Đề tài Nghiên cứu sử dụng cây dầu giun làm thuốc bảo vệ thực vật

êu diêt dịch hại (clo hữu cơ, lân hữu cơ, cacbarmat). Phân loại theo cơ chế tác động: Thuốc có tác động tiếp xúc, nội hấp Phân theo dạng chế phẩm: thuốc bột, thuốc dạng dung dịch, dạng hạt 1.3.4. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI Việt Nam được xem là một trong những quốc gia sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nhiều nhất thế giới và trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng có tới hàng trăm tên thương mại khác nhau, trong đó nhiều loại được pha chế ờ các loại hóa chất cực độc và vấn đề quan tâm đối với các loại thuốc này tính độc lại có tính bền vững trong môi trường, sử dụng nhiều thì khả năng tích tụ trong đất càng cao dẫn đến ô nhiễm tầng nước mặt và tầng nước ngầm. Theo Viện Y Học Lao Động và Vệ Sinh Môi Trường qua những nghiên cứu cho thấy “nồng độ hoá chất BVTV đã làm ô nhiễm môi trường vượt tiêu chuẩn cho phép từ 1,33 – 21 lần”. Theo thống kê của Viện Bảo Vệ Thực Vật Việt Nam, năm 1990 lượng thuốc BVTV ở Việt Nam từ 10.300 tấn lên 33.000 tấn đến năm 2003 tăng lên 45.000 tấn và chỉ tính đến năm 2005 đã là 50.000 tấn. Sự lạm dụng hóa chất và sử dụng những loại thuốc BVTV cực độc đã làm cho độ màu mỡ của đất sút giảm, các loài sinh vật có ích bị ảnh hưởng dần dần đất cạn kiệt chất dinh dưỡng và trở thành đất hoang hóa. Lý do để lý giải có thể một phần do sức ép về dân số, bình quân ruộng đất thấp nên cần phải tăng vụ và do vậy, làm tăng khả năng cung cấp thức ăn cho sâu hại, kéo dài thời gian tích luỹ quần thể sâu và làm cho nguy cơ bùng phát dịch luôn hiện hữu. Mặt khác, VN lại có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh hại phát sinh. Việc sử dụng quá mức thuốc hoá học BVTV vừa gây độc cả trực tiếp cho con người, vừa gây hại gián tiếp qua tồn dư còn lại trong sản phẩm nông nghiệp, gây ô nhiếm môi trường. Chính vì vậy, Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) và hầu hết các quốc gia trên thế giới đề quan tâm đến việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật, từ thảo mộc để từng bước thay thế thuốc trừ sâu độc hại và đã thu được nhiều thành công trên cây thuốc cá, cây Xoan tây (neem) và có tính an toàn cao, vừa giảm được chi phí BVTV, lại không tạo sức ép chọn lọc hình thành tính kháng. Đáng chú ý là các chất Matrine (từ cây Khổ sâm), Azadirachtin (từ cây Neem, là một loài Xoan ở Ấn Độ), Rotenone (từ cây Thuốc cá) Từ lâu, con người đã biết dùng thuốc thảo mộc để trừ sâu nhưng gần đây do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng cùng với các tiến bộ về công nghệ, các chất có nguồn gốc thảo mộc trừ sâu ngày càng được phát triển nhanh. Các chất này cũng có hiệu lực diệt sâu nhanh, phổ tác dụng rộng, phòng trừ nhiều loại sâu hại cho nhiều loại cây trồng. Ở nước ta hiện nay các thuốc trừ sâu nguồn gốc thảo mộc cũng đã được đăng ký với nhiều tên thương mại của nhiều đơn vị, trong đó có các chế phẩm Đầu Trâu Jolie (hoạt chất Matrine), Vineem (Azadirachtin), Vironone (Rotenone) Thuốc Đầu Trâu Jolie 1,1SP chứa 11g matrine/1l, là thuốc đặc trị bọ trĩ hại lúa và các cây trồng khác. Sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật có lợi hại ra sao? Có lợi: • Diệt dịch hại nhanh, có khả năng chặn đứng được sự tàn phá của sâu bệnh hại. • Cho kết quả rõ rệt, triệt để. • Thường nâng cao năng suất, phẩm chất nông sản một cách đáng kể. Có hại: • Dễ gây độc cho người sử dụng thuốc. • Để lại dư lượng trong nông sản làm tăng nguy cơ gây hại cho con người và gia súc, gia cầm. • Gây ô nhiễm môi trường sống. • Lưu tồn lâu trong đất, nước, sinh vật. • Gây nên hiện tượng kháng thuốc của sâu hại cần phòng trừ. Việc sử dụng thuốc trừ sâu bằng hóa chất làm ô nhiễm môi trường và có nguy cơ ảnh hưởng tới chất lượng thực phẩm, rau quả gây hại trực tiếp đến gia súc, nhất là sức khỏe con người, để giảm thiểu các tác hại và khắc phục môi trường khỏi ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Các chất độc là các hợp chất thiên nhiên cho nên dễ bị phân hủy sau khi sử dụng, không để lại dư lượng ở trong đất và trong nông sản, ít gây độc hại cho người và môi trường. Tuy nhiên, thời gian xảy ra tác động lâu hơn thuốc trừ sâu hóa chất. Cây dầu giun, nhờ tác dụng diệt giun ký sinh trước đây nên đã có cơ hội phát triển rộng ra khắp thế giới. Gần đây, nhiều quốc gia đã nghiên cứu và phát hiện tinh dầu và một số chất hoá học khác có trong cây dầu giun có khả năng trừ sâu, trừ tuyến trùng, hạn chế sự phát sinh của một số loài nấm Về cơ chế tác động, một số nghiên cứu đã chỉ ra tinh dầu từ cây dầu giun có khả năng tác động đến lớp da ngoài, làm cản trở quá trình hô hấp của côn trùng dẫn đến làm chết côn trùng. Do đây là các chất có nguồn gốc tự nhiên nên dễ phân huỷ trong môi trường và hầu như không để lại dư lượng trên sản phẩm sau khi sử dụng nên đã được một số quốc gia tiên tiến trên thế giới như Mỹ, Đức coi trọng việc ưu tiên sử dụng thay thế các thuốc BVTV độc hại. Một số sản phẩm thuốc BVTV từ cây hay tinh dầu cây DG đã trở thành sản phẩm hàng hoá, được thương mại hoá và được khuyến cáo ưu tiên sử dụng trong các chương trình sản xuất nông sản an toàn GAP. Có thể kể tên thuốc Requirem do Canada sản xuất và đã được cung ứng cho thị trường thuốc BVTV tại Mỹ. Một sản phẩm khác do chính Mỹ sản xuất có tên là ECANA (Extract of Chenopodium ambrosioides near ambrosioides) đã được Cục Bảo vệ Môi trường Mỹ ưu tiên cấp phép sử dụng vì là thuốc có nguồn gốc thảo mộc Tại Việt Nam, dù đã có nhiều cơ quan quan tâm đến nghiên cứu và sản xuất thuốc hoá học BVTV từ thảo mộc như Viện Khoa học Nông nghiệp VN, Viện BVTV nhưng mới chỉ tập trung vào một số cây đã có truyền thống sử dụng như thuốc cá và hầu như chưa có tài liệu nào nghiên cứu về sử dụng cây dầu giun trong BVTV.. 1.4. VÀI NÉT VỀ SÂU: 1.4.1. Sâu có hại: Ở Việt Nam, côn trùng và sâu có trên 1 triệu loài, chiếm khoảng 2/3 số côn trùng và sâu trên thế giới. Trong các loài sâu, ngoài các loài có lợi cho con người, còn có nhiều loài có hại, như chúng phá hoại mùa màng, các loại cây trồng. Theo Đường Hồng Duật có khoảng 123 loài sâu bệnh chủ yếu có hại trên 24 loại cây trồng phổ biến ở Việt Nam. Năm 2004 diện tích trồng rau xanh trên cả nước khoảng 614,5 nghìn ha tương đương với 7% đất sử dụng trong nông nghiệp. Năm 2003 kim nghạch xuất khẩu rau xanh đạt 182,554 triệu USD. Theo tính toán của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn lượng rau xanh bị sâu bọ hại chiếm từ 10-40% sản lượng. Để đảm bảo chất lượng rau, ngày 28/04/1998 Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã ra quyết định số 67-1998/QĐ/BNN – PTNT “Qui định tạm thời về sản xuất rau an toàn”. 