để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước cất nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa xenluloza nhiều lần bằng nước cất nóng (10-:-15ml một lần), sau cùng rửa bằng rượu etylic 96% từ 1-:-2 lần và cuối cùng bằng dietyl ete. Giấy lọc có kết tủa xenluloza đem sấy khô đến trọng lượng không đổi. Hàm lượng xenluloza được tính: X = Trong đó: X – hàm lượng xenluloza (%). a – trọng lượng xenluloza (g). m – trọng lượng mẫu vật (g). II.3.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng số của nguyên liệu bằng phương pháp Kendan Lượng nitơ (azot) tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được xác định bằng phương pháp Kendal. Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu. Nguyên tắc Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị ôxi hoá. Cacbon và hidrô tạo thành CO2 và H2O còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: R- CH- COOH NH2 + H2SO4 NH3 + SO2 + H2O 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu nó bằng một lượng dư axit boric H3BO3: (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 chuẩn, qua đó dễ dàng tính được lượng nitơ có trong mẫu vật. (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 4H3BO3 Hoá chất cần dùng H2SO4 đậm đặc NaOH 30 – 40% K2SO4 tinh thể CuSO4 tinh thể Dung dịch H3BO3 3% Chỉ thị Taxiro: hỗn hợp (2:1) của hai dung dịch metyl đỏ 0,1% trong rượu và metylen xanh 0,1% trong rượu etylic. Dung dịch H2SO4 0,1N H2O2 30%. Tiến hành Chuẩn bị và phá mẫu: Lấy một lượng chính xác mẫu cần phân tích, chuyển vào bình Kendal, thêm vào đó 10ml H2SO4 đậm đặc và 0,5 gam hỗn hợp xúc tác. Sau đó, đậy bình bằng phễu thuỷ tinh và tiến hành phá mẫu trên thiết bị (theo chương trình định sẵn). Quá trình phá mẫu kết thúc khi dung dịch trong bình màu xanh hoàn toàn trong suốt, để nguội. Tráng sạch phễu và cổ bình bằng 10-15ml nước cất. Chưng cất thu NH3: Đặt bình Kendal và đúng vị trí trong bộ cất đạm. Hút 10ml dung dịch H3BO3 3% cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào đó vài giọt chỉ thị Taxiro và đặt vào đúng vị trí hứng dịch chưng cất trong bộ cất đạm. Kiểm tra cẩn thận đường cấp nước cất, NaOH 40% và đường nước làm lạnh. Tiến hành cất đạm theo chương trình đã cài sẵn. Quá trình cất kết thúc khi xuất hiện mầu nâu trong bình Kendal. Chuẩn độ tetraborat amôn Định phân lượng tetraborat amôn tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Tính kết quả X = Trong đó: X – Hàm lượng nitơ tổng số (% hay g/l). a – Lượng H2SO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm. m – Lượng mẫu vật đem vô cơ hoá (gam hay ml). 1,4 – Số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N. 100 – Hệ số chuyển thành %. II.3.5. Xác định hàm lượng cacbon hữu cơ Dựa theo phương pháp xác định chất mùn. Xác định cacbon hữu cơ: Nguyên tắc: Phân tích mùn theo phương pháp Tiurin. Mùn được oxy hoá bằng Kalibicromat. Theo lượng bicromat đã tiêu thụ mà tính ra lượng mùn hay hàm lượng cacbon hữu cơ. 3C + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 = 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 8H2O +3CO2 K2Cr2O7 + 7H2SO4 + 6 FeSO4 = Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 7H2O Cách tiến hành: Cân chính xác 0,2g mẫu cho vào bình tan giác 100ml, cho từ từ 10ml K2Cr2O7 0,4N vào bình. Lắc nhẹ, đậy bình bằng phễu con, đun sôi ở nhiệt độ 145-:-1550C trong thời gian 30 phút. Để nguội, thêm 10-:-20ml nước cất, cho 4 giọt axit fenil antranilic 0,2% vào, chuẩn độ bằng muối Mo 0,2N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu tím đậm sang màu xanh lá cây. Tiến hành đồng thời mẫu trắng với mẫu thí nghiệm. Tính toán: Thành phần phần trăm Chữu cơ có trong nguyên liệu được tính theo công thức sau: Chữu cơ = (10.N1 – b.N2).3.100/n (%