Đề tài Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

ứu sản xuất đồ uống sữa ngô từ ngô t−ơi của Viện Cơ điện, một sản phẩm đồ uống mới đ−ợc −u chuộng trên thị tr−ờng, hiện đang tiến hành triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp. Đ−ợc biết sản phẩm maltooligosacarit của đề tài KC 04.28 có nhiều ứng dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm đặc biệt lĩnh vực đồ uống nh− các loại n−ớc ép trái cây, soda, n−ớc uống tăng lực, chế biến sữa… Vì vậy chúng tôi đã ứng dụng thử sản phẩm maltooligosacarit để làm đồ uống sữa ngô từ ngô t−ơi nhằm tăng nồng độ chất khô và ổn định độ huyền phù. Đề tài đã tiến hành bổ sung sản phẩm maltooligosacaritheo theo các tỉ lệ khác nhau từ 5%; 7% và 117 10%, tất cả các mẫu đều đ−ợc đánh giá chất l−ợng cảm quan trong cùng một điều kiện thử nghiệm và nhận xét cảm quan . Ký hiệu mẫu Tỉ lệ maltooligosacarit bổ sung(%) Nhận xét k1 5 Vị ngọt mát, mùi thơm đặc tr−ng của sữa ngô k2 7 Vị ngọt mát, mùi thơm đặc tr−ng của sữa ngô, độ sánh tốt k3 10 Vị ngọt mát, mùi thơm đặc tr−ng của sữa ngô, độ sánh tốt Nhận xét: Tất cả 3 mẫu trên đều có hình thức, chất l−ợng đạt yêu cầu, các mẫu có bổ sung maltooligosacarit cho sản phẩm có vị ngọt mát dịu hơn mẫu đối chứng, thơm đặc tr−ng của sữa ngô t−ơng tự nh− mẫu đối chứng, ổn định đ−ợc độ huyền phù tốt rất phù hợp trong đồ uống sữa ngô. Vì vậy có thể dùng để thay thế một phần đ−ờng kính khoảng 10%. 4.1.9.3 ứng dụng thử nghiệm sản phẩm trong kem của Công ty Kem Băng Kỳ Lân Công ty kem Băng Kỳ Lân đã ứng dụng thử 2 sản phẩm maltooligosacarit dạng dịch(M1) và dạng bột(M2) thay thế sản phẩm chất độn nhập ngoại mà công ty đang sử dụng. Kết quả thu đ−ợc nh− sau: - Không có sự khác biệt so với chất độn nhập ngoại mà công ty đang sử dụng, nh−ng kem có độ mềm dẻo hơn, độ chảy của kem đ−ợc cải thiện. - Mẫu 1 tiện sử dụng hơn vì dễ hoà tan khi phối trộn các thành phần nguyên liệu, tỷ lệ dùng thích hợp là 10-20% - Trong quá trình bảo quản sản phẩm vẫn giữ đ−ợc tính chất ban đầu, mùi vị không thay đổi, có độ mềm, không bị kết tinh gây cảm giác xạo đá, đạt chất l−ợng để tiêu thụ trên thị tr−ờng (Thời gian bảo quản là 3 tháng). 4.1.9.4. Nhận xét thử nghiệm sản phẩm của Công ty Chế biến càphê cacao Hoàng anh Sau khi thử nghiệm ứng dụng hai mẫu sản phẩm maltooligosacarit dạng bột và dạng dịch vào sản xuất bột cacao hoà tan và bột dinh d−ỡng uống liền của công ty Chế biến càphê cacao Hoàng anh. Kết quả rút ra nh− sau: - Nhìn chung sản phẩm có sử dụng maltooligosacharit không có gì khác biệt so với các chất độn mà Công ty đang dùng để sản xuất bột ca cao hoà tan và bột 118 dinh d−ỡng uống liền - Trong hai mẫu trên mẫu bột tốt hơn vì độ ngọt cao hơn, thích hợp với tỷ lệ dùng là 5% trong sản xuất bột cacao hoà tan và 10% trong sản phẩm bột dinh d−ỡng. Mẫu dịch tỷ lệ sử dụng là 10% trong sản xuất bột cacao hoà tan và 15% trong sản phẩm bột dinh d−ỡng. 4.2. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm β -glucan 4.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Saccharomyces cerevisiae từ bã men bia. 4.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn. Sau khi tiến hành phân lập, tinh sạch, chúng tôi đã sơ bộ tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu và đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào cùng một số đặc tính sinh lý, sinh hoá của chúng. Kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu trắng hoặc màu kem, sinh sản sinh d−ỡng bằng cách nảy chồi. Tạo khuẩn ty giả. Khả năng nảy chồi: chồi 4 cực hoặc đa cực. Tế bào chủ yếu có hình elip, bầu dục và hình cầu có kích th−ớc khoảng từ 4 – 20nm, thậm chí 25nm. Một số đặc tính sinh lý, sinh hoá tế bào đã đ−ợc xác định. Bảng 4.19: Đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men phân lập Phản ứng DBB - inulin - Sinh khí từ glucoza + Đồng hoá xyloza - Tạo tinh bột - Đồng hóa tinh bột + Thuỷ phân gelatin - Đồng hoá sorboza - Sinh ureaza - Đồng hoá inositol - Sinh axit - Đồng hoá Raffinoza + Dựa vào các đặc điểm đ−ợc mô tả ở trên có thể thấy rằng chủng vi khuẩn đ−ợc phân lập và tuyển chọn thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. 4.2.1.2. Xác định môi tr−ờng thích hợp cho sự phát triển của nấm men Đã tiến hành xác định tốc độ sinh tr−ởng của chủng nấm men phân lập đ−ợc từ bã men bia (S.cerevisiae 3) và 2 chủng nấm men S.cerevisiae 1, 2 do phòng Kỹ thuật di truyền và Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Các 119 chủng S.cerevisiae nghiên cứu sau khi hoạt hoá đ−ợc nuôi lắc trên 3 loại môi tