Đề tài Nghiên cứu tách chiết và tìm hiểu tính chất của kháng sinh có nguồn gốc từ một số chủng xạ khuẩn phân lập ở Thái Nguyên

c chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn. Các penixillin không thấm qua được màng ngoài của vi khuẩn Gr (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp. Tuy nhiên các penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài vi khuẩn Gr (-). Một số chất kháng sinh khác như vancomycin ức chế sự hình thành thành tế bào theo cách cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gr (+). * Phá hủy màng sinh chất Thuộc nhóm này bao gồm có các kháng sinh: colistin, polymyxin, amphotericin. Các kháng sinh này phá hủy màng sinh chất bằng cách gắn với ergosterol hay cholesterol là thành phần của màng sinh chất, tạo nên các lỗ trên màng và làm thất thoát nội chất ra ngoài dẫn tới gây chết tế bào. Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng đề kháng với amphoterixin B. Tuy nhiên chúng có thể bị phá hủy bởi polymixin. Kháng sinh này gắn vào thành phần photpholipit màng, làm thay đổi cấu trúc màng, dẫn tới làm rò rỉ một số chất của tế bào [7]. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Thuộc nhóm này có khoảng gần 70 chất kháng sinh đã được nghiên cứu. Trong số đó có: streptomycin. gentamycin, neomycin, các tetracyclin, cloramphenicol, erythromycin,… Các kháng sinh nhóm aminoglycoside gắn vào tiểu phần 30s của riboxom làm biến dạng tiểu phần này và gây ra quá trình dịch mã không chính xác dẫn đến tổng hợp nên những protein bất thường. Các kháng sinh nhóm tetracyclin gắn vào tiểu phần 30s ngăn cản sự gắn các axit amin vào chuỗi polypeptit đang được kéo dài. Chloramphenicol gắn với tiểu phần 50s của ribosom ức chế enzim peptidyltransferase, ngăn cản việc gắn kết các axit amin mới vào chuỗi peptit mới. Các kháng sinh nhóm macrolide gắn với tiểu phần 50s của ribosom, ngăn cản sự dịch chuyển của ribosom từ codon này tới codon kế tiếp, kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp protein bị dừng lại. * Ức chế tổng hợp axit nucleic Axit nucleic (ADN, ARN) là các đại phân tử sinh học không thể thiếu đối với sự sống của tế bào. Một số chất kháng sinh đã cản trở quá trình tổng hợp axit nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức chế sao chép hoặc dừng phiên mã [10]. Do không thể tổng hợp vật chất di truyền nên các vi sinh vật gây bệnh không thể sinh sản và duy trì nòi giống được. Hiện nay người ta đã biết rõ khoảng 20 chất phá hủy trao đổi chất và ức chế tổng hợp ARN, 26 chất ức chế trao đổi hoặc tổng hợp ADN [10]. * Ức chế trao đổi chất Các chất kháng sinh theo cơ chế này có cấu trúc gần giống với các chất trao đổi bình thường nên được coi là các chất kháng trao đổi. Chúng sẽ cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzym với các chất trao đổi bình thường làm cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bị ức chế. Các kháng sinh thuộc nhóm này có: sunfonamit, trimethoprim… có cơ chế hoạt động như một chất kháng trao đổi. Các chất kháng trao đổi rất có giá trị trong y học vì chúng chỉ có tác dụng ức chế lên tế bào vi sinh vật mà không có tác dụng lên tế bào của người. 1.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh. Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới, có hơn 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [4]. Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Trong số đó đã có rất nhiều chất đã và đang được sử dụng trong y học để điều trị các bệnh nhiễm trùng. Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các vi khuẩn Gr (-) khá mạnh. Streptomycin được sử dụng rất có hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch, ho gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chứa các bệnh lao [5]. Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả các vi khuẩn Gr (-) và Gr (+). Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với penixilin và streptomycin [5]. Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả vi khuẩn Gr (+) như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại penixilin và vi khuẩn Gr (-) như màng não cầu, lậu cầu. Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [5]. Tetracyclin: Là các kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ kháng sinh rộng, chống được cả các vi khuẩn Gr (+), Gr (-), ricketsia và một vài loài vi rút lớn. Ngoài sử dụng trong y học, tetracyclin còn được sử dụng trong chăn nuôi - thú y [2, 5]. Chloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae, được phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống lại được nhiều loài vi khuẩn Gr (+), Gr (-). Ngoài sử dụng trong y học, chất kháng sinh này còn được dùng trong chăn nuôi – thú y và thủy sản [17]. Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus, là chất kháng sinh có phổ rộng đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [4,17]. Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces niveus, có hoạt tính mạnh đối với vi khuẩn Gr (+). Đặc biệt có khả năng chống các tụ cầu đã kháng với penixilin và một số CKS khác [14]. Vancomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces orientaliss, được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các liên cầu, tụ cầu và phế cầu [17]. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh • Điều kiện nuôi cấy * Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển và khả năng tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn. Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt ở 28- 300C, nhiệt độ tối ưu cho tổng hợp CKS nằm trong khoảng 18- 300C [18]. * pH môi trường: Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là pH trung tính, pH axit hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [9]. * Độ thông khí: Xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu cầu thông khí cao hơn so với các sinh vật khác nhất là trong giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6- 12 của quá trình nuôi cấy). Do đó yếu tố thông khí có ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh [9]. * Tuổi giống: Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh còn phụ thuộc vào tuổi sinh lý và chất lượng bào tử của xạ khuẩn. Tuổi của xạ khuẩn cho hiệu suất cao nhất là 24 giờ. Lượng giống cấy truyền khoảng 2-10%. • Thành phần môi trường lên men * Nguồn cacbon: Cacbon là nguyên tố có mặt ở hầu hết các chất trong cơ thể xạ khuẩn cũng như trong các sản phẩm trao đổi chất, do vậy các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh. Đối với xạ khuẩn nguồn cacbon thích hợp nhất thường là tinh bột, ngoài ra còn sử dụng các loại đường như: glucose, fructose, maltose,…[13]. * Nguồn nitơ: Nitơ là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được trong quá trình sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh của xạ khuẩn. Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương. Nguồn nitơ vô cơ là các muối amoni, muối nitrat. * Nguồn photpho vô cơ: Photpho là yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh. Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, rút ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dưỡng [24]. * Các nguyên tố vi lượng: Là một trong các thành phần không thể thiếu được trong môi trường lên men làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn. 1.2.6. Tách chiết chất kháng sinh Phần lớn các chủng sản sinh kháng sinh và tiết ra môi trường xung quanh, nhưng có một số chủng chỉ tiết một phần vào môi trường còn chủ yếu là vẫn nằm trong sinh khối. Tuy nhiên cũng có những chủng, chất kháng sinh chỉ được tích tụ ở trong sinh khối. Để lựa chọn được phương pháp tách chiết chất kháng sinh phù hợp phải dựa vào bản chất hoá học của các chất kháng sinh. Các chất kháng sinh có thể tan trong nước hoặc tan trong các dung môi hữu cơ. Đối với các chất tan trong dung môi hữu cơ dễ tinh sạch hơn so với tan trong nước. Thông thường, nếu kháng sinh nằm trong dịch nuôi cấy có thể lựa chọn các phương pháp: chiết rút bằng các dung môi không hỗn hợp với nước, kết tủa thành dạng hợp chất không hoà tan hoặc hấp phụ bằng nhựa trao đổi ion, còn nếu chất kháng sinh nằm trong sinh khối tế bào có thể chiết rút bằng các dung môi