Đề tài Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thuần Việt Nam tại Viện nghiên cứu ngô Đan Phượng - Hà Nội

chỉ thị thuộc nhóm này đã thành công trong nghiên cứu đa dạng di truyền. * Chỉ thị RFLP (Restiction Fragment Lengh Polymorphism) Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn) được sử dụng rộng rãi trong đánh giá tính đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến hóa và phân loại các loài của nhiều nhóm thực vật và trong lập bản đồ di truyền. Chỉ thị RFLP được sử dụng như là mẫu chuẩn để xác định sự có mặt hay thiếu vắng các đoạn nhiễm sắc thể nhất định. Khả năng theo dõi quá trình di truyền các đoạn nhiễm sắc thể cho phép sử dụng kĩ thuật RFLP trong chọn tạo giống cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997). Khả năng phân biệt của chỉ thị RFLP đã được nghiên cứu rộng rãi ở ngô, như xác lập mối quan hệ với năng suất và UTL, đánh giá đa dạng di truyền. Chỉ thị này không những phát hiện được những cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử mà còn phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn. Vì thế mà phương pháp này còn được gọi là chỉ thị đồng trội. Tuy nhiên, phương pháp này có quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, yêu cầu số lượng DNA lớn, chất lượng DNA cao, sử dụng chất phóng xạ gây nguy hiểm cho người. Do đó xu hướng sử dụng các chỉ thị phân tử đơn giản hơn trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR. * Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DAN) Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như lập bản đồ di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác định giống cây trồng… Ở Việt Nam chỉ thị RAPD cũng đã được Ts.Bùi Mạnh Cường và cs (2000,2003) nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là quy trình phân tích đơn giản, nhanh, rẻ tiền và cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn, an toàn với người thực hiện, tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là mức độ phát hiện sự đa hình thấp. * Chỉ thị AFLP (Amplified Length Polymorphism) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, DNA nhân được cắt bằng enzym giới hạn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, sau đó được gắn với các đoạn nucleotide ngắn (adapter) vào hai đầu nhờ enzym ligase. Mồi của phản ứng được thiết kế trên trình tự của các đoạn adapter có gắn thêm các đoạn từ một vài nucleotide. Kỹ thuật AFLP cho phép phát hiện được đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân chọn lọc. Trên cây ngô chỉ thị AFLP được các nhà khoa học ứng dụng trong đánh giá mối quan hệ giữa đa hình phân tử với sự biểu hiện ở giống ngô lai (Ajmone-Marsan và cs,1998). * Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) SSR hay còn gọi là vi vệ tinh là sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide đơn giản cực ngắn (chỉ từ 1-6 cặp base). Các SSR xuất hiện phổ biến trong bộ gen của sing vật nhân thực (Eukaryote). Tuy nhiên tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đợn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng trăm ngàn lần và nhiều hơn. Phương thức lặp lại cũng rất phức tạp và đa dạng, chủ yếu có ba dạng sau: (1) lặp lại hoàn toàn; (2) lặp lại không hoàn toàn; (3) lặp lại phức tạp. Kỹ thuật SSR cho phép chúng ta phát hiện được tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotide lặp lại đơn giản. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Do sự khác nhau về số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số lần lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR khuếch đại sẽ được phân tách trong quá trình điện di. Trên đối tượng là cây ngô, các nhà khoa học cũng đã sử dụng chỉ thị SSR trong nhiều nghiên cứu khác nhau, Senior và Heun (1993) đã công bố, do sự biến đổi cao trong số đơn vị lặp lại nên chỉ thị SSR cung cấp mức độ đa hình cao ở ngô. Kết quả dự đoán của chỉ thị SSR nhanh, đáng tin cậy và có khả năng lặp lại, chuẩn xác và có hiệu quả hơn phân tích RFLP. Phân tích SSR sử dụng gel agarose chất lượng cao rất hữu ích trong đánh giá đa dạng di truyền của các dòng tự phối ở ngô. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trên cây trồng được nhiều nhà khoa học đề cập, quan tâm nghiên cứu và đã thu được những kết quả khả quan như công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Liên và cs (2003) “Ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn dòng lúa chịu hạn”. Một số tác giả đã có những công trình nghiên cứu đa dạng di truyền các nguồn vật liệu ngô bằng chỉ thị SSR phục vụ nghiên cứu về khả năng kết hợp và xác định cặp lai: Nguyễn Thị Phương Đoài (2004)[6] đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 30 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau. Kết quả xác định được khoảng cách di truyền của các dòng ngô nghiên cứu biến động từ 0,47-0,86 và được phân thành 3 nhóm ưu thế lai. Phan Xuân Hào và cs (2004)[11] đã sử dụng 41 mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của 88 dòng ngô ( 51 dòng có nguồn gốc Việt Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT). Trong đó có 16 dòng QPM ( Quality Protein Maize), 6 dòng tham khảo từ AMBIONET. Kết quả xác định được sơ đồ phả hệ giữa các dòng nghên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn. Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ cấp. Hiện nay sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở ngô đặc biệt là chỉ thị SSR đang được Viện Nghiên cứu Ngô tiếp tục nghiên cứu và phát triển. Với những ưu điểm vượt trội và lớn mạnh của ngành CNSH, việc áp dụng phương pháp này là cần thiết để hỗ trợ phương pháp truyền thống trong công tác tạo giống ngô lai, góp phần nhanh chóng xác định được các tổ hợp ngô lai có ưu thế lai cao phục vụ sản xuất. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai cây ngô ở Việt Nam Những năm trước đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng di truyền của các dòng ngô thuần và dự đoán ƯTL chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, … Mai Xuân Triệu (1998) [4] đã sử dụng phương pháp phân tích nhóm của Mahalanobis để phân loại dòng thuần theo sự cách biệt về di truyền (phân loại dưới loài) của 24 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau của Viện nghiên cứu Ngô, Kết quả 24 dòng đã được phân thành 4 nhóm. Bùi Mạnh Cường và cs (2000) [1] đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD với 35 cặp mồi để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 7 dòng ngô đường tại Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả đã chia được 7 dòng ngô nghiên cứu thành 2 nhóm cách biệt di truyền. Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007) [10] đã sử dụng 36 mồi SSR để phân tích đa hình của 8 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau trong tập đoàn nguyên liệu của Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả khảo sát đánh giá các tổ hợp lai trên đồng ruộng và chỉ ra mối tương quan thuận giữa khoảng cách di truyền với năng suất của con lai F1 ở 8 dòng ngô nghiên cứu… Gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở các đối tượng cây trồng nói chung và ở cây ngô nói riêng đang ngày càng phát triển. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu Gồm 20 dòng ngô thuần của Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô – Đan Phượng – Hà Nội Bảng 2.1: Danh sách các dòng ngô nghiên cứu TT Tên Nguồn gốc TT Tên Nguồn gốc 1 C1 Cargi U777 11 C200 CP888 2 C24 Syngenta 70224 12 C208 C919 x AC24 3 C40 Dekalbgold 13 C329 C919 x AC24 4 C43 Dekalbgold 14 C369 C919 x AC24 5 C45 NK67 15 C222 C919 6 C84 NK67 16 C236 LVN10 7 C115 MB69 17 C245 LVN61 8 C128 LVN99 18 C275 HQ2000 9 C133 CP999 19 C477 NK4300/06A 10 C143 CP999 20 C738 Pacific747 Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: - Thiết bị thí nghiệm: Máy PCR 9700, máy quang phổ kế Ultrospec, máy chạy điện di gel agarose và polyacrylamide, máy khuấy từ gia nhiệt, máy li tâm, máy đo pH, máy soi chụp gel, tủ lạnh sâu (-80 độ C), tủ lạnh, tủ đông, lò vi sóng, …và các trang thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu. Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống eppendof, đầu côn các loại, lược gel, ống bơm gel, …. - Hóa chất tách chiết DNA: Bao gồm các loại hóa chất như EDTA,CTAB, chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Amino acetic. Đệm tách chiết DNA của mẫu lá: CTAB 2%( Tris-HCl 10mM, pH 8,0, EDTA 10mM, NaCl 100mM, beta-Mercatoethanol 0,5%,), TE( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0 ) - Hóa chất chạy phản ứng PCR: + Đệm PCR 1X( 10mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 5mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen. + MgCl2 của Fementas, Invitrogen. + dNTPs của Fementas, Invitrogen. + Mồi: hệ thống mồi SSR dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi AMBIONET (bảng 2.2). + Marker 1kb + 2Tap polymerase của Fementas + H2O cất vô trùng - Hóa chất chạy điện di và nhuộm gel: TEB 1X, TEB 5X, TEMED, APS 10%, Acrylamide 4,5%, formandehyde 36%, Bind silane, Sigma code, Na2S2O3.5H2O … - Chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đề tài: là hệ thống gồm 20 mồi SSR Bảng 2.2: Danh sách 20 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu TT Tên mồi Kiểu lặp lại Vị trí gắn mồi trên NST 1 Phi308707 AGG 1,10 2 Phi448880 AAG 9,05 3 Phi109188 AAAG 5,0 4 Phi84 GAA 10,04 5 Phi109275 AGCT 1,00 6 Phi227562 ACC 1,12 7 Phi83 AGCT 2,04 8 Phi32 AAAG 9,04 9 Phi102228 AAGC 3,04-3,05 10 Phi374118 ACC 3,02 11 Phi029 AG/AGCG*** 3,04 12 Phi72 AAG 4,00 13 Phi108411 AGCT 9,06 14 Phi109642 ACGG 2,0 15 nc133 GTGTC 2,05 16 Phi06 ACG 4,11 17 Phi1304 (TCGA)4 8,02 18 Umc1143 AAAAT 6,0 19 Phi87 ACC 5,06 20 Phi423796 AGATG 6,01 2.1.2. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô. - Kiểm tra đánh giá độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử. - Dùng chỉ thị phân tử SSR đánh giá khoảng cách di truyền, và xây dựng sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội. - Xác định mức độ đa hình, phân nhóm ưu thế lai và dự đoán các tổ hợp lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm Tách DNA tổng số Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, lấy lá non lúc cây được 3 – 4 lá. Quy trình tách triết theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) [15]. Các bước tiến hành: - Nghiền lá tươi thành thể nhuyễn, bổ sung 2-3ml đệm chiết CTAB, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml, đảo đều mẫu nhẹ nhàng. - Ủ mẫu ở 65°C trong thời gian 45-60 phút, sau đó để nguội ở nhệt độ phòng, đem ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút. - Chiết DNA 2 lần với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly tâm ở 13,000 vòng/phút mỗi lần trong 5 phút. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống eppendorf sang một ống mới. - Kết tủa DNA với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate, đảo đều ở -20°C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13,000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. - Rửa tủa DNA trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút. - Làm khô DNA sau đó hòa tan DNA trong 100µl dung dịch TE và bảo quản ở 20°C. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số Độ tinh sạch và nồng độ của DNA tổng số được đo bằng máy đo quang phổ ( Ultrospec UV/Visible-65 spectrophotomrter) Nồng độ DNA được tính theo công thức: Nồng độ DNA (µg/µl) =( OD260 x 50 x 50 µg/ml)/1000 Trong đó: OD260 là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 260 50 là hệ số pha loãng 50 µg/ml là hằng số Tỷ lệ OD260/OD280 (OD280 là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 280nm) phản ánh độ tinh sạch của mẫu. Tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8-2,0 thì DNA được coi là sạch. Chạy phản ứng PCR (PCR- Polymerase Chain Reaction): Bảng 2.3: Thành phần của 1 phản ứng PCR Dung dịch gốc Nồng độ sử dụng Thể tích (µl) Nước cất vô trùng Đệm PCR 10X MgCl2 25mM dNTP 10mM Primer 5uM Tap DNA polymerase 5U/µl DNA khuôn 10ng/ µl - 1X 2,0mM 0,25mM 0,25mM 0,5U 10ng 5,6 1,0 0,8 1,0 0,5 0,1 1,0 Tổng thể tích 10,0 Chạy chương trình phản ứng PCR: phản ứng được tiến hành trong plate 96 giếng và chạy theo phương trình cụ thể Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bước Phản ứng Chu trình nhiệt 1 Biền tính đầu tiên 940C trong 2 phút 2 Biến tính 940C trong 30 giây 3 Gắn mồi 560C trong 21 phút 4 Kéo dài chuỗi 720C trong 1 phút 5 Lặp lại từ bước 2, 29 lần 6 Kéo dài chuỗi cuối cùng 720C trong 1 phút 7 Bảo quản 40C, ∞ Biến tính sản phẩm PCR và marker DNA có khối lượng chuẩn ( thang chuẩn ФX174 DNA/HinfI, 20ŋg /µl) được biến tính ở 20°C trong 5 phút, sau đó ngay lập tức làm lạnh và giữ lạnh cho đến khi tra mẫu vào bản gel. Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR và thang chuẩn sau khi biến tính và sốc nhiệt trong đá lạnh được đưa vào chạy điện di trên gel polyacrylamide 4,5% và sau đó nhuộm bạc để biểu hiện sản phẩm điện di. Gel polyacrylamide gồm các thành phần: + Dung dịch acrylamide 4,5%: 60ml + Dung dịch APS 10% : 60ml + Dung dịch TEMED :60ml Phương pháp nhuộm bạc: - Chuẩn bị dung dịch nhuộm: hòa tan 1g AgNO3 trong 1lit nước cất hai lần khử ion, bổ sung 1,5ml dung dịch fomaldehyde 37%, để lạnh sâu trước khi dùng - Chuẩn bị dung dịch hiện: hòa tan 30g Na2CO3 trong 1 lit nước cất hai lần khử ion, làm lạnh ở nhiệt độ -20°C. Trước khi dùng thì bổ sung 1,5ml dung dịch fomaldehyde 37% + 200ml sodium thiosulfate 10mg/ml. - Sau khi điện di xong, cố định tấm kính bám gel bằng dung dịch cố định gel ( Glacial acetic acid 10%) trong 20 phút, lắc nhẹ. - Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cố định, rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5 phút - Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút, lắc nhẹ - Bản gel được rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5-10 giây - Đưa bản gel vào dung dịch hiện, lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất hiện, sau đó đổ trực tiếp dung dịch cố định (đã dùng ở trên) lên trên bản gel để dừng phản ứng hiện, duy trì trong 4-6 phút. - Rửa sạch lại bằng nước cất hai lần và để bản gel khô ở nhiệt độ phòng 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được thống kê và xử lý theo hướng dẫn của AMBIONET – CIMMYT (2004)[15]. Dựa vào thang chuẩn phiX174/HinfI, số liệu được đọc theo quy ước: các alen xuất hiện băng DNA (1), không xuất hiện băng (0),và khuyết số liệu (9). Kết quả được phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2,1 Hệ số PIC (Polymorphic Information Content- Chỉ số thông tin đa hình), PIC = 1- ΣPi ; Trong đó : Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi dòng ngô Số mồi xuất hiện ≥ 2 alen/1 locus SSR H% = x 100 Tổng số mồi sử dụng – số mồi khuyết số liệu Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) được tính cho từng dòng và từng mồi Số mồi khuyết số liệu M% dòng = x 100 Tổng số mồi sử dụng Số dòng khuyết số liệu M% mồi = x 100 Tổng số dòng nghiên cứu Khoảng cách di truyền (GD) GD = 1 – GS Trong đó: GD là khoảng cách di truyền GS là độ tương đồng di truyền được tính theo hệ số Jaccard( Lanza và cs, 1997) Phân nhóm bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Meyhod with Arithmetical Averages), CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số DNA của các dòng ngô nghiên cứu được chúng tôi tách chiết theo quy trình của Saghai- Maroof và cs (1984)[21] với một vài thay đổi nhỏ phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Sau đó, sản phẩm DNA được kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ trên máy đo quang phổ và điện di trên gel agarose 1%, Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1: Độ tinh sạch và nồng độ DNA của các dòng ngô TT Tên dòng Độ tinh sạch DNA (OD260/ OD280) Nồng độ DNA (µg/,ml) 1 C1 1,90 2,96 2 C24 1,96 2,90 3 C40 1,98 3,09 4 C43 1,94 3,00 5 C45 1,98 2,83 6 C84 1,91 2,64 7 C115 1,97 2,80 8 C128 1,96 3,20 9 C133 1,94 3,10 10 C143 1,94 2,96 11 C200 1,93 2,86 12 C208 1,89 3,20 13 C329 1,87 3,12 14 C369 2,00 2,74 15 C222 1,84 2,78 16 C236 1,81 2,90 17 C245 1,87 2,86 18 C275 1,97 2,53 19 C477 1,95 2,46 20 C738 1,86 2,90 Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD260/OD280 biến thiên từ 1,8 -2,0 nằm trong khoảng giới hạn cho phép của mức độ tinh sạch DNA. Kết quả phù hợp với yêu cầu của sản phẩm tách chiết DNA tổng số do AMBIONET-CIMMYT công bố. Ngoài ra chúng tôi còn tiến hành kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.1 Hình 3.1:kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số Hình 3.1 cho thấy các mẫu DNA đều xuất hiện một băng duy nhất, rõ nét, điều đó chứng tỏ DNA tách chiết đạt độ tinh sạch cao. Như vậy, sản phẩm tách chiết DNA tổng số của 20 dòng ngô nghiên cứu đáp ứng được yêu cầu về chất lượng và số lượng, đảm bảo đạt tiêu chuẩn để sử dụng cho các bước tiếp theo của thí nghiệm. 3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của 20 dòng ngô tẻ, chúng tôi tiến hành sử dụng sản phẩm DNA tách chiết được trên làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với 20 mồi nghiên cứu. Sản phẩm PCR của từng mồi được điện di trên gel acrylamide (điện di đứng). 3.2.1. Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô nghiên cứu Theo hướng dẫn của AMBIONET- CIMMYT thì giá trị M% phải nhỏ hơn 15% mới đảm bảo được độ tin cậy cho phép tiến hành các bước xử lý số liệu tiếp theo. Sau khi chạy xong điện di, trước khi đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 20 dòng ngô chúng tôi tiến hành tính tỷ lệ khuyết số liệu của thí nghiệm dựa vào số mồi không được khuếch đại bằng phản ứng PCR thông qua kết quả điện di. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu(M%) của các dòng ngô nghiên cứu TT Tên dòng Số mồi khuyết số liệu Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) Số mồi xuất hiện dị hợp tử Tỷ lệ dị hợp tử(H%) 1 C1 1 5 0 0 2 C24 0 0 1 5 3 C40 0 0 3 15 4 C43 0 0 1 5 5 C45 1 5 0 0 6 C84 0 0 2 10 7 C115 0 0 3 15 8 C128 1 5 2 10,5 9 C133 1 5 2 10,5 10 C143 0 0 2 10 11 C200 0 0 3 15 12 C208 1 5 1 5,26 13 C329 1 5 1 5,26 14 C369 0 0 3 15 15 C222 0 0 1 5 16 C236 0 0 1 5 17 C245 0 0 1 5 18 C275 0 0 2 10 19 C477 0 0 2 10 20 C738 0 0 3 15 Tổng trung bình 6 0,3 30 1,5 34 1,7 171,52 8,576 Xét kết quả từ bảng 3.2 cho thấy 20 mồi nghiên cứu có khả năng gắn vào DNA hệ gen của các dòng ngô nghiên cứu và nhân bản bằng phản ứng PCR, tỉ lệ mồi được khuếch đại ở các dòng ngô cao. Nhìn chung đa số các dòng nghiên cứu đều được khuếch đại, chỉ có 5 dòng là C1,C45, C128, C133, C208, C329 có một mồi không được khuếch đại và với tỉ lệ khuyết số liệu là M( dòng) 5%. Bên cạnh đó chúng tôi tiến hành phân tích tỉ lệ khuyết mồi đạt cao nhất là 10% với phi84 và tỉ lệ khuyết dao động từ 0 – 5% đối với 19 mồi nghiên cứu còn lại (bảng 3.3). Vậy trong thí nghiệm này của chúng tôi có 20 dòng ngô đều đạt tỉ lệ khuyết dòng M% <15% và tỉ lệ khuyết mồi <15%. Như vậy, số liệu cho thấy sau khi điện di sản phẩm PCR của 20 dòng ngô nghiên cứu là đáng tin cậy và được sử dụng để tính toán các hệ số quan tâm khác. Bảng 3.3: Tỷ lệ khuyết số liệu (M% mồi) ở 20 mồi nghiên cứu TT Tên mồi Số dòng khuyết số liệu M% mồi 1 Phi308707 1 5 2 Phi448880 0 0 3 phi109188 0 0 4 phi084 2 10 5 Phi109275 0 0 6 Phi227562 0 0 7 phi083 0 0 8 Phi32 0 0 9 Phi102228 0 0 10 Phi374118 0 0 11 phi029 1 5 12 Phi72 0 0 13 Phi108411 0 0 14 Phi109642 1 5 15 nc133 0 0 16 Phi06 0 0 17 phi1304 1 5 18 umc1143 0 0 19 Phi87 0 0 20 phi423796 0 0 Bước tiếp theo chúng tôi đánh giá độ thuần của 20 dòng ngô thông qua việc tính tỉ lệ dị hợp tử (H%). Trong chương trình chọn tạo giống ngô lai, bước đầu tiên phải tiến hành tạo ra các dòng tự phối từ các nguyên liệu không đồng nhất về mặt di truyền để thu được các thể đồng hợp tử - thường gọi là dòng thuần; hoặc tạo dòng thuần invitro dựa trên kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời và noãn chưa thụ tinh. Dòng thuần là nguyên liệu quan trọng để tạo ra các tổ hợp lai có ƯTL cao cũng như có các tính trạng mong muốn khác. Nhưng vì ngô là cây giao phấn điển hình nên việc tạo ra các dòng thuần 100% là rất khó. Theo AMBIONET- CIMMYT trong nghiên cứu đa dạng di truyền để phục vụ cho công tác chọn tạo giống ngô lai: yêu cầu dòng thuần phải có tỉ lệ đồng hợp tử và kiểu gen lớn hơn 80%[13] thì mới có thể dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho công tác tạo giống lai mới. Điều này có nghĩa là tỷ lệ dị hợp tử ở các dòng nghiên cứu không được vượt quá 20%. Từ những yêu cầu trên mà chúng tôi đã tiến hành đánh giá độ thuần về mặt di truyền của các dòng nghiên cứu thông qua sự xuất hiện của các băng DNA trên gel điện di theo từng locus, locus đồng hợp tử khi xuất hiện một băng DNA(1 alen), locus dị hợp tử khi xuất hiện 2 băng (2 alen khác nhau trên cùng một locus – mồi SSR). Tỷ lệ dị hợp tử được tính đối với mỗi dòng (Bảng 3.3). Kết quả ở bảng 3.3 phản ánh tỷ lệ dị hợp tử thay đổi từ 0 đến 15% giá trị trung bình 8,576%. Trong 20 dòng nghiên cứu, 5 dòng có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất bằng 15% là C40, C115, C200, C369, C738 với số mồi xuất hiện dị hợp tử tương ứng là 3 xuất hiện 2 alen khác nhau trên cùng một locus; 6 dòng cùng có 2 mồi xuất hiện dị hợp tử tương ứng với H% dao động từ 10% đến 10,5% ;5 dòng C24, C43, C222, C236, C245 có giá trị H= 5% và 2 dòng C208, C329 có giá trị dị hợp tử H là 5,26% tương ứng với một mồi xuất hiện 2 alen; có 2 dòng C1 và C45 có tỉ lệ dị hợp tử H thấp nhất bằng 0 điều đó đồng nghĩa với không có mồi nào xuất hiện dị hợp tử. Từ đó cho thấy 20 dòng ngô nghiên cứu có tỷ lệ dị hợp tử dao động từ 0 đến 15% đều có tỉ lệ dị hợp tử nhỏ hơn mức cho phép (20%) thỏa mãn yêu cầu về độ thuần di truyền trong nghiên cứu đa dạng di truyền đảm bảo độ tin cậy cho các phân tích tiếp theo. 3.2.2. Kết quả đánh giá hệ số PIC, số alen và tổng số băng DNA thể hiện trên từng mồi Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được xác đinh dựa vào tần suất xuất hiện của các băng DNA hay các alen trên mỗi locus SSR. Giá trị PIC cao tương ứng với locus đó có nhiều alen và số alen xuất hiện cao. Theo Smith và cs (1997), hệ số PIC được coi như là thước đo tính đa hình của các alen ở từng locus SSR Bảng 3.4: Hệ số PIC, số băng DNA và số alen xuất hiện trên 20 mồi TT Tên mồi Số alen xuất hiện/mồi Tổng số băng DNA/mồi Hệ số PIC 1 Phi308707 4 22 0,36 2 Phi448880 3 23 0,52 3 phi109188 3 20 0,62 4 phi084 2 19 0,24 5 Phi109275 4 21 0,55 6 Phi227562 4 20 0,61 7 phi083 3 20 0,59 8 Phi32 3 24 0,54 9 Phi102228 2 21 0,14 10 Phi374118 4 25 0,51 11 phi029 4 21 0,63 12 Phi72 3 22 0,68 13 Phi108411 3 26 0,59 14 Phi109642 2 20 0,36 15 nc133 3 21 0,54 16 Phi06 3 20 0,70 17 phi1304 2 20 0,15 18 umc1143 5 22 0,66 19 Phi87 3 21 0,58 20 phi423796 3 20 0,4 Tổng 57 448 9,92 TB 2,85 22,4 0,49 Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy giá trị PIC thay đổi từ 0,14 ở locus phi102228 đến 0,70 ở locus nc133, giá trị trung bình là 0,49. Kết quả này thấp hơn kết quả nghiên cứu của Senior và cs (1998) (0,56)[22]. Giá trị PIC thấp có thể do thời gian ngắn với 20 mồi được khảo sát nên hệ số PIC chưa đạt theo như mong muốn. Tuy nhiên giá trị PIC thu được ở trên cũng chứng tỏ các dòng nghiên cứu có sự đa dạng di truyền nhưng ở mức độ không cao. Thống kê số băng DNA xuất hiện trên từng mồi cho kết quả như sau: tổng số băng DNA thu được là 448, đạt trung bình 22,4 băng/mồi. Các mồi xuất hiện nhiều băng DNA nhất như: phi108411 với 26 băng, phi 374118 xuất hiện 25 băng (hình 3.2), phi 32 với 24 băng (hình 3.3) và phi 448880 với 23 băng. Các mồi còn lại dao động từ 19 đến 22 băng DNA Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi374118 Quan sát ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi phi374118 có thể thấy rõ 4 alen với 25 băng DNA thể hiện. Trong tổng số các mồi nghiên cứu, mồi phi374118 có nhiều nguồn thể hiện 2 alen, cụ thể: C115, C128, C143, C245, C738. Các nguồn còn lại chỉ thể hiện 1 alen. Điều đó cũng có nghĩa là với mồi phi374118 các nguồn thể hiện dị hợp tử nhiều. Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi32 Hay ở mồi phi32 thấy rõ 3 alen xuất hiện với 24 băng DNA được thể hiện và cũng có khá nhiều nguồn thể hiện 2 alen trên cùng 1 locus: C43, C200, C477 và C738. Các nguồn còn lại chỉ xuất hiện 1 alen. Hoặc quan sát hình 3.4 của mồi phi109275 chỉ có duy nhất một nguồn xuất hiện 2 alen trên cùng một locus ở nguồn C200, các băng DNA thể hiên một cách rõ nét với 4 alen. Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi109275 Quan sát kết quả trên bản gel điện di sản phẩm PCR của 20 nguồn với 20 mồi cho thấy hầu như các locus chỉ xuất hiện 1 băng DNA, thể hiện ở các mồi như: mồi phi109188, mồi phi227562 (hình 3.5), mồi phi83, mồi phi006… Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi227562 Nhìn vào ảnh bản gel ta thấy rõ với mồi phi227562 xuất hiện 4 alen rõ nét, mỗi nguồn nghiên cứu chỉ xuất hiện một alen duy nhất và có tổng 20 băng DNA, thể hiên không có sự xuất hiện dị hợp tử cũng như khuyết số