Đề tài Nghiên cứu Starter của nấm mốc Actinomucor elegans và bước đầu ứng dụng trong sản xuất Chao với quy mô công nghiệp

ôi trường có chứa muối, không những có thể phục hồi được một lượng lớn hoạt tính của enzyme trong dịch lọc mà còn làm tăng cao tổng hoạt tính của protease, vì quá trình tách liên tục protease khỏi bề mặt hệ nấm sẽ làm cho vi sinh vật có thể tổng hợp được nhiều enzyme protease hơn. -13- Khi nghiên cứu, nấm mốc được phát triển trên môi trường có nồng độ muối thấp, do đó các protease sẽ bám trên hệ sợi, từ đó ta có thể nghiên cứu vị trí của các enzyme trước khi được tách ra, và có thể hiểu được quá trình ngâm muối trong lên men chao. Giải phóng các protease cố định trên bề mặt hệ nấm. Trong quá trình lên men chao, nấm mốc được cố định trên bề mặt khối tàu hủ, nhưng hệ nấm không thể thâm nhập sâu vào khối này, mặt khác các enzyme của nấm mốc tiết ra không phải là enzyme ngoại bào, do đó mà chúng chỉ liên kết lỏng lẻo với hệ nấm bằng các liên kết ion. Vì vậy, các enzyme này dễ dàng bị tách rửa bởi Natri Clorua hay các dung dịch muối ion khác, từ đó các protease này sẽ thấm vào đậu hủ đã lên mốc và tiến hành phân giải protein. -14- Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT STARTER MỐC Actinomucor elegans 3.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nguyên liệu : - Giống Actinomucor elegans được lấy từ Phân viện Công nghiệp Thực phẩm TP HCM. - Bột gạo. - Bột mì. - Bã đậu nành. - Cám gạo ,… 3.1.2 Hóa chất sử dụng: Hóa chất chúng tôi sử dụng là tinh khiết, đảm bảo tính chính xác, sai số trong giới hạn cho phép: - Polyphosphate - Natri clorua (NaCl) - Cồn 900 - Agar - Natri hydroxit (NaOH) - Bạc nitrat (AgNO3) - Kali cromat (K2Cr2O4) - Erther khan - Acid sunphuric (H2SO4) - Acid perchloric (HClO4) - Formol - Phenolphtalein... -15- 3.1.3 Thiết bị - dụng cụ thí nghiệm: Thiết bị tiệt trùng, tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, kính hiển vi, cân phân tích, máy đo pH, dụng cụ cất đạm, dụng cụ chiết béo, một số dụng cụ thí nghiệm thông thường khác tại phòng thí nghiệm Vi Sinh và Hóa Lý, thuộc Khoa Công Nghệ Hoá Học Thực Phẩm – Trường Đại Học Lạc Hồng. 3.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU: * Thuyết minh sơ đồ: Mốc giống sau khi nhận về chúng tôi cho cấy chuyền sang ống nghiệm chứa môi trường Malt đặc, khoảng 3-4 ngày cấy chuyền chúng tôi tiến hành nhân giống nấm mốc vào các loại môi trường khác nhau, khảo sát loại môi trường thích hợp để nhân giống nấm mốc. Sau khi chọn được môi trường thích hợp thì tiến hành khảo sát môi trường và cách tối ưu giữ bào tử nấm mốc. Mốc giống Môi trường giữ bào tử mốc Nhân giống Trộn đều Tạo hình Sấy Viên mốc -16- 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy và nhân giống vi sinh vật: [7] 3.