hữu cơ. Trước khi tiến hành chiết rút kháng sinh ra khỏi môi trường nuôi cấy, cần phải loại sinh khối tế bào ra khỏi dịch nuôi bằng phương pháp lọc hay ly tâm. Khi sử dụng phương pháp lọc để loại sinh khối, một điều cần lưu ý là pH của dịch nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến việc chất kháng sinh đi ra môi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối nhiều. Ví dụ, nếu pH của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces rimosus thấp (axit), kháng sinh oxytetracyclin đi ra môi trường nhiều, ngược lại nếu pH kiềm thì kháng sinh lại tích tụ trong sinh khối nhiều hơn [15]. Đối với các dịch lên men có độ nhớt cao thường gây khó khăn cho quá trình lọc, vì vậy để khắc phục, người ta thường bổ sung một số chất trợ lọc giúp cho quá trình lọc diễn ra tốt hơn. Phương pháp ly tâm không những loại được sinh khối mà còn loại bỏ được các chất không có lợi ra khỏi dịch nuôi cấy. Tốc độ ly tâm được sử dụng với mục đích này là 15.000 vòng/phút. Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối Trước khi tách chiết, cần phải rửa sinh khối bằng nước để loại bỏ các thành phần của môi trường. Chiết rút là phương pháp thích hợp nhất để tách chiết chất kháng sinh ra khỏi sinh khối tế bào. Hiệu quả tách chiết phụ thuộc vào khả năng hoà tan của chất kháng sinh trong dung môi chiết. Các dung môi hữu cơ dùng để tách chiết chất kháng sinh có thể là: butanol, metanol, etyl axetat, axeton,… Trong đó, methanol là dung môi thường được sử dụng để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối rất có hiệu quả. Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc Các chất kháng sinh có trọng lượng phân tử thấp thường hoà tan trong nước và trong dung môi hữu cơ. Để tách chiết có hiệu quả cần phải lựa chọn các loại dung môi hoà tan chất kháng sinh và có thể bổ sung một số chất như: axit oleic, axit palmitic,… vào dịch lọc để làm tăng khả năng hoà tan của chất kháng sinh. Dung môi có chứa chất kháng sinh được cô ở điều kiện chân không và nhiệt độ thấp (dưới 60oC) để loại bỏ dung môi. Chất kháng sinh thô nhận được từ dịch lọc hay sinh khối được làm sạch hoá học bằng cách cô đặc và loại bỏ tạp chất. Điểm đáng chú ý là các chất kháng sinh thường bị mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao, axit và kiềm cao. Do vậy, khi tách chiết và tinh sạch, phải sử dụng các điều kiện thích hợp sao cho chất kháng sinh giữ được hoạt tính. Phương pháp cơ bản để tinh sạch chất kháng sinh Phương pháp chiết rút: phương pháp này làm sạch kháng sinh nhiều lần bằng chiết dung môi, sau đó kết tủa và tinh chế. Phương pháp hấp thụ trao đổi ion: phương pháp này dựa trên bản chất hoá học của chất kháng sinh là axit, kiếm hay là hợp chất vô định hình được hấp phụ trên nhựa trao đổi ion mang điện tích dương hay âm, dạng cationit hay anionit trong cột, sau đó sử dụng dung dịch để thôi kháng sinh khỏi nhựa ion. Dung dịch kháng sinh nhận được sẽ có độ sạch hơn. Phương pháp kết tủa: phương pháp này dựa trên bản chất hoá học của chất kháng sinh là chất hữu cơ hay vô cơ có thể kết tủa. Chất kết tủa nhận được bằng cách lọc hay ly tâm. Sau khi sấy khô nhận được chất kháng sinh ở dạng bột tinh sạch hơn. Tinh chế chất kháng sinh Để chất kháng sinh có độ tinh khiết cao hơn cần sử dụng phương pháp kết tinh. Đây là phương pháp quan trọng nhất để tinh chế các hợp chất ở dạng rắn. Sự kết tinh có thể thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ hay bằng cách thay đổi hệ dung môi. Dung môi chứa các vệt chất kháng sinh cuối cùng của các quá trình kết tinh có thể loại bỏ bằng cách cô chân không. Các phương pháp: sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng hay sắc ký lỏng cao áp là những phương pháp tinh chế chất kháng sinh rất có hiệu quả. 1.3. Một vài nét về hai chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28 Chủng HT28 Chủng HT28 là một trong số các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh có hoạt tính cao, đã được phân lập từ đất Thái Nguyên. Chủng HT28 đã được định tên khoa học là Streptomyces cinereoruber subp. HT28 và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học. Đặc điểm hình thái Chủng HT28 có cuống sinh bào tử dạng thẳng (RF), bề mặt bào tử nhẵn, số lượng bào tử trên một chuỗi là 20-45 (hình 1.1). (Độ phóng đại 1000 lần) ( Độ phóng đại 15000) Hình 1.1. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng HT28 Đặc điểm nuôi cấy Chủng HT28 có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường Gause 1. Trên môi trường này hệ khuẩn ty khí sinh hình thành sớm hơn, màu sắc rõ ràng và có màu xám, không có khả năng sinh sắc tố hòa tan. HT28 có khả năng hình thành sắc tố melanin. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Chủng HT28 có khả năng sinh các enzym ngoại bào: amylase, cellulase và protease. Là chủng ít ưa mặn (chịu được nồng độ muối tối đa là 5%), sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 20 – 400C, sinh trưởng tốt nhất trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 350C. Chúng sinh trưởng tốt trên môi trường trung tính hoặc hơi axit (6,5 – 7). Còn pH thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng là pH trung tính [12]. Chủng HT17.8 Chủng HT17.8 mới được phân lập từ đất Hà Thượng – Đại Từ - Thái Nguyên. Theo kết quả tuyển chọn sơ bộ và sàng lọc, chủng HT17.8 cũng là một trong số các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, có hoạt phổ rộng. Ngoài khả năng kháng được cả hai nhóm vi khuẩn Gr (+) và Gr (-) còn có khả năng kháng nấm. 1.4. Ứng dụng của chất kháng sinh ngoài lĩnh vực y học Chất kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học để chữa bệnh cho con người mà còn được ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khác như: bảo vệ thực vật, chăn nuôi, bảo quản thực phẩm,… Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng để phòng chữa bệnh và kích thích tăng trọng cho gia súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm cho chúng khỏe mạnh tăng trưởng tốt. Rất nhiều chất kháng sinh được dùng với mục đích này như tetracyclin, bacitraxin, monelzin,… Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở quy mô 12 tấn / năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng 15-25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5-7% [1]. Hiện nay việc dùng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật vẫn là phổ biến nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học lại gây ra những tác hại không nhỏ đến môi trường và sức khỏa con người. Để khắc phục những nhược điểm trên thì việc sử dụng các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến những loài có ích khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có khả năng ức chế cả các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học. Các kháng sinh được ứng dụng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa (calydamyxin, blasticidin S, kasugamyxin,…) bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ,… Ngoài ra chất kháng sinh còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độ nhất định như kích thích nảy mầm ở hạt. Việc sử dụng các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật ngày càng được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ. Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng Streptomyces sp. 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum gây thối rễ ở bông non [13]. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh chất kháng sinh mới là z – methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng lại nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium moniliforme. Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. LD30 có khả năng ức chế được vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [3]. Năm 2008, 2 chủng xạ khuẩn Actinomyces brunneofungus Đ1 và Streptomyces misawaensis R2 có hoạt tính kháng nấm mạnh, đặc biệt là có khả năng kháng được các chủng nấm gây bệnh trên chè cũng đã được phân lập ở Thái Nguyên [8]. Bên cạnh đó chất kháng sinh còn được sử dụng để bảo quản thực phẩm. Dùng kháng sinh để bảo quản thực phẩm vừa rẻ vừa đơn giản, vừa không cần trang thiết bị đặc biệt nhưng vẫn đảm bảo chất lượng thực phẩm cho nên vào những năm 1960 nhiều nước trên thế giới đã sử dụng rộng rãi các loại kháng sinh để bảo quản thịt, cá tươi và ướp lạnh các sản phẩm chế biến từ cá, thịt… Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảo quản thực phẩm như: clotetraciclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Các chất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để tác động lên cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị. Vì vậy để khắc phục tồn tại trên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải tuân theo đúng nguyên tắc. Nên ưu điểm sử dụng các chất kháng sinh ít hoặc không được dùng trong y học như nisin. Ngày nay rất nhiều nước đã sản xuất những chất kháng sinh chuyên dùng cho mục đích này. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Xạ khuẩn Hai chủng xạ khuẩn là HT17.8 và Streptomyces cineveoruber subp. HT28 do Khoa Khoa học sự sống – Trường Đại học Khoa học cung cấp. Đây là hai trong số các chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh được tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu. Chủng được bảo quản và giữ giống trong môi trường Gause 1. 2.1.2. Vi sinh vật kiểm định Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 do Viện Kiểm nghiệm – Bộ Y tế cung cấp. Chủng được bảo quản và giữ giống trong môi trường MPA. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.2.1. Hóa chất - Các loại dung môi hữu cơ: axeton, n-butanol, iso butanol, etyl axetat, n- propanol, metanol, etanol, axit axetic, benzen, cloroform,… - Các loại muối: NaCl, KNO3, CaCO3, K2HPO4, MgSO4,… - Các loại cao: cao thịt, pepton, cao nấm men,… - Các loại hóa chất khác: tinh bột, thạch, casein,… 2.2.2. Dụng cụ - Tủ ấm, tủ sấy (Đức), tủ lạnh - Máy li tâm Hettich (Đức) - Cân phân tích, cân kĩ thuật - Box cấy vô trùng (Mỹ) - Nồi khử trùng (Đài Loan) - Máy lắc (Hàn Quốc) - Lò vi sóng Sharp - Máy cất nước một lần Hamilton - Các dụng cụ thủy tinh của Việt Nam, Trung Quốc, Đức,…. 2.3. Môi trường nghiên cứu (g/l) Môi trường Gause 1 - Tinh bột tan: 20 - K2HPO4: 0,5 - NaCl : 0,5 - FeSO4: 0,01 - KNO3: 1 - Thạch: 20 - MgSO4.7H2O: 0,5 - Nước máy vừa đủ 1 lít - pH = 6,8 ÷ 7 Môi trường MPA - Cao thịt: 3 - Thạch: 20 - NaCl: 5 - Nước máy vừa đủ 1 lít - Pepton: 10 - pH = 7 Môi trường A – 4 - Glucose: 10 - CaCO3: 1 - Bột đậu tương: 10 - Nước máy vừa đủ 1 lít - NaCl: 5 - pH = 7 Môi trường A – 4H - Glucose: 15 - CaCO3: 1 - Bột đậu tương: 15 - Nước máy vừa đủ 1 lít - NaCl: 5 - pH = 7 Môi trường Gause 2 - Cao thịt: 3 - Glucose: 10 - Pepton: 5 - Thạch: 20 - NaCl: 5 - Nước máy vừa đủ 1 lít - pH = 7 ÷ 7,4 Môi trường 79 - Glucose: 10 - NaCl: 6 - Pepton: 10 - K2HPO4: 0,2 - Cazein thủy phân: 2 - Thạch: 20 - Cao nấm men: 2 - Nước máy vừa đủ 1 lít - pH = 7 ÷ 7,4 2.4. Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp giữ giống Hai chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28 được nuôi trên môi trường thạch nghiêng (môi trường Gause 1). Sau 5 ÷ 7 ngày nuôi cấy, kiểm tra các ống giống, loại bỏ các ống bị nhiễm, sau đó bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 30C ÷ 50C. Cấy chuyển giống định kì mỗi tháng một lần. Trước khi sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch mới để hoạt hóa giống [5]. 2.4.2. Phương pháp lên men xạ khuẩn tạo kháng sinh Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản là: A – 4; A - 4H; Gause 1; Gause 2; 79. Sau 96 giờ nuôi trên máy 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định HTKS của dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ để chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [9]. 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh * Phương pháp khối thạch [6, 7] Đây là phương pháp để sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh. Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause l hoặc Gause 2, sau 5 ÷ 7 ngày, khi xạ khuẩn mọc tốt dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy sẵn vi sinh vật kiểm định. Sau đó đặt vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 ÷ 5 giờ để chất kháng sinh kịp khuếch tán rồi nuôi ở nhiệt độ ấm 28 ÷ 300C. Đọc kết quả sau 24 giờ đối với vi khuẩn, 3 ngày đối với nấm kiểm định. Hoạt tính kháng sinh được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn: D-d (mm) trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính thỏi thạch. Các vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy trên môi trường MPA. * Phương pháp đục lỗ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn trong dung dịch. Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ 28 ÷ 300C, sau 120 giờ lấy ra đem li tâm ở 5000v/p trong 10 phút để thu dịch kháng sinh thô. Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên bề mặt thạch đã cấy vi khuẩn ở hộp petri, nhỏ vào mỗi lỗ thạch 0,1 ml dịch nuôi cấy cần thử. Các bước tiếp theo giống như phương pháp khối thạch. 2.4.4. Phương pháp tách chiết chất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ * Phương pháp tách chiết CKS từ sinh khối bằng dung môi hữu cơ Sau khi lên men trong 5÷7 ngày, dịch nuôi cấy và sinh khối được tách riêng. Phần sinh khối được tách bằng các loại dung môi khác nhau với tỉ lệ chiết là 1:1 theo đơn vị thể tích/ thể tích. Hỗn hợp dung môi sinh khối này được lắc 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm loại sinh khối. Cuối cùng dung môi chiết được thử hoạt tính kháng sinh trên vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch. * Phương pháp tách chiết CKS từ dịch ngoại bào bằng dung môi hữu cơ Dịch lên men sau khi loại sinh khối có thể được tách bằng các loại dung môi hữu cơ khác nhau như n- butanol, etyl axetat... tỷ lệ giữa dịch chiết và dung môi là 1:1 theo đơn vị thể tích/ thể tích. Hỗn hợp dịch lên men và dung môi được lắc ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thử hoạt tính kháng sinh trong dung môi chiết trên vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch. 2.4.5. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng sinh * Phương pháp xác định khả năng bền trong pH của chất kháng sinh Xạ khuẩn được nuôi lắc trong môi trường lên men thích hợp sau 5÷7 ngày tiến hành ly tâm thu dịch lên men. Dịch lên men được chỉnh pH theo các pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 bằng NaOH 0,5M và CH3COOH 0,4M và giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó chỉnh tiếp dịch lên men có các mức pH trên về pH = 7 rồi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch. * Phương pháp xác định khả năng bền với nhiệt độ của chất kháng sinh Dịch nuôi cấy sau khi lọc được đun cách thủy ở 400C, 600C, 800C, 1000C kéo dài 20, 40 và 60 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch. 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng được dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức: - Giá trị trung bình (): - Độ lệch chuẩn (): - Sai số m: Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28 Chất kháng sinh là sản phẩm thứ cấp, vì vậy trong quá trình bảo quản và cấy truyền nhiều lần, các chủng giống thường bị thoái hóa, có thể dẫn đến làm giảm hoạt tính hoặc mất hoàn toàn khả năng hình thành kháng sinh. Hai chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT28 được giữ trong ống thạch nghiêng trên môi trường Gause 1 (hình 3.1.a), vì vậy trước khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi đã kiểm tra lại hoạt tính kháng sinh của hai chủng theo phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện trên hình 3.1.b đã chứng tỏ hai chủng vẫn giữ được hoạt tính và tương đối ổn định. Đây là một đặc điểm cần có của các chủng xạ khuẩn được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. a b Hình 3.1. Ảnh giữ giống và hoạt tính kháng sinh của hai chủng HT17.8 và HT28 (VSVKĐ: Staphylococcus aureus) 3.2. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp Chủng xạ khuẩn HT17.8 là một chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh mới được phân lập, vì vậy trước hết chúng tôi tiến hành lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho chủng này. Môi trường lên men đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ sản xuất chất kháng sinh. Một môi trường lên