Đề tài Nghiên cứu thay thế chủng nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật bản

-1 BIKEN, Nhật Bản - Tá chất Freund adjuvant incomplex Sigma, Mỹ - Tá chất Freund adjuvant complex Sigma, Mỹ - Gel DEAE sephacel AP Biotech - HRPO Sigma, Mỹ - Ortho-Phenylene-Diamine OPD Sigma, Mỹ - Sodium periodate (NaIO4) Sigma, Mỹ - Sodium tetrahydridoborate (NaBH4) Sigma, Mỹ - Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma, Mỹ - Sodium acetate (CH3COONa) BDH, Anh - Potassium chloride (KCl) BDH, Anh - Di-sodium hydrogen orthophosphate (Na2HPO4) BDH, Anh - Sodium di-hydrogen orthophosphate (NaH2PO4) Osi, Pháp - Sulfuric Acid (H2SO4) Sigma, Mỹ - Hydrogen Peroxide (H2O2) Merck, Đức 49 - Acetic Acid (CH3COOH) Osi, Pháp - Axit citric (H3C6H5O7) Osi, Pháp 1.4 Hóa chất dùng cho kiểm định chất lượng và chế tạo bộ sinh phẩm định lượng kháng nguyên ELISA Tên hóa chất Hãng sản xuất Tên hóa chất Hãng sản xuất - Môi trường MEM Difco - Natri sulfat khan Gibco - Lactalbumin hydrolysat (LH) Difco - Axit tricloracetic Gibco - Trypsin Difco - Folin Gibco - Cao nấm men (Yeast extract) Difco - Đồng sulfat Gibco - Hexamethylen tetramin Difco - Gelatin Sigma - Albumin bò (BA) Sigma - Acetylaceton Sigma - Huyết thanh Bê (CS) Sigma - Amoni acetat Sigma - Huyết thanh bê bào thai Sigma - Axit acetic Sigma - Đỏ trung tính Sigma - Dithizon Sigma - Glucose Sigma - Carbon tetraclorit Sigma - Na-Glutamat Sigma - Erythromicin Sigma - EDTA-2Na Gibco - Vicillin Sigma - Agar Noble Gibco - Fungizon Sigma - Đỏ phenol Gibco 1.5 Các loại màng lọc - Màng Nylon mesh Thái Lan - Màng lọc vô trùng Millipore các cỡ 0,22, 0,45, 1,2 và 5,0µm Mỹ - Màng siêu lọc pellicon cassette 10.000Mw; 100.000Mw Mỹ 1.6 Dụng cụ plastic sử dụng một lần - Bơm tiêm 1, 2, 5, 10 và 20ml Terumo - Pipet 1, 2, 5, 10 và 20ml Nunc - Chai nuôi tế bào 25, 50 và 100ml Nunc - Hộp lồng đường kính 6cm Nunc 50 - Bản ELISA (marcisorp surface) Nunc, Mỹ - Tube ly tâm 100ml, 1000ml Hitachi, Kubota - Tube siêu ly tâm 90ml Hitachi - Đầu tip cho pipet man 20; 100; 200 và 1000µl Nunc, Mỹ 1.7 Dụng cụ thủy tinh trung tính - Cốc 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000ml Schott, Đức - Phiễu lọc đường kính 10, 15 và 20cm Schott, Đức - Ống đong 100, 250, 500, 1000 và 2000ml Schott, Đức - Chai 100, 200, 500, 1000, 5000, 10000 và 20000ml Schott, Đức - Pipet 1, 3, 5, 10ml Nunc, Mỹ - Bình cầu khía 250ml Schott, Đức - Cóng thủy tinh thạch anh Schott, Đức - Lọ 5ml, nút cao su và nút nhôm NeoCap, Indonesia 1.8 Các dụng cụ khác - Pipett man 20, 100, 200 và 1000µl Eppendorf, Đức - Pipett bừa (multichanel pipette) 200µl Eppendorf, Đức - Pipette Aid (Drummond) Eppendorf, Đức - Kim gặt não đường kính 2mm Việt Nam - Băng chỉ thị màu sấy khô, hấp ướt 3M, Mỹ - Pince Kocher Đức - Pince phẫu thuật có mấu Đức - Kéo phẫu tích các cỡ Đức - Kéo mổ mắt Đức - Bơm tiêm Cornwall Mỹ - Găng cao su dùng một lần Việt Nam - Các dụng cụ tiêu hao dùng trong phòng thí nghiệm (quần áo vô trùng, găng, bông, gạc, nút cao su các cỡ, khay men, khay nhựa, khay nhôm, giá để tube các loại...) - Các