1.4.2.2. Sâu quy (Mọt khuẩn nhỏ: Alphitobius diapernis (Panzer 1797) (Coleoptera: Tenebrionidae) ¨ Về phân loại sau quy được phân loại khoa học như sau: Giới động vật Animalia Ngành chân đốt Arthropoda Lớp côn trùng Insecta Bộ cánh cứng Coleoptera Bộ phụ đa thực Polyphaga Họ ánh kim Tenebrionidae Loài sâu quy (mọt khuẩn nhỏ) Alphitobius diaperinus ¨ Hình dạng: • Mọt trưởng thành - dài 6 mm. Mọt trưởng thành mới rụng lông có màu hơi đỏ-nâu chuyển sang đen. • Ấu trùng - dài 7,5 mm. Thon nhỏ, phân đốt và giống như sâu với ba cặp chân rất bé trên ngực và một chân giả ở phía sau bụng. ¨Chu kỳ sống • Mọt cái có thể đẻ ít nhất 110 trứng trong khoảng thời gian một tháng và trứng thwờng nở sau 4-7 ngày. • Ấ́u trùng phát triển trong khoảng 7 tuần, có 8 lần lột xác. Ấu trùng trưởng thành tìm một nơi ẩn náu để phát triển thành nhộng. • Nhộng thường tồn tại khoảng 7 đến 11 ngày trước khi vũ hoá thành mọt trưởng thành. • Mọt trưởng thành có thể sống đến hai năm. ¨ Tập quán • Loài mọt này bị hấp dẫn bởi các hoạt động gia cầm, là những nơi có các điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của chúng. Mọt khuẩn nhỏ gây thiệt hại cho sự cách ly khi chúng tìm kiếm một nơi an toàn để phát triển thành nhộng vì bọ đen săn bắt mọt khuẩn nhỏ. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1.1.Nguyên liêụ ¨ Đối tượng nghiên cứu: - Cây Dầu giun (Chenopodium ambrosioides L.) được thu hái ở ven bờ đê sông Hồng (Hà Nội) vào thời điểm tháng 2 đến tháng 5/2009. Sâu quy (Alphitobius diaperinus (Panzer)) (Coleoptera: Tenebrionidae), đạt tiêu chuẩn quy định: sâu khoẻ, khôngbị bệnh tật (nấm kí sinh), kích thước 1,5cm/con. Tuyến trùng nốt sưng Medoilogyne spp. được Viện bảo vệ thực vật cung cấp. ¨ Phương tiện nghiên cứu: * Thiết bị – máy móc: - Nồi cất tinh dầu - Tủ sấy: Memmert, Shellab - Kính hiển vi: Leica BME, Leica CME - Hộp nuôi sâu, hộp thí nghiệm sâu. - Các dụng cụ khác như: Phễu, pipet, lam kính,lá kính, thuyền tán *Hoá chất – dung môi: - Hoá chất: xanhmethylen, đỏ son phèn, dung dich acid acetic 5%, dung dịch javen , các hoá chất để định lượng như: dd natrithiosulfat, dd kali iodid, - Dung môi: Dầu thực vật, ethanol Tất cả các hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích (P). 2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 2.1.2.1. Nghiên cứu về thực vật * Mô tả đặc điểm thực vật và kiểm tra tên khoa học của mẫu nghiên cứu: Mô tả đặc điểm cây, hoa, quả, hạt của cây thu hái và đối chiếu với các tài liệu về thực vật[], chụp ảnh, đối chiếu; tham khảo ý kiến của các nhà thực vật học. * Nghiên cứu đặc điểm vi học: làm vi phẫu thân, lá theo tài liệu thực tập dược liệu[] và tài liệu kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi[] 2.1.2.2. Nghiên cứu về hoá học: · Xác định hàm lượng tinh dầu có trong dược liệu thu hái được từ thực địa: - Nguyên tắc: Tách tinh