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: * Chuẩn bị môi trường: - Malt sau khi xay được trộn với nước (tỷ lệ 1:4), sau đó đem đun cách thủy 40 - 450C khoảng 30 phút, tiếp theo nâng nhiệt độ lên 70 - 750C và duy trì khoảng 30 phút, trong quá trình đun cần khuấy đều. - Lọc dung dịch trên, thu được dung dịch trong, cân 1,5 - 2% agar cho vào, khuấy đều và đun sôi. - Sau đó rót nóng vào ống nghiệm (hoặc đĩa Petri) bịt kín ống nghiệm bằng bông không thấm và đem tiệt trùng ngay ở 1210C trong 30 phút. - Sau khi tiệt trùng, đối với thạch nghiêng cần đặt ống nghiêng khi môi trường còn nóng và để yên cho tới khi nguội. - Bảo quản môi trường đã đông đặc trong tủ lạnh ở vị trí lật ngược. * Gieo cấy và nuôi vi sinh vật: - Chuẩn bị ống nghiệm chứa mốc giống và ống nghiệm chứa môi trường mới. - Cầm que cấy ở tay thuận và tiệt trùng que cấy bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi que nóng đỏ. - Mở nắp ống nghiệm gốc kẹp nút bông, hơ nút bông và miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn. Luôn giữ miệng ống nghiệm đang mở nằm nghiêng và gần ngọn lửa đèn cồn. - Tiếp theo làm tương tự với ống sẽ cấy chuyền. - Sau đó sử dụng que cấy chạm nhẹ vào lên bề mặt thạch của ống nghiệm gốc để lấy vi sinh vật và chuyển sang môi trường mới. - Rút que cấy ra và hơ trên ngọn lửa đèn cồn để vô khuẩn. -17- - Hơ lần lượt miệng ống nghiệm và nút bông qua ngọn lửa đèn cồn sau đó đậy ống nghiệm lại. - Sau đó dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy bao gồm: tên vi sinh vật, ngày gieo cấy, môi trường cấy chuyền. - Ống môi trường vừa gieo cấy xong được chuyển vào tủ ấm được nuôi ở điều kiện thích hợp. 3.3.1.2 Phương pháp nhân giống vi sinh vật: Mục đích: nhằm tạo ra giống trung gian dùng để sản xuất viên mốc. 3.3.1.3 Cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc: [7] - Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml: + Bình 1 chứa 99ml nước cất vô trùng. + Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì. - Cân 1 g mẫu, nghiền nát mẫu. - Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2. - Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu. - Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít. - Ghi vào đáy đĩa Petri có môi trường thạch các thông tin: + Nồng độ pha loãng. + Ngày cấy. - Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượt quá vài trăm. - Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 - 72 giờ. -18- - Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính. • Cách tính kết quả: ™ Trường hợp 1: Chỉ có 1 hộp Petri có số khuẩn lạc từ 25 - 250, tất cả các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên. Khi đó ta chọn hệ số pha loãng tương ứng với hộp Petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250 để tính kết quả: Trong đó: + N - Số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu (CFU/g). + C1, C2 – Số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp Petri ở độ pha loãng đã chọn. + d - Hệ số pha loãng mẫu. ™ Trường hợp 2: Chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp Petri có số khuẩn lạc dao động từ 25-250. Tất cả các hộp Petri ở các độ pha loãng khác đều có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên. Khi đó ta chọn độ pha loãng nói trên để tính kết quả: Trong đó: + N - Số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu + C1, C2 – Số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp Petri ở độ pha loãng đã chọn. + d - Hệ số pha loãng mẫu. ™ Trường hợp 3: Ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp Petri có số khuẩn lạc dao động từ 25 - 250. Khi đó, ta phải tính kết quả cho từng độ pha loãng. d CCN 2 21 += d CCN 2 21 += -19- • Nếu kết quả thu được ở hai độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn, áp dụng công thức dưới đây để tính kết quả cuối cùng: Trong đó: + N - Số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu. + C - Số khuẩn lạc đếm được trên các hộp Petri đã chọn. + n1, n2 – Số hộp Petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai. + d - Hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất. • Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau lớn hơn 2 lần, sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để tính kết quả. ™ Trường hợp 4: Tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25. Khi đó ta chọn độ pha loãng thấp nhất để tính kết quả. ™ Trường hợp 5: Tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn 250. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả. ™ Trường hợp 6: Không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri. Khi đó, ta sẽ ghi kết quả có ít hơn ( d 11× ) khuẩn lạc, trong đó d là hệ số pha loãng thấp nhất. 3.3.2 Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm: [3] Để đánh giá chất lượng sản phẩm thông thường xét về 3 mặt: cảm quan, vi sinh, hóa lý. ™ Chỉ tiêu cảm quan: ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp cho điểm theo Tiêu chuẩn Việt Nam. Ngoài ra, chúng tôi còn cho thực hiện điều tra thị hiếu người tiêu dùng đối với sản phẩm chao và tiến hành so sánh với sản phẩm ngoài thị trường theo phép thử 2-3. ( )dnn CN 21 1,0+ ∑= -20- ™ Chỉ tiêu vi sinh: Thực hiện kiểm tra một số vi sinh vật cơ bản của thực phẩm như: tổng số vi khuẩn hiếu khí, Coliform , E.coli…Dựa vào chỉ tiêu này, người ta có thể dự đoán được thời gian bảo quản sản phẩm. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc. Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Mặc dù vẫn còn một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Ngoài ra phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng rộng rải trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm. ™ Chỉ tiêu hóa lý: • Mục đích kiểm tra hóa lý: ¾ Thực phẩm có đáp ứng các tiêu chuẩn hóa học về phẩm chất và thành phần dinh dưỡng theo đúng như quy định. ¾ Thực phẩm có đáp ứng các tiêu chuẩn hóa học về vệ sinh, hư hỏng hoặc bị biến chất. • Kiểm nghiệm hóa lý thực phẩm chỉ là một khâu trong công tác kiểm nghiệm thực phẩm nói chung, để xác định chính xác phẩm chất và chất lượng thực phẩm cần phân tích trạng thái cảm quan và vi sinh vật. ¾ Xác định hàm lượng đạm tổng bằng phương pháp Kjeldahl. ¾ Xác định đạm formol theo phương pháp formol ¾ Xác định đạm amoniac theo phương pháp Kjeldahl nhưng bỏ qua giai đoạn vô cơ hóa mẫu. ¾ Xác định hàm lượng muối Natri Clorua bằng phương pháp trực tiếp. ¾ Xác định độ chua theo phương pháp trung hòa với phenolphtalein làm chỉ thị màu. ¾ Xác định hàm lượng béo theo phương pháp trích ly soxhlet. -21- ¾ Xác định hàm ẩm theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. ¾ Xác định hàm lượng tro theo phương pháp nung thành tro trắng. 