dụng cụ văn phòng phẩm 2 Thiết bị Tên thiết bị Nước sản xuất - Hotte Laminaire (lọc thổi không khí vô trùng) Pháp - Máy nghiền não Nissei (5000ml) Nhật Bản 51 - Máy ly tâm lạnh dung tích lớn (6000ml ; 7000v/p) Mỹ, Nhật Bản - Máy siêu ly tâm 65000G; rotor RP42 Nhật Bản, Mỹ - Hệ thống lọc vô trùng millipore 10l, 20l và giá lọc Φ42,9 Mỹ - Tủ ấm CO2 Nhật Bản - Tủ ấm Nhật Bản - Tủ lạnh -80oC, -20oC và 4oC Nhật Bản - Bain marie (nồi đun cách thủy) Đức - Máy hút chân không Nhật Bản - Thùng nitơ lỏng (giữ giống virut và tế bào) Pháp - Máy khuấy từ AIK Đức - Máy đo pH Pháp - Máy cất nước 1 lần, 2 lần và 3 lần Mỹ - Máy quang phổ Nhật Bản - Cân phân tích Đức - Cân điện Pháp, Mỹ - Lò sấy khô Đức - Lò hấp ướt Pháp - Và các thiết bị khác 3 Phương pháp nghiên cứu 3.1 Quy trình công nghệ sản xuất giống virut VNNB chủng Beijing-1 (đảm bảo nhiệt độ 2-80C trong suốt quy trình gặt) Tên chủng gốc Beijing-1 (đã tiêm truyền não chuột 42 đời) Nơi cung cấp NIID, Nhật Bản Tên giống gốc tại VABIOTECH : Bei(42)2 (tiêm truyền não chuột ổ 2 đời, sử dụng làm chủng gốc (master seed), sau đó tiêm truyền chuột 11-13g để làm chủng sản xuất (working seed). 52 Sơ đồ gây nhiễm và gặt não vô trùng, sản xuất chủng gốc (MS) Chủng Beijing-1 (NIH, Nhật Bản) Tiêm não chuột 0,01ml/con (107PFU/ml) Thu thập chuột ốm và liệt giờ 72 Cắt tim, rửa 10 lần trong nước đá Rửa bằng cồn 1 phút Rửa 4 lần nước cất Thấm khô bằng gạc vô trùng Xếp và cố định chuột vào khay Sát trùng vùng đầu bằng cồn Iod 1% Mổ lấy não vô trùng từng con Bảo quản não trong cối sứ 40C (sau đó nghiền vô trùng ngay) 53 Tóm tắt sơ đồ nghiền đồng nhất, sản xuất chủng gốc (MS) Tổng trọng lượng não chuột ổ Nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH8,0 Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC Lọc nước nổi qua Nylon mesh Loại tủa Xử lý protamin sulfate 1% Khuấy từ 30 phút ở 4oC Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC Lọc nước nổi qua Nylon mesh Loại tủa Lọc vô trùng: millipore 0,45-1,2-5,0µm Thêm gelatin 0,02% Mẫu thử: - Vô trùng - PFU - LD50 Đóng lọ 2ml/lọ Dán nhãn: tên chủng, ngày sản xuất... Bảo quản trong Nitơ lỏng 54 3.2 Qui trình công nghệ sản xuất chủng sản xuất (BWS) Tiêm não chuột 0,03ml/con (107PFU/ml) Thu chuột liệt giờ thứ 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90 Cắt tim, rửa 10 lần trong nước đá Rửa bằng cồn 1 phút Rửa 4 lần nước cất Máy rung khô chuột Xếp và cố định chuột vào khay Gặt não vô trùng (dùng áp lực chân không) Bảo quản não trong –80oC Chủng gốc Beijing-1: Bei (42)2 Chuột swiss 3 tuần tuổi 55 Tổng trọng lượng não chuột Nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH 8,0 Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC Lọc nước nổi qua Nylon mesh Loại tủa Xử lý protamin sulfate 1% Lọc nước nổi qua Nylon mesh Lọc vô trùng: millipore 0,45-1,2-5,0µm Thêm gelatin 0,02% Mẫu thử: - Vô trùng - PFU - LD50 Đóng lọ 6ml/lọ Dán nhãn: tên chủng, ngày sản xuất... Bảo quản trong Nitơ lỏng Khuấy từ 30 phút ở 4oC Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC Loại tủa 56 3.3 Quy trình công