dầu ra khỏi dược liệu bằng phương pháp cắt kéo hơi nước. Từ lượng tinh dầu thu được so với khối lượng dược liệu tính được hàm lượng tinh dầu trong dược liệu. Có nhiều bộ dụng cụ khác nhau để định lượng tinh dầu, dưới đây là sơ đồ bộ dụng cụ: (D = 0,920 - 0,980 < 1) - Dụng cụ: Bộ dụng cụ với ống hứng trong Hình : Bộ dụng cụ cất tinh dầu (dược điển Việt Nam II) A. Bình cầu đựng dược liệu B. Ống nối C. Sinh hàn H1: Bộ phận hứng tinh dầu nhẹ hơn nước. H2: Bộ phận hứng tinh dầu nặng hơn nước. Ðể tiện cho việc lắp ráp, bộ dụng cụ trên được gia công thêm một ống nối để nối bình cấu với sinh hàn. Trong ống nối có 3 mấu thuỷ tinh để giữ bình hứng (theo hình vẽ). Chú ý: Tinh dầu dễ bị phá huỷ khi chưng cất vì vậy thời gian cất một mẻ là 25 – 30 phút kể từ lúc bắt đầu sôi trong nồi cất · Nghiên cứu Ascaridol: [Dược điển Việt Nam I-tr577,Bài giảng dliêu 2] - Định lượng ascaridol trong tinh dầu cất được bằng phương pháp oxy hoá - khử: Nghuyên tắc: Lấy tinh dầu đã cất được với lượng chính xác đem tiến hành phản ứng oxyhoá-kh ử trong môi trường acid, ascaridol oxy hoá kali iodid dư giải phóng iod tự do,iod giải phóng ra được đinh lượng bằng dd natri thiosulfat chuẩn. Đọc thể tích dd natri thiosulfat chuẩn đã phản ứng. · Tiến hành SK khí: Tiến hành nghiên cứu tại Viện Dược liệu Hà Nội - Máy GC/MS – QP 2010 của hãng SHIMAZU - Cột sắc ký DB – 5MS (30 x 0,25mm ID) - Khí mang He - Nhiệt độ buồng tiêm: 200oC - Nhiệt độ detector: 200oC - Chương trình hoá nhiệt độ: 70 – 290oC; 70 – 180oC; tốc độ tăng 14oC/phút. Giữ ở 180oC trong 3 phút; 180 – 290oC; tốc độ tăng 10oC/phút. Giữ ở 180oC trong 1 phút - Mẫu thử 1ml tinh dầu (nồng độ 0,2%). 2.1.2.Nghiên cứu động vật thí nghiệm - Tiến hành nuôi sâu quy với mục đích xác định vòng đời sâu quy, đồng thời có cung cấp nguồn động vật thí nghiệm. - Nuôi sâu trong điều kiện thường tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dược liệu-trường đại học Dược-Hà Nội. - Tiến hành: Nuôi sâu trong các thùng, hộp có đục lỗ nhỏ đủ để sâu thở nhưng không bò ra được; phía dưới có đặt các chậu nước để tránh kiến,chuộtHàng ngày cho sâu ăn bỏng ngô,cám gàNuôi sâu quy cần chú ý: Ngoài thức ăn là cám gà, bỏng ngô cần bổ sung nước uống qua rau củ quả tươi (táo, carot, xà lách). Khi cần hóa nhộng, cần bắt riêng sâu khỏe nhốt riêng vào hộp phim nhựa hay lọ nhỏ để sâu phải hóa nhộng.Theo dõi số ngày hoá nhộng, hoá con trưởng thành, sâu non và ghi lại kêt quả. 2.1.2.4. Nghiên cứu hiệu lực diệt sâu: 2.1.2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm: - Xác định ảnh hưởng của cây Dầu giun lên sâu quy ở các dạng sư dụng khác nhau: Nước no tinh dầu, hỗn dịch tinh dầu với nước không có chất phụ gia, hỗn dịch tinh dầu với nước có thêm chất phu gia, dùng dạng bột nghiền khô, nước ép cây Dầu giun tươi và có đối chứng (nước có chất phụ gia, nước không có chất phụ gia và thuốc trừ sâu đã được sử dụng trong thực tế). - Hỗn dịch tinh dầu trong nước ta phun ở các tỉ lệ khác nhau. Mỗi dạng hôn dịch phun lên 3 mẫu sâu quy (mỗi mẫu có 25 sâu) đạt quy định đã nêu, phun với lượng 20ml/0,25m2/mẫu. Ta thí nghiệm với hai loại tinh dầu, một loại vừa cất tháng 3/2009 và một loại cất vào tháng 