3.4. Bố trí thí nghiệm: 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường để nhân giống nấm mốc Actinomucor elegans. * Thuyết minh sơ đồ: Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng có chứa mốc giống như đã trình bày ở trên. Chuẩn bị môi trường thí nghiệm trong bình tam giác: + Cơm, bã đậu nành và cám được làm chín. Để nguội, mỗi loại cho vào một bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm rồi đậy nút bình bằng bông gòn không thấm. + Tiệt trùng các bình tam giác ở 1210C trong vòng 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ 30 ÷ 350C. * Sơ đồ khảo sát môi trường nhân giống Cấy chuyền Ống mốc giống Môi trường thạch nghiêng Nước vô trùng Nuôi ở 25-300C Trộn đều bào tử Môi trường thí nghiệm trong bình tam giác Cấy chuyền Nuôi mốc Kết quả T0 phòng (25÷300C) -22- Cấy chuyền từ ống nghiệm ra bình tam giác. Cho 1÷ 2ml nước vô khuẩn vào ống nghiệm, lắc đều rồi đổ vào môi trường trong bình tam giác. Nuôi ở nhiệt độ phòng (25 ÷300C) trong 48 ÷ 72 giờ. 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát số lượng bào tử của nấm mốc Actinoucor elegans trong môi trường nhân giống theo thời gian. * Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị môi trường trong bình tam giác: Chúng tôi chọn bã đậu nành làm môi trường nhân giống. Cho môi trường vào bình tam giác rồi đậy bằng bông không thấm. Sau đó, đem tiệt trùng 1210C trong 30 phút, sau đó để nguội, nhân giống từ ống nghiệm ra bình tam giác. Sử dụng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc để xác định số lượng bào tử từ 0 ÷ 10 ngày sau khi cấy. Thời gian nào bào tử không tăng số lượng thì đó là thời điểm thu bào tử. 3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường để giữ bào tử nấm mốc Actinomucor elegans trong viên mốc. Môi trường trong bình tam giác Cấy chuyền Nuôi mốc Đếm số lượng bào tử Kết quả Ống mốc giống Thời gian:0÷10 ngày T0 phòng (25÷300C) -23- Chọn 3 loại bột: bột gạo, bột mì, bột nếp. Tiến hành nhào bột với các tỷ lệ hồ:bột:nước:bào tử mốc khác nhau và tạo hình theo quy trình trên. Quan sát trạng thái, cấu trúc, màu sắc viên mốc và sự phát triển của nấm mốc. 3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình sấy đến viên mốc. Sau khi xác định được thời gian thu bào tử và môi trường thích hợp để giữ viên mốc chúng tôi tiến hành tạo hình và sấy viên mốc ở 3 nhiệt độ sấy khác nhau : 500C, 550C, 600C. 3.4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra khả năng sinh trưởng của bào tử trong viên mốc theo thời gian bảo quản. Viên mốc Sấy Tiến hành quan sát Kết quả Định lượng Bào tử mốc Bột + hồ Nước Nhào trộn Tạo hình Viên mốc chưa sấy polyphosphate -24- * Điều kiện bảo quản: Viên mốc sau khi sấy được xếp vào khay và đóng gói chân không, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát và chúng tôi tiến hành khảo sát số lượng bào tử và độ ẩm của viên mốc theo thời gian bảo quản. * Thuyết minh sơ đồ: Chúng tôi tiến hành lấy 3 viên mốc trước và sau khi sấy nghiền, pha loãng tiến hành cấy, sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc để xác định số lượng bào tử. Tương tự cứ cách 5, 10, 15, 20, 25, 30… ngày đều lấy 3 viên mốc nghiền và tiến hành đếm lượng bào tử tương tự. 3.4.6 Thí nghiệm 6: Ứng dụng viên mốc trong sản xuất chao [11] Viên mốc Nghiền mịn Phân lập Cấy trên đĩa petri Đếm số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch Kết quả * Sơ đồ phương pháp cấy gạt trên môi trường đặc -25- * Thuyết minh sơ đồ : Bánh đậu thu được đem cắt khối, kích thước thông thường khối 2cm, có thể thay đổi tùy thị hiếu người tiêu dùng. Mục đích việc này là tăng diện tích bề mặt nuôi mốc. T= 1000C Chao Nước muối + Rượu Đậu phụ Cắt khối Xử lý nhiệt Cấy mốc Nuôi mốc Cho vào lọ Lên men Ủ chín Nghiền Viên mốc T= 25-300C T= 25-300C -26- Trước khi cấy mốc, bánh đậu cần được xử lý nhiệt để tiêu diệt vi sinh vật tạp nhiễm. Có thể chần nước sôi hoặc sấy ở 100oC trong 15 phút. Mốc chao sau khi đã được sản xuất ở dạng bào tử, cấy trực tiếp vào bánh đậu không cần phải thêm chất dinh dưỡng nào khác. Lượng giống mốc cho vào theo tỉ lệ 1kg đậu phụ cần dùng 10g (3 viên mốc) mốc bào tử. Nếu cho mốc bằng phương pháp thủ công thì lượng giống mốc phải nhân với hệ số 0,2–0,3. Sau khi cấy mốc xong thì phải đảm bảo nuôi ở nhiệt độ 25–300C, hàm ẩm không khí là 90% ở những giờ đầu. Sau 14–16 giờ nuôi, trên bề mặt đậu xuất hiện những khuẩn ty màu trắng ta phải đưa hàm ẩm lên 95%. Ở những giờ cuối nuôi mốc cần phải làm giảm hàm ẩm xuống để hạn chế sự phát triển của nấm mốc, vì nếu mốc quá tốt (khuẩn ty dài trên 2.5cm) sẽ có hoạt lực enzyme quá cao, thủy phân protein quá mạnh, làm cho chao nặng mùi không hợp với thị hiếu người tiêu dùng. Đối với khí hậu nước ta, kinh nghiệm trong sản xuất thường điều chỉnh hàm ẩm của bầu không khí xung quanh bánh đậu nuôi mốc bằng cách: 5 giờ đầu phủ xô màn ướt lên các giá mốc, sau 12 giờ nhúng nước khăn một lần. 28 – 30 giờ sau, bỏ khăn ẩm để giảm ẩm tránh tình trạng kéo dài thời gian nuôi, đồng thời khống chế được hàm lượng men cho phù hợp với yêu cầu của công nghệ sản xuất. Khống chế hàm ẩm thích hợp với điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm mốc là vấn đề hết sức phức tạp, phải nắm vững 3 yếu tố có liên quan mật thiết với nhau để điều chỉnh cho thích hợp. + Hàm ẩm của bánh đậu sau khi ép. + Hàm ẩm của phòng nuôi mốc. + Hàm ẩm của không khí. Đặc biệt những tháng hạn khô, độ ẩm của không khí có khi xuống tới 60 – 70% phải tăng cường độ ẩm, những tháng ẩm ướt phải tùy theo thời gian sinh trưởng của mốc mà khống chế hàm ẩm của phòng nuôi cho thích hợp. Nói chung độ ẩm của không khí thấp thì mốc sẽ cằn cỗi, nếu độ ẩm cao nuôi sẽ -27- không đúng thời gian quy định, mốc sẽ lâu già làm cho các khâu trong dây chuyền sản xuất không nhịp nhàng. Khi thấy mốc chuyển từ màu trắng sang màu vàng là kết thúc giai đoạn nuôi mốc. Ướp nước muối: ¾ Mục đích: ngừng sự phát triển của nấm mốc, chuẩn bị chuyển sang lên men. ¾ Phương pháp thực hiện: Đậu phụ chao lên mốc được chuyển vào các hũ, chuẩn bị dung dịch muối có nồng độ 20% và cho vào bánh đậu đã lên men. Lên men : Sau nuôi mốc, lên men là công đoạn rất quan trọng, giai đoạn này quyết định chất lượng của sản phẩm. Trong giai đoạn này các enzyme của nấm mốc sẽ tham gia hàng loạt các phản ứng sinh hóa, mà chủ yếu là protease với sự thủy phân protein thành các acid amin, lipid và các ester thơm, tạo thành các sản phẩm và hương vị đặc trưng cho chao. Hương vị này do 4 nhóm chính tạo nên: các acid amin và NH3, các sản phẩm thủy phân protein, các acid béo và methylacetone. -28- Chương 4: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT QUẢ: 4.1.1 Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát các loại môi trường để nhân giống nấm mốc Bảng 4.1: Kết quả khảo sát các loại môi trường để nhân giống nấm mốc Các loại môi trường Cơm Bã đậu nành Trấu Ngày Số bào tử trong 1 g ×108(CFU/g) Trạng thái Số bào tử trong 1 g ×108(CFU/g) Trạng thái Số bào tử trong 1 g ×108(CFU/g) Trạng Thái 0 0,85 Hơi nhão 0,85 Hơi khô 0,85 Khô 1 0.86 Nhão 0,87 Xốp 0,85 Khô 2 2,21 Nhão nhiều 2,52 Xốp 1,34 Khô 3 2,44 Nhão 2,71 Xốp 1,67 Khô 4 2,5 Rất nhão 2,73 Xốp 2,04 Khô Biểu đồ phát triển của nấm mốc trên các loại môi trường 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 1 2 3 4 5 Thời gian ( ngày) Số lư ợ ng b ào từ Cơm Bã đậu nành Trấu ×108 (CFU/g) Biểu đồ 4.1: Biểu đồ phát triển của nấm mốc trên các loại môi trường -29- Sau khi khảo sát chúng tôi nhận thấy rằng trong môi trường cơm thì khi nấm mốc phát triển độ ẩm của môi trường tăng lên rất nhanh, cơm dễ bị phân hủy, số lượng bào tử trung bình do cơm không chứa nhiều protein, bên cạnh đó cơm cũng có giá thành cao. Đối với môi trường trấu thì giá thành rẽ, độ ẩm môi trường rất thích hợp cho mốc phát triển nhưng trấu không có đầy đủ chất dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển mạnh nên số lượng bào tử phóng ra rất ít, không đạt yêu cầu. Từ kết quả trên chúng tôi chọn môi trường bã đậu nành làm thành phần chính để nhân giống nấm mốc với những ưu điểm sau: + Là môi trường giàu chất dinh dưỡng đặc biệt là protein thích hợp cho nhân giống mốc. + Số lượng bào tử nấm mốc phát triển nhanh. + Tỷ lệ bào tử, khả năng sống và nảy mầm của bào tử cao. + Giá thành rẻ. 4.1.2 Thí nghiệm 2: Kết quả khảo sát thời gian phát triển bào tử của nấm mốc Bảng 4.2: Kết quả khảo sát thời gian phát triển bào tử của nấm mốc Ngày Số bào tử trong 1g môi trường (× 108) 0 0,85 1 0,87 2 2,52 3 2,71 4 2,73 5 2,65 6 2,35 7 2,26 -30- Biểu đồ 4.2: Biểu đồ khảo sát thời gian phát triển của nấm mốc Biểu Đồ khảo sát thời gian phát triển bào tử của nấm mốc 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thời gian (ngày) Số lư ợ ng b ào tử Sau khi chúng tôi cho một lượng bào tử vào môi trường nhân giống thì tiến hành xác định số lượng bào tử ban đầu, và tiếp tục theo dõi số lượng bào tử vào các ngày tiếp theo, ngày 1-2 thì nấm mốc còn trong giai đoạn thích nghi chưa phóng bào tử nhiều, đến ngày thứ 3-4 thì số lượng bào tử tăng nhanh do nấm mốc đã thích nghi với môi trường mới, đây là giai đoạn tăng trưởng của nấm mốc. Vào ngày thứ 5-6 thì số lượng bào tử hầu như không tăng hoặc tăng rất ít, đây là giai đoạn ổn định của nấm mốc. Chúng tôi tiếp tục khảo sát từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 thì nhận được kết quả là số lượng bào tử có xu hướng giảm dần. Từ kết quả khảo sát cho thấy bào tử thu được cao nhất và nhanh nhất vào khoảng ngày thứ 3-4 sau khi nhân giống và ngày thứ 5 thứ 6 hầu như lượng bào tử không tăng, sau đó giảm dần. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian thu bào tử sau 3-4 ngày sau khi nhân giống. 8 2,04 9 1,75 10 1,58 ×108 (CFU/g) -31- 4.1.3 Thí nghiệm 3: Kết quả khảo sát các loại môi trường để giữ bào tử mốc. Bảng 4.3: Kết quả khảo sát các loại môi trường để giữ bào tử mốc Tên Bột Tính chất Bột gạo Bột mì Bột nếp Màu sắc Trắng Trắng ngà Trắng Trạng thái Kích thước lớn nhỏ Bột mịn Bột mịn Khâu nhào trộn Dễ nhào Dễ nhào Dễ nhào Trước khi sấy Định hình Dễ tạo hình Có lỗ khí ở trong Không tạo hình được Độ cứng Vừa phải Rất cứng Không khảo sát Sau khi sấy Cấu trúc sau khi nghiền Dễ nghiền, tơi xốp, khả năng phân tán bào tử mốc cao Cứng, khó nghiền, vón cục, khó phân tán bào tử mốc Không khảo sát Sau khi chúng tôi chọn được 3 loại bột thì tiến hành nhào trộn, với bột nếp thì khả năng dịch hóa cao nhất nên khi nhào xong thì không tạo hình được, còn bột mì thì khâu nhào trộn tốt, tạo hình tốt nhưng khi chúng tôi tiến sấy thì viên mốc rất cứng do trong quá trình nhào trộn thì cấu trúc khối bột hình thành rất chặt chẽ, khó nghiền. Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng: trong ba loại bột trên thì bột gạo nhào trộn dễ, do cấu trúc ít chặt chẽ hơn bột mì, sau khi sấy dễ nghiền, chính vì -32- vậy sau khi nghiền khả năng phân tán bào tử mốc tốt hơn. Do đó, chúng tôi chọn bột gạo làm thành phần chính giữ bào tử nấm mốc. Trong quá trình làm viên mốc, chúng tôi nhận thấy nếu chỉ sử dụng bột gạo thì khi sấy đến độ ẩm thích hợp, viên mốc dễ bị nứt nẻ. Vì vậy, chúng tôi quyết định bổ sung thêm hồ và polyphotphat với mục đích: giữ nước và làm bề mặt viên mốc không bị nứt. Tiếp theo chúng tôi khảo sát tỷ lệ hồ, polyphotphat cho vào và được kết quả dưới đây: Bảng 4.4: Kết quả khảo sát tỷ lệ bột gạo và hồ Tỷ lệ giữa bột gạo và hồ Đặc điểm 6:4 7:3 8:2 Màu sắc Trắng Trắng Trắng Mùi Tốt Tốt Tốt Nhào trộn, tạo hình Khó Dễ Dễ Khả năng giữ nước Không khảo sát Tốt Thấp Sau khi bổ sung thêm hồ vào thì lượng nước liên kết trong viên mốc sẽ tăng lên, làm cho viên mốc không nứt, chúng tôi chọn 3 mức tỷ lệ giữa bột gạo và hồ thì với tỷ lệ 6:4 khối lượng hồ quá cao khâu nhào trộn tạo hình rất khó, với tỷ lệ 8:2 thì viên mốc khô, nứt nẻ do lượng hồ không đủ giữ độ ẩm thích hợp cho viên mốc. Kết quả cho thấy với tỷ lệ 7:3 là tốt nhất, khả năng giữ nước tốt hơn do lượng nước liên kết còn giữ lại. Tuy kết quả sau khi phối trộn hồ vào viên mốc khả năng giữ nước tăng lên nhưng vẫn chưa thích hợp, viên mốc còn nứt ít, vì không thể thêm lượng hồ được do ảnh hưởng đến khâu nhào trộn nên chúng tôi cho bổ sung thêm polyphotphat vào để tăng cường khả năng giữ nước. -33- Bảng 4.5: Kết quả khảo sát tỷ lệ Polyphotphate Tỷ lệ polyphotphat (%) Đặc điểm 1% 1.5% 2% 2.5% Khả năng giữ nước Viên mốc cứng Viên mốc hơi cứng Viên mốc xốp Viên mốc mềm, ẩm nhiều, dễ vỡ Kết quả trên cho thấy với tỷ lệ bột : hồ (7 : 3) cùng với 2% polyphotphate là tốt nhất. Mốc vừa giữ nước tốt vừa mềm xốp dễ nghiền, khả năng phân tán bào tử đều. Trong quá trình làm viên mốc, chúng tôi nhận thấy nếu chỉ sử dụng bột gạo hồ và polyphosphate thì khi sấy đến khối lượng không đổi thời gian sấy dài, tốn năng lượng. Vì vậy, chúng tôi quyết định bổ sung thêm cám gạo với lý do giảm thời gian sấy, tăng thêm độ tơi xốp của viên mốc. Bảng 4.6: Kết quả khảo sát tỷ lệ cám Tỷ lệ cám (%) Đặc điểm 3 5 7 Nhào trộn Dễ Dễ Dễ Hình dạng Không nứt Không nứt Không nứt Màu sắc Trắng Trắng ngà Hơi Vàng Độ cứng Cứng Dễ nghiền Dễ nghiền Mùi Ít mùi cám Mùi cám nhẹ Mùi cám gắt Chúng tôi chọn 3 tỷ lệ 3, 5, 7% để khảo sát. Với cám 3% thì thời gian sấy không giảm được nhiều và viên mốc còn cứng do cám quá ít không phân tán hết thể tích viên mốc. Với cám 7% thì lượng cám quá nhiều ảnh hưởng đến màu sắc của viên mốc do cám có màu vàng nâu, ngoài ra cám còn có mùi đặc trưng nên khi cho vào quá nhiều thì sẽ ảnh hưởng đến mùi sản phẩm chao sau này. -34- Kết quả thu được là tỷ lệ 5% thích hợp nhất, vừa giảm được thời gian sấy, màu ít bị ảnh hưởng và quan trọng nhất là mùi không đáng kể do lượng cám ít và chúng tôi đã tiến hành xử lí cám trước khi sử dụng để làm viên mốc… Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát lượng mốc giống cho vào môi trường để thu được số lượng bào tử thích hợp và sau đây là kết quả: Bảng 4.7: Kết quả khảo sát tỷ lệ mốc giống cho 1 kg viên mốc. Tỷ lệ mốc giống cho 1 kg viên mốc (%) 3 5 7 Số lượng bào tử thu được trước khi sấy (CFU/g) 0,79.1010 1,55. 1010 1,85. 1010 Ảnh hưởng của bào tử mốc tới quá trình lên men chao Không đủ lượng bào tử mốc để len men chao Vừa đủ lượng bào tử lên men Bào tử nhiều, sản phẩm có mùi mốc sau khi lên men Tỷ lệ môi trường nhân giống cho vào càng nhiều thì số lượng bào tử của viên mốc càng tăng nhưng cũng ở mức độ vừa đủ, nếu lượng bào tử nhiều quá thì sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men sau này. Với kết quả trên chúng tôi tiến hành sấy với nhiệt độ thích hợp và đem viên mốc ứng dụng vào ủ chao thì với tỷ lệ 5% là thích hợp nhất. Sau đó chúng tôi khảo sát lượng nước tối thiểu cho vào sau cho đáp ứng được các yêu cầu: dễ nhào, tạo hình đẹp,…và dưới đây là kết quả. Bảng 4.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ nước Tỷ lệ nước (%) Tính chất 15 20 25 Trạng thái Khô Vừa nhão Khâu nhào trộn Khó Dễ Dễ Tạo hình Nứt Tốt Không tạo hình được Độ cứng Cứng Vừa - -35- Với khảo sát trên chúng tôi chọn tỷ lệ nước là 20% cùng với thành phần của viên mốc là: bột gạo:hồ (7:3), polyphotphat 2%, tỷ lệ cám 5%, tỷ lệ mốc giống 5%. 4.1.4 Thí nghiệm 4: Kết quả khảo sát quá trình sấy viên mốc. Với tỷ lệ thành phần như đã khảo sát ở thí nghiệm trên và dựa vào nhiệt độ tới hạn mà bào tử mốc có thể chịu đựng được chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ sấy ở các mức: 5