nghệ sản xuất văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 3.3.1 Gây nhiễm, thu thập chuột liệt và gặt não chuột Thu hoạch não vô trùng qua hệ thống hút chân không, 200 não cho 1 hộp lồng (inox hoặc plastic đường kính 100mm). Sau mỗi lần thu hoạch cần cất ngay vào –80oC để giữ hiệu giá virut được ổn định. Giống sản xuất (WS) Tiêm chuột Swiss 11-13g (IC 0,03ml/con) Pha giống 107PFU Loại bỏ chuột chết trước 65 giờ sau tiêm Thu thập chuột liệt đủ tiêu chuẩn Loại bỏ chuột chết Xử lý sạch vô trùng Gặt não vô trùng Bảo quản –80oC giờ 67 (5h) x-v giờ 85 (23h) x-v giờ 70 (8h) x-v giờ 82 (20h) x-v giờ 79 (17h) x-v giờ 76 (14h) x-v giờ 73 (11h) x-v giờ 88 (2h) x-v giờ 101 (14h) x-v giờ 98 (11h) x-v giờ 92 (5h) x-v giờ 95 (8h) x-v giờ 104 (17h) x-v giờ 107 (20h) x-v 57 3.3.2 Nghiền não đồng nhất 20% trong PBS, văcxin bán thành phẩm thô Tổng số não Tổng trọng lượng Nghiền não đồng nhất trong PBS pH 8,0. 7000 v/p trong 15’, ở 4oC Ly tâm 5000 v/p x 50’, ở 4oC Thu nước nổi (NN) Xử lý với protamin sulfate Ly tâm 5000 v/p x 50’, ở 4oC Thu nước nổi (NN1) Loại tủaNghiền lại lần 2 Ly tâm 5000 v/p trong 50’, ở 4oC Loại tủa Thu nước nổi Tủa protamin sulfate Loại tủaLy tâm 5000 v/p trong 50’, ở 4oC Thu NN (NN2) Hộn NN1 + NN2 Lọc qua Nylon mesh Lọc vô trùng Millipore (0,45, 1,2 và 5,0µm) Lấy mẫu thử: - Vô trùng - PFU - ELISA-Ag Bất hoạt: - Formalin - EDTA-3Na Bảo quản 2-8oC, 35-45 ngày Thử bất hoạt trên chuột Văcxin BTP thô, bất hoạt 58 3.3.3 Tinh chế văcxin thô đã bất hoạt Tổng thể tích văcxin thô Cô đặc bằng Pellicon cassette Ly tâm 5000 v/p x 50’, ở 4oC Thu nước nổi Tủa bằng Ammoni sulfate bão hòa ở 4oC trong 18 giờ Siêu ly tâm trong đệm sucrose Thu hoạch virut tinh khiết Loại tủa Lọc vô trùng Millipore (0,22-1,2-5,0µm) Lấy mẫu thử: - Vô trùng - Pyrogen - ELISA-Ag Văcxin BTP tinh khiết, bảo quản 4oC Thẩm tích loại sucrose Ly tâm 5000 v/p x 50’, ở 4oC Thu nước nổi Loại tủa Loại NN Siêu âm trong PBS pH7,4; EDTA.4Na 0,1% và Genlatin 0,12% Văcxin BTP trong TCM-199; thimerosal 0,009% và Tween 80 0,0005% 59 3.3.4 Pha văcxin bán thành phẩm cuối cùng và văcxin thành phẩm Từ văcxin bán thành phẩm đặc, tinh khiết sau tinh chế, định lượng hàm lượng kháng nguyên bằng phương pháp ELISA, so với mẫu chuẩn EJP034A của BIKEN. Sau đó từ kết quả này tính để pha văcxin. Công thức pha dựa vào hàm lượng kháng nguyên 11 VxV ×= Trong đó V: Thể tích bán thành phẩm cuối cùng x: Hàm lượng kháng nguyên đạt được so với chuẩn (mẫu thử/EJP034A=x) 1: hệ số pha loãng so với mẫu chuẩn V1: Thể tích bán thành phẩm đặc Thành phần văcxin thành phẩm: - Kháng nguyên virut VNNB Beijing-1 bất hoạt, tinh khiết vừa đủ 1 liều - Hàm lượng Thimerosal 0,009µg/ml - Dung dịch TCM-199 không có đỏ phenol vừa đủ 1 liều 3.3.5 Đóng gói Đóng lọ: 5ml/lọ cho 10 liều người lớn. Cho 20 liều trẻ em ≤ 3 tuổi Đóng hộp: 10 lọ/hộp 3.4 Phương pháp kiểm tra chất lượng Các phương pháp kiểm tra chất lượng văxin VNNB dựa vào thường qui và tiêu chuẩn của TCYTTG. Mỗi loạt văcxin thành phẩm phải giữ mẫu kiểm định 70 lọ/loạt (loại 5ml/lọ). 