3/2008. Nước bão hoà tinh dầu ta cũng tiến hành thí nghiệm tưong tự. Dịch ép cây Dầu giun ta pha loãng lần lượt với 100, 200, 300, 400 ml nước và tiến hành thí nghiệm tuơng tự - Riêng bột dược liệu ta rắc lên 3 mẫu sâu quy (25 sâu) với tỉ lệ 2,5g/0,5m2/mẫu. - Quan sát và ghi lại hiện tượng (nhữnn thay đổi về hành vi, màu sắc), tỉ lệ sâu chết sau những thời gian khác nhau. - Nhận xét các dạng sử dụng và tìm ra dạng sử dụng có hiệu quả cao nhất cả về hiệu lưc diệt sâu và kinh tế. 2.1.2.4.2. Điều tra, thu thập số liệu Điều tra tỷ lệ sâu, tuyến trùng chết và tính toán theo công thức: Tổng số cá thể chết Tỷ lệ sâu (Tuyến trùng) chết (%) = ------------------------------ x 100 Tổng số cá thể thí nghiệm Thời điểm điều tra: Tuỳ theo mỗi thí nghiệm, sau mỗi thời gian cụ thể ghi trong bảng. Ngoài trực tiếp tiến hành các nghiên cứu trong phòng, chúng tôi còn phối hợp với Bộ môn Bệnh cây Viện BVTV đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng của tinh dầu DG, và Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu thuộc Cục BVTV để khảo nghiệm khả năng sử dụng bột khô DG trừ mọt hại kho 2.1.2.4.3. Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu Xử lý số liệu: Những số liệu thu được qua khảo nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thích hợp theo các tài liêu hướng dẫn quy phạm khảo nghiệm của Cục BVTV và Bộ NN và PTNT. Trước khi xử lý số liệu, hiệu lực của thuốc được hiệu đính bằng công thức Henderson - Tilton. % cá thể chết = [1 – (Ta/Ca)x(Cb/Tb)]x100 với: T: công thức thí nghiệm; C; Đối chứng; a: sau thí nghiệm; b: trước thí nghiệm. Số liệu được xử lý bằng chương trình so sánh sai khác trên microsoft excel. 2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật 2.2.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật và kiểm tra tên khoa học Cây thu hái tại ven bờ sông Hồng vào thời điểm từ tháng 2 đến tháng 5/2009 (hình dưới). Có đặc điểm: Là loại cây thảo. Thân đứng, có khía dọc, phân nhánh nhiều, cao 50-70 cm thậm chí ở những nơi đất tốt, mầu mỡ có thể cao tới 1,50m hay hơn thế nữa, thân cây và cành mềm màu xanh, cũng có khi hơi tía. Lá màu ve nhạt, mọc so le, có cuống ngắn, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 5,5 - 7,5 cm, rộng 1,3-2,5 cm, có phiến mọc men theo cuống, không phẳng, khía thuỳ không đều, đầu thuỳ nhọn, hai mặt cùng màu lục nhạt, lá ở ngọn có phiến rất hẹp và gần như nguyên; trên mặt lá có lông, thường ở các gân lá, nhất là mặt dưới. Hoa mọc tập trung từng xim đơn ở kẽ lá. Giữa chùm là hoa đực hay lưỡng tính, xung quanh có hoa cái nhỏ và không có cuống. Bề ngang hoa độ 1,5mm. Cụm hoa là những chuỳ dày hợp thành bông kép mang lá ở ngọn thân; bao hoa có thuỳ hình trái xoan tù ở đầu, nhị 5, đôi khi tiêu giảm còn 3 hoặc 2 cái, bao phấn hình trái xoan. Quả bế, hình cầu, màu lục nhạt hoặc trắng, đường kính chừng 1,5 mm, cùi mỏng có lá đài không rụng; hạt nhỏ, hình mắt chim, màu đen bóng ( khi hạt đã già ).Vị hắc và mùi hăng đặc biệt. Toàn cây có lông mịn ( lông che chở và lòng tiết) và mùi hăng đặc biệt mùa hoa quả tháng 5-7. Cây mọc từ hạt xuất hiện vào tháng 3-4, sinh trưởng nhanh trong mùa hè. Hình 3.Hình ảnh cây dầu giun chụp tại thưc địa Qua đặc điểm thực vật của cây, đối chiếu với các tài liệu về thực vật[]. Xác đinh mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Chenopodium ambrosioides L. – Chenopodiaceae. 