3.4.1 Kiểm tra vô khuẩn - Kiểm tra vô khuẩn được thực hiện trên 2 loại môi trường là Thioglycholate và Soybean casein; mỗi loại 5 ống cấy 1ml/ống mẫu thử. Thioglycholate ủ ở nhiệt độ 350C Soybean casein ủ ở nhiệt độ 220C Theo dõi trong 14 ngày và đọc ghi kết quả cách ngày cho đến ngày thứ 14 với yêu cầu không có nấm và vi khuẩn phát triển trong suốt thời gian theo dõi. 60 3.4.2 Kiểm tra an toàn chung * Thử nghiệm trên chuột lang: Chọn chuột lang 150-300g khỏe mạnh, tăng trọng bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm (lồng chuồng, nhiệt độ và độ ẩm phòng, thức ăn...) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột lang. Tiêm 5ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi trọng lượng hàng ngày trong 7 ngày. Yêu cầu chất lượng sau tiêm chuột khỏe mạnh, bình thường, tăng trọng. * Thử nghiệm trên chuột nhắt: Chọn chuột nhắt trắng 5 tuần tuổi, khỏe mạnh, bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm (như trên chuột lang) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột nhắt. Liều tiêm 0,5ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi ít nhất 7 ngày. Hàng ngày theo dõi trọng lượng và tình trạng sức khỏe của chuột. Yêu cầu chất lượng sau tiêm 7 ngày chuột khỏe mạnh, bình thường và tăng trọng. 3.4.3 Kiểm tra chất lượng gây sốt Văcxin bán thành phẩm và thành phẩm được kiểm tra chất lượng chất gây sốt trên thỏ. Đây là phương pháp nhậy nhất để phát hiện yếu tố gây sốt trong văcxin. Chọn thỏ có trọng lượng ít nhất 1,5kg. Những thỏ đã thử nghiệm (-) có thể dùng lại 3 lần hoặc lâu hơn kể từ ngày thử nghiệm trước nhưng không dùng để tiêm cùng 1 loại văcxin như lần trước. Không dùng thỏ trước khi tiêm có thân nhiệt > 39,8oC. Thích nghi điều kiện thử nghiệm trước 2 ngày về lồng chuồng, chế độ ăn và ở nhiệt độ 20-25oC. Nhiệt kế có vạch chia đến 0,10C. Bơm kim tiêm vô trùng loại dùng 1 lần. Không cho thỏ ăn mà chỉ cho uống nước 16giờ trước khi tiêm cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Cố định thỏ bằng dụng cụ đặc biệt ở tư thế thoải mái. Đưa nhiệt kế vào hậu môn 6-9mm. Đo nhiệt độ trước khi tiêm 15phút. Mẫu thí nghiệm để ở 37oC trước khi tiêm. Đường tiêm là tĩnh mạch tai. Liều tiêm 1ml/kg trọng lượng. Theo dõi đo và đọc nhiệt độ ít nhất 3 lần với khoảng cách giữa 2 lần đo nhiệt độ không quá 60 phút. Nhiệt độ cao nhất của thỏ được ghi nhận trong 3 giờ sau khi tiêm được coi là nhiệt độ “tối đa”. Hiệu số giữa nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ tối đa được coi là nhiệt độ phản ứng. Nếu hiệu số này là âm tính thì phản ứng được đọc là 0oC. Thử nghiệm tiến hành lần đầu trên 3 thỏ và kết quả nhận định theo bảng dưới đây. Nếu tổng nhiệt độ tăng nằm giữa cột 3 và 4 thì thử nghiệm phải tiến hành lại trên số thỏ gấp đôi. Tổng nhiệt độ tăng của 6 thỏ được nhận định theo bảng. Thử nghiệm không lặp lại quá 3 lần. 61 Bảng 4: Tiêu chuẩn kiểm tra chất gây sốt (TCYTTG) Thử nghiệm Tổng số thỏ tích lũy Tổng nhiệt độ theo tiêu chuẩn WHO Thử nghiệm không đạt với tổng nhiệt độ là 1 3 1,4oC 2,4oC 2 6 3,0oC 4,1oC 3 9 4,9oC 5,9oC 3.4.4 Kiểm tra bất hoạt (an toàn đặc hiệu) chọn chuột nhắt trắng 11-13g khỏe mạnh, thể trạng phát triển tốt. Tiêm mẫu thử 0,03ml/con. Đường tiêm não chuột giữa điểm tai và mắt. Theo dõi sức khỏe trọng lượng chuột trong 14 ngày. Ngày thứ 14 đọc kết quả với thể trạng chuột khỏe mạnh và tăng trọng bình thường, không hề có các triệu chứng bệnh lý là đạt yêu cầu. 3.4.5 Kiểm tra các thành phần hóa học Đo độ pH: Sử dụng máy đo pH Metter Toledo (Thụy Sĩ) với các dung dịch chuẩn pH 4 và pH 7,02. Tiến hành đo pH như các phương pháp đo pH thông thường. pH của văcxin phải trong khoảng 6,8-7,4. Cần chú ý rửa đầu từ và bảo quản đầu từ đo pH cho sạch bằng cách sau khi đo pH phải rửa bằng nước cất 2 lần trong nhiều lần. 3.4.6 Định lượng TCA-protein trong văcxin a) Nguyên lý Protein trong văcxin được tủa bằng axit tricloraxetic (TCA) rồi định lượng theo phương pháp Lowry. Các dung dịch protein chuẩn là albumin bò có nồng độ 50, 100 và 150µg/ml. b) Chuẩn bị dung dịch * Dung dịch A: Pha ngay trước khi dùng Hòa tan 0,4g natri hydroxyt trong nước cất, thêm 4g natricarbonat, lắc cho tan đều. Thêm nước cất vừa đủ 100ml. * Dung dịch B: Pha ngay trước khi dùng Trộn đều dung dịch đồng sulfate 2% với 1ml natri taetrate 4%. * Dung dịch C: (thêm 1ml dung dịch B vào 50ml dung dịch A) - Dung dịch axit tricloraxetic 10%: cân 100g axit tricloraxetic rồi thêm nước cất vừa đủ 1000ml. c) Tiến hành 62 - Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) vào các protein chuẩn và các mẫu chuẩn văcxin các ống (mỗi mẫu 3 ống, mỗi ống 1ml) - Thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch TCA 10% - Đun cách thủy 100oC, 15 phút sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 3500v/p trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. - Rửa tủa bằng 2ml dung dịch TCA 5%. - Ly tâm 3500v/p trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ nước nổi. - Thêm vào mỗi ống 2,5ml dung dịch C, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 30 phút - Thêm vào mỗi ống 2,5ml nước cất. - Thêm 0,5ml dung dịch folin để 37oC trong 30 phút, để nguội - Đo độ hấp phụ ở bước sóng 750nm trên máy đo quang phổ. - Dựng đường chuẩn protein chuẩn rồi dựa theo đường chuẩn tính hàm lượng protein trong văcxin. 3.4.7 Định lượng Thimerosal a) Nguyên lý Dựa trên cơ sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 430nm. Đo độ hấp phụ của hợp chất tạo thành ở bước sóng này. b) Chuẩn bị dung dịch - Dung dịch Dithizon 0,002%: cân 2mg dithizon, thêm carbontetraclorit vừa đủ 100ml. - Nước amonia 60% (9N): đong 60ml amonia, thêm nước cất vừa đủ 100ml c) Tiến hành - Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng), các dung dịch thimerosal chuẩn và mẫu văcxin vào các ống, mỗi ống 0,5ml (mỗi mẫu 2 ống). - Thêm nước cất vừa đủ 5ml - Thêm 10ml dithizon, lắc mạnh trong 5 phút. - Để ở nhiệt độ phòng, nước và CCl4 tách thành 2 lớp. Hút bỏ lớp nước ở trên. - Thêm 10ml nước cất, lắc mạnh. Để lắng rồi hút bỏ lớp nước ở trên. - Thêm nước amonia, lắc đều rồi hút bỏ lớp nước ở trên (3 lần) - Rửa một lần nữa bằng 10ml nước cất. Hút bỏ lớp nước ở trên. - Thêm 1 thìa natri sulfate khan để ngừng phản ứng. - Đo độ hấp phụ ở sóng 480nm trên máy quang phổ kế. - Dựng đường chuẩn thimerosal rồi dựa vào đó tính hàm lượng thimerosal trong văcxin. 63 3.4.8 Định lượng formaldehyt a) Nguyên lý Định lượng formaldehyt bằng phương pháp đo cường độ màu của 3,5diacetyl 4- dihydrothidin ở bước sóng 415nm. Phức hợp này được tạo thành do phản ứng của formaldehyt chứa trong văcxin với acetylaceton và amonia trong môi trường axit nhẹ. b) Chuẩn bị dung dịch - Dung dịch formaldehyt chuẩn: Cân 388,8mg examethylen tetramin, thêm nước cất vừa đủ 500ml. Nồng độ formaldehyt trong dung dịch này bằng 1000µg/ml. Từ dung dịch này pha các dung dịch formaldehyt có nồng độ 2, 4 và 6µg/ml. - Dung dịch acetylaceton: Hòa tan 150g amoniaacetat trong một lượng nước thích hợp, thêm 30ml axit acetic và 2ml acetylaceton rồi thêm nước cất vừa đủ 1000ml. c) Tiến hành Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) các dung dịch formaldehyt chuẩn và mẫu văcxin vào các ống (2ml/ống; mỗi mẫu 2 ống). Thêm vào mỗi ống 2ml acetylaceton (đã pha amoniaacetat và axit acetic). Đun cách thủy 100oC trong 15 phút, rồi làm nguội bằng nước vòi. Đo độ hấp phụ ở bước sóng 415nm trên máy quang phổ kế. Dựng đường chuẩn nồng độ formaldehyt rồi dựa vào đó để tính hàm lượng formaldehyt trong văcxin. 3.4.9 Phương pháp thử nghiệm LD50 (Reed và Muench) - Mẫu thử là virut sống. - Động vật thử nghiệm: chuột swiss 11-13g khỏe mạnh. - Nồng độ pha tiêm: 10-1, 10-2, 10-3, ... 10-9. - Đường tiêm: não (IC) điẻm giữa tai và mắt. - Thời gian theo dõi 14 ngày sau khi tiêm (thời gian ủ bệnh tối đa của virut VNNB). - Để chuẩn độ hiệu giá virut thường bỏ 3 nồng độ đầu (10-1-10-3) bắt đầu tiêm 10-4, vì từ 10-1-10-3 thường chuột chết 100% (virut trước bất hoạt). - Môi trường pha: TCM199 có đỏ trung tính và 0,02% gelatin. - Mỗi nồng độ tiêm 10 chuột. Ví dụ: chủng Bei (42)2. Ngày thử nghiệm 7/11/02 64 Pha tiêm: Bảng : Sơ đồ chuẩn độ LD50 của chủng Bei(42)2 Nồng độ pha Số chuột thứ tự 10-1 10-2 10-3 10-4/ngày 10-5/ngày 10-6/ngày 10-7/ngày 10-8/ngày 10-9/ngày 1 + + + + + + 2 + + + + 12/11/02 + + 3 + + 11/11/02 + 11/11/02 + + + 13/11/02 4 + + + + + 13/11/02 + 14/11/02 5 + + + + + - 6 + + + 12/11/02 + + - 7 + + + + + - 8 + 11/11/02 + + + + 14/11/02 - 9 + + + + - - 10 + 12/11/02 + 12/11/02 + 13/11/02 + 13/11/02 - - Phương pháp tính LD50 • Số chuột chết: được tính gộp bằng số chuột chết ở nồng độ đó cộng với số chết ở các nồng độ pha loãng x100. • Số chuột sống: bằng số chuột sống ở nồng độ đó cộng với số sống ở các nồng độ đặc hơn. Ví dụ ở bảng Σ chết Σ số sống Ở nồng độ 10-4 52 0 10-5 42 0 10-6 32 0 10-7 22 0 10-8 12 2 10-9 4 8 50% TCM 199 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-7 10-8 10-910-6 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml Bei(42)2 65 * Tính (%) chuột chết ở mỗi nồng độ theo công thức * Để tính LD50cần có giá trị lớn nhất > 50% và có giá trị nhỏ nhất < 50% Ví dụ: ở trên có nồng độ 10-8 thì: %71,85 212 100 12 =+= xx nếu nồng độ là 10-9 thì: %33,33 84 100 4 =+= xx * Công thức tính Vậy LD50 của Bei (42)2 = 10-8,68 3.4.10 Phương pháp thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) * Chuẩn bị tế bào BHK21 - Chuẩn bị tế bào BHK21 có nồng độ 2,4x104 tế bào/ml trong môi trường MEM có huyết thanh bê bào thai (FBS) 10% - Bơm vào hộp lồng nhựa (Nunc) có φ bằng 6cm (Petri dish - đĩa Petri) với thể tích 5ml/hộp. - Để tử ấm CO2 trong 72giờ, tế bào kín 1 lớp, đều đẹp khi soi dưới kính hiển vi quang học. * Chuẩn bị mẫu cần chuẩn độ (virut VNNB) - Pha loãng mẫu từ 10-4-10-8. - Mỗi nồng độ gây nhiễm 3 đĩa. - Thể tích gây nhiễm 0,2ml. Tóm tắt qui trình như sau: Tế bào BHK21 1 lớp đều đẹp trên đĩa Petri ↓ Hút hết môi trường nuôi tế bào ↓ Cấy 0,2ml dung dịch virut đã pha ↓ Láng đều mặt tế bào x = Số chuột chết x 100 Σ chuột sống và chết ở cùng nồng độ = Số có giá trị >50% - 50 Số có giá trị >50% - số có giá trị <50% 85,71 - 50 85,71-33,33 = 0,68 66 ↓ Tiếp xúc 90 phút ở tủ ấm CO2 370C (15 phút láng 1 lần) ↓ Phủ lớp thạch thứ nhất: 5ml/đĩa ↓ Để nhiệt độ phòng 30 phút cho đông thạch ↓ Lật úp đĩa Petri, để lại tủ ấm CO2 370C trong 3 ngày ↓ Phủ lớp thạch thứ 2: 2,5ml/đĩa ↓ Để nhiệt độ phòng 30 phút cho thạch đông ↓ Để tủ ấm CO2 từ 4-5 giờ ↓ Đếm các đám hoại tử (plaque) và ghi lại trên nắp hộp * Cách tính PFU trong 1ml: Công thức tính (5 là thể tích cấy 1 đĩa 0,2ml x 5 = 1ml) Ví dụ: ở nồng độ 10-6: có 3 đĩa: đĩa 1: 14 plaque đĩa 2: 12 plaque đĩa 3: 13 plaque Tổng: 39 Số plaque trung bình/đĩa: 39 : 3 = 13 Tính PFU: 10-6 x 13 x 5 = 65 x 106 = 6,5 x 107 = 0,65 x 108 3.4.11 Kiểm tra công hiệu của văcxin a) Nguyên lý Công hiệu của văcxin VNNB dựa trên hiệu giá kháng thể trung hòa sau khi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Hiệu giá kháng thể trung hòa được tính bằng giá trị 50% giảm đám hoại tử. b) Tiến hành * Gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng 11-13g: Chú ý: mẫu văcxin và mẫu chuẩn cùng làm song song. Một lúc có thể làm nhiều mẫu văcxin với một mẫu văcxin chuẩn. * Pha văcxin: - Văcxin mẫu chuẩn là EJP034A (BIKEN) PFU = Độ pha loãng x Số plaque tế bào x 5 67 - Văcxin mẫu thử Tỷ lệ pha: 1/16; 1/32; 1/64; (nhóm A: x 16; B: x 32 và C: x 64) Dung dịch pha: M/75 pH 7,4 có 0,02% gelatin. * Gây miễn dịch cho chuột: + Số chuột cần tiêm: mỗi nồng độ 10 con + Liều tiêm: 0,5ml/con x 2 liều cách nhau 7 ngày. + Đường tiêm: phúc mạc (IP) + Lấy máu tim: 7 ngày sau khi tiêm mũi 2. Máu lấy và để riêng của từng con chuột. Để 4oC qua đêm. + Chắt huyết thanh: dùng pipett man hút 100µl của mỗi tube (của 1 con chuột). Hộn vào 1 tube theo nhóm A, B, C... + Ly tâm 3000v/p trong 30 phút. Lấy nước nổi. + Pha huyết thanh 1/10 trong LE có 0,2% BA bảo quản –20oC Bảng 5: Pha huyết thanh cho kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử Mẫu văcxin gây miễn dịch Độ pha loãng huyết thanh Nhóm chuột A x 16 x 640, x 1280, x 2560 B x 32 x 320, x 640, x 1280 Mẫu chuẩn EJP034A pha gây miễn dịch C x 64 x160, x 320, x 640 Nhóm chuột D x 16 x 640, x 1280, x 2560 E x 32 x 320, x 640, x 1280 Mẫu văcxin thử pha gây miễn dịch F x 64 x160, x 320, x 640 Mẫu huyết thanh dương x 80, x 160, x320 - Chuẩn bị dung dịch virut thử thách (CV); Dung dịch virut thử thách pha đạt 90-150 plaque/đĩa petri đường kính 6cm trong dung dịch LE có 0,2%BA. - Chuẩn bị pha thạch cho lớp phủ thứ nhất + Dung dịch A: Cân 8g agar Noble, thêm vào 500ml nước cất 2 lần và sấy ướt 120oC trong 40 phút + Dung dịch B: Cân 5g Lactalbumin hydrolysat (LH), thêm vào 250ml nước cất 2 lần. Hấp ướt 115oC trong 40 phút. 68 + Hộn dung dịch A và B sau đó thêm 100ml glucose 4% + 100ml Earle đặc 10 lần và 5ml dung dịch cao nấm men. Để nguội 50oC rồi thêm 32ml bicarbonat 7% + 1ml erythromycin + 1ml kanamycin + 1ml fungizon và 0,5ml viccillin - Chuẩn bị pha thạch cho lớp phủ thứ 2: Cân 8g agar Noble, thêm 800ml nước cất 2 lần. Sấy ướt 120oC trong 40 phút. Thêm 100ml dung dịch Earle đặc 10 lần + 36 ml đỏ trung tính 25%. Giữ ở 50oC. - Tế bào BHK21 đã nuôi trên đĩa petri đường kính 6cm. Kiểm tra tế bào mọc kín, đẹp. + Rửa tế bào bằng dung dịch Hanks có kháng sinh (lắc nhẹ đều mặt tế bào). + Hút vô trùng qua bơm chân không kiệt hết dịch nuôi tế bào. + Đánh dấu: tên mẫu, A, B... Tóm tắt sơ đồ trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT) 1ml huyết thanh của mỗi nồng độ pha loãng + 1ml CV (hỗn hợp trung hòa) ↓ Để tủ ấm CO2 ở 37oC trong 90 phút ↓ Cấy hồn hợp trung hòa 0,2ml vào đĩa tế bào BHK21 (mỗi độ pha loãng 3 đĩa) láng đều trên bề mặt tế bào ↓ Để tủ ấm CO2 ở 37oC trong 90 phút (15 phút láng đều mặt tế bào 1 lần) ↓ Phủ lớp thạch thứ nhất đã chuẩn bị (5ml/đĩa) ↓ Để tủ ấm CO2 ở 37oC trong 3 ngày ↓ Phủ lớp thạch thứ hai đã chuẩn bị (2,5ml/đĩa) ↓ Để tủ ấm CO2 ở 37oC trong 3 giờ ↓ Đếm các đám hoại tử ở từng đĩa (ghi lại ở nắp đĩa) soi trên loại đèn đặc biệt (Trong đó có 3 đĩa chỉ cấy CV để kiểm tra CV đạt 90-150 plaque/đĩa) Hiệu giá kháng thể trung hòa được tính theo công thức sau: xYZ log 7622,47 50 +−= 69 Z: là log của hiệu giá kháng thể làm giảm 50% đám hoại tử Y: là tỷ lệ giảm đám hoại tử (%) x: là độ pha loãng của huyết thanh 100)1( x CV SY −= S: là số dám hoại tử trung bình của mỗi nồng độ huyết thanh . CV: số đám hoại tử trung bình của virut thử thách. Ví dụ Y= 72,9 và x=640 thì khi đó 2,38,24,010log 7622,47 509,72 640 =+=+−=Z Vậy hiệu giá kháng thể trung hòa là log103,2 (viết tắt là: chỉ số trung hhòa 3,2) - Yêu cầu hiệu giá kháng thể trung hòa của mẫu thử ≥ văcxin mẫu chuẩn 3.4.12 Phương pháp thử nghiệm lâm sàng Văcxin là sản phẩm thuốc dùng cho cả một quần thể trong cộng đồng, do đó nếu có rủi ro xảy ra thì không phải là một cá thể mà cả một quần thể phải chịu hậu quả. Thử nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá tính an toàn trên người và đáp ứng miễn dịch của văcxin thử nghiệm đã sản xuất và được đánh giá trong phòng thí nghiệm và động vật thí nghiệm. Loạt văcxin này đã được cấp giấy chứng nhận chất lượng của Trung tâm quốc gia kiểm định văcxin và sinh phẩm (Cencobi). * Thử nghiệm lâm sàng gồm hai giai đoạn: - Giai đoạn 1: Thử nghiệm trên người tình nguyện. 20 người lớn, khỏe mạnh. Đánh giá không có phản ứng phụ sau 1 tháng theo dõi mới tiếp tục gia đoạn sau. - Giai đoạn 2: Thử nghiệm trên trẻ em, so s