2.2.1.2. Đặc điểm vi học ¨ Quan sát vi phẫu lá dưới kính hiển vi (hình dưới) * Phần gân chính: cả hai mặt đều lồi, phía trên lồi it, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì trên và dưới (1) gồm một lớp tế bào hình tròn xếp đều đặn Phía ngoài biểu bì rải rác có lông che chở đa bào (2) và lông tiết (3). Sát biểu bì trên và dưới là mô dày (4) gồm nhữn tế bào hình tròn, thành dày, xếp lộn xộn. Mô mềm (5) gồm những tế bào thành mỏng hình tròn không đều. Bó libe-gỗ (6) tạo thành vòng tròn không liên tục ở giữa gân lá. Phần libe bao quanh phần gỗ phía trong. Phần gỗ gồm các mạch gỗ tụ tập với nhau thành tứng đám, mỗi đám cách nhau bởi tế bào mô mềm. * Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới (7) giống gân lá nhưng nhỏ hơn. Mô giậu (8) gồm các tế bào hình chữ nhật. Mô khuyết (9) nằm ở phần thịt lá. Hình 4. Vi phẫu 1 phần lá dầu giun Quan sát vi phẫu thân dưới kính hiển vi: Mặt cắt ngang hình tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì (1) gồm 1 hàng tế bào nhỏ, hình tròn xếp đều đặn, phía ngoài mang lông che chở đa bào (2) và lông tiết (3). Giao mô (4) gồm các tế bào hình tròn, nhỏ, thành dày xếp tụ tập ở khía thân. Mô mềm vỏ (5) gồm nhiều lớp tế bào hình tròn,thành mỏng. Libe thứ cấp (6) gồm các tế bào nhỏ xếp thành hinh cung. Gỗ thứ cấp (7). Tầng phát sinh libe-gỗ (8) gồm các mạch gỗ to tập trung thành đám lớn tạo thành vòng phía trên bó libe-gỗ. Bó libe-gỗ sơ cấp (9) gồm các tế bào hình tròn nhỏ, xếp thành các bó hình bầu dục. Mô mềm ruột (10) ở chính giữa thân, gồm các tế bào hình tròn kích thước không đều nhau. Hình 5. Vi phẫu một phần thân cây dầu giun 2.2.2. Nghiên cứu về hoá học 2.2.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu Cân 200g dược liệu đã được làm nhỏ. Cho dược liệu vào bình cầu cổ mài dung tích 500 ml. Thêm 200 ml nước cất. Lắp dụng cụ theo hình vẽ . Ðun trực tiếp trên bếp điện (qua lưới amiang) hoặc trong bếp cách dầu trong 2 giờ. Ngừng cất. Tháo dỡ dụng cụ. Lấy riêng phần ống hứng tinh dầu. Dùng ống xi phông đặt ở nhánh hồi lưu (nhánh nhỏ) điều chỉnh cho tinh dầu nằm ở phần chia vạch có thể đọc được một cách thuận lợi nhất. Ðọc lượng tinh dầu cất được. Làm liên tục như thế lặp lại trong 3 lần. Sau khi tiến hành theo quy trình trên, tổng lượng tinh dầu thu được là 0,3ml. 2.2.2.2. Định lượng Ascaridol Cân chính xác p gam TG (khoảng 2,5g), hoà tan trong dung dịch axit axetic 90% vừa đủ 50ml. Trong mộ bình có nút mài (bình nón) dung tích 60-100ml, cho vào 3ml dung dịch KI 83%, 5ml axit clohidric 32 % và 10ml axit axetic kết tinh được. Đặt bình vào một hỗn hợp làm lạnh cho đến khi nhiệt độ bên trong hạ xuống -30. Nhỏ đúng 5ml dd TG trong axit axetic bằng một pipet có vạch, lắc nhanh rồi đặt lại bình vào hỗn hợp làm lạnh trong 5 phút. Sau đó, lấy bình ra và định lượng iot giải phóng bằng dung dịch natri thiosulfat. 0,1N cho đến khi mất màu. Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện như trên, nhưng trước khi định lượng cho thêm 20ml nước. Phương trrình phản ứng: - O – O - + 2I- + 2H+ = - O - + I2 + H2O (1) I2 + 2Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6 (2) Sau khi định lượng xac định được hàm lượng ascaridol như sau: (16,7 - 0,7)x 6,05/0,2503=38,67% 2.2.2.3. Sắc kí khí Bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp với khối phổ chúng tôi đã phân tích được các thành phần như sau: Mẫu 1 (cất cách vào tháng 3/2008) có 20 thành phần Mẫu 2 (cất vào tháng 3/2009) có 20 thành phần Như vậy có những thành phần không xác định được,có những thành phần có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu kia và có những thành phần tồn tại ở cả 2 mẫu như: Alpha-terpinen, p- Cymene, D- Limonene, ascaridol. Điều đáng chú ý là hàm lượng ascaridol ở 2 mẫu rất khac nhau và thấp hơn nhiều so với những tài liêu ghi lại trước đó. Kêt quả phân tích được đính cuối khoá luận. 2.2.3. Kết quả nghiên cứu động vật thí nghiệm Sau 6 tháng nuôi sâu và quan sát ta nắm được vòng đời của sâu quy như sau: - Giai đoạn từ sâu hoá nhộng mất thời gian khoảng 60-75 ngày - Giai đoạn từ nhộng chuyển thành con trưởng thành mất thời gian khoảng 8-11 ngày,trải qua 8 lần lột xác tương ứng với 8 tuổi. - Giai đoạn từ con trưởng thành đẻ ra sâu non mất thời gian khoảng 25-30 ngày. →Vòng đời sâu quy khoảng 90-115 ngày. Mỗi lần con trưởng thành đẻ được 400-500 sâu non. Ta nhận thấy vòng đời sâu quy khá dài và năng suất sinh sản khá cao. Bằng mắt thường ta không thể quan sát được trứng của sâu quy nên khó có thể xác định được thời gian sâu trưởng thành đẻ trứng và khoảng thời gian từ trứng nở thành sâu non. Ta có thể quan sát trứng dưới kính hiển vi. 2.2.4. Kết quả nghiên cứu về hiệu lực diệt sâu. 2.2.4.1. Đánh giá hiệu lực diệt sâu của nước bão hoà tinh dầu Ngày thực hịên: 26/03/2009. Ta lấy nước này phun theo 2 cách: phun trực tiếp lên sâu và phun qua thức ăncho sâu ăn. Sau khi quan sát ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 2.2.4.1 Kết quả xử lý sâu bằng nước bão hoà tinh dầu Thời gian quan sát sau (Xgiờ) PP phun 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ Phun trực tiếp lên sâu 12% 16% 28% TB: 18,67% 16% 16% 28% TB: 20% 28% 28% 48% TB: 34,67% 28% 28% 48% TB:34,67% Phun gián tiếp qua thức ăn 0% 0% 0% TB: 0% 4% 4% 4% TB: 4% 12% 8% 8% TB: 9,33% 12% 8% 8% TB: 9,33% → Nhận xét: Nước ngưng phun gián tiếp qua thức ăn hầu như không có hiệu lực với sâu quy, tỉ lệ chết trung bình sau 24 giờ là 9,67% trong khi phun đối chứng với nước ta thấy tỉ lệ chêt trung bình sau 24 giờ là 5,33%. Nước ngưng phun trực tiếp lên sâu quy có hiệu lực hơn, tỉ lệ sâu chết trung bình sau 1 ngày là 34,67% (phun đối chứng với nước có tỉ lệ sâu chết là 9,33 %) nhưng cũng chưa có hiệu lực diệt sâu tốt. 2.2.4.2. Đánh giá hiệu lực diệt sâu của nước cây dầu giun tươi nghiền nhỏ ( 1kg nguyên liệu/1lít nước ) Ngày thực hiên: 03/04/2009. Cách làm : 0.5kg cây dầu giun tươi vừa thu hái về, mang nghiền hoặc xay nhỏ ngay, bỏ bã ta sẽ thu được 250-300ml dịch ép cây Dầu giun (dịch ép gốc) . Sau đó lân lượt thêm lần lượt 100ml nước, 200ml nước, 300ml nước, 400 ml nước vào dịch ép gốc, sau đó phun trực tiếp lên sâu quy. Sau khi quan sát kết quả thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.2 Kết quả xử lí sâu bằng dịch ép cây Dầu giun tươi Thời gian quan sát sau (Xgiờ) Loại dịch ép 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ Dịch ép gốc + 100ml nước (dịch ép 1) 48% 48% 52% TB: 49,33% 96% 96% 100% TB: 97,33% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Dịch ép gốc + 200ml nước (dịch ép 2) 32% 32% 40% TB: 34,67% 88% 92% 92% TB: 90,67% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Dịch ép gốc + 300ml nước (dịch ép 3) 12% 20 % 20% TB: 17,33% 52% 68% 64% TB: 61,33% 80% 100% 84% TB: 88% 100% 100% 100% TB: 100% Dịch ép gốc + 400ml nước (dịch ép 4) 8% 12% 12% TB: 10,67% 60% 52% 56% TB: 56% 68% 52% 56% TB: 58,67% 68% 52% 56% TB: 58,67% →Nhận xét: Phun sâu quy bằng dịch ép 1, dịch ép 2, dịch ép 3 nhận thấy hiệu lực diệt sâu quy đều cao.Sau khi vừa phun, sâu co giật mạnh, màu da hơi đen, sau đó sâu gần như tê liệt. Dịch ép 1 và dịch ép 2 thì 8 giờ sau khi phun tỉ lệ sâu chết đều đạt 100%, so với dịch ép 2 thì dịch chiết 1 khi vừa phun làm sâu co giật mạnh hon và sâu bắt đầu chết lâu hơn nhưng hiệu quả về kinh tế lại không bằng. Dịch ép 3 sau 24 giờ tỉ lệ sâu chết đạt 100%. Như vậy, so với hai dịch ép đầu thì thời gian làm sâu chết của dịch chiết 3 sau khi phun lâu hơn, sâu co giật yếu hơn tuy nhiên hiệu quả về kinh tế là lớn nhất. Dịch ép 4 thì hiệu lực diệt sâu không cao, sau 24 giờ tỉ lệ sâu chết trung bình chỉ là 58,67%. Trong thí nghiêm phun bằng dịch chiết cây tươi này, ta thấy có thể sử dụng dịch chiết 3 để phun diết sâu trong thực tế để có hiệu quả cao nhất. 4 tấn dược liệu tươi cho ta khoảng 440-480 lít dịch chiết 3 và có thể phun cho khoảng 1ha. 2.2.4.3. Đánh giá hiệu lực diệt sâu quy của tinh dầu giun: ¨ Hỗn dịch tinh dầu giun trong nước(không có chất nhũ hoá): Ngày thực hiện: 10/04/2009. Làm thí nghiệm với hai mẫu tinh dầu giun được cất vào tháng 03/2008 và tháng 03/2009. Lắc tinh dầu trong nước theo những tỉ lệ khác nhau thu đươc loại hỗn dịch 1 (với tinh dầu giun cất vào tháng 03/2008) và hỗn dịch 2 (với tinh dầu cất vào tháng 04/2009). Sau khi quan sát kết qủa thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.3a Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 1: Thời gian quan sát (sau X giờ) Tỉ lệ TDG/H2O 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 0,5ml TDG/100ml H20 16% 20% 28% TB: 21,33% 20% 20% 28% TB: 22,67% 44% 44% 52% TB: 46,67% 44% 44% 52% TB: 46,67% 1ml TDG/100ml H20 20% 28% 28% TB: 25,33% 44% 44% 52% TB: 46,67% 60% 64% 72% TB: 65,33% 60% 64% 72% TB: 65,33% 1,5ml TDG/100ml H20 44% 52% 52% TB: 49,33% 72% 80% 80% TB: 77,33% 88% 80% 84% TB: 84% 100% 100% 100% TB: 100% 2ml TDG/100ml H20 80% 84% 84% TB: 82,67% 88% 92% 92% TB: 90,67% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Bảng 2.2.4.3b Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 2 Thời gian quan sát (sau X giờ) Tỉ lệ TDG/H2O 2giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 0,5ml TGD/100ml H20 16% 20% 24% TB: 20% 20% 24% 28% TB: 24% 44% 52% 52% TB: 49,33% 44% 52% 52% TB: 49,33% 1ml TGD/100ml H20 20% 28% 28% TB: 25,33% 44% 44% 52% TB: 46,67% 60% 64% 72% TB: 65,33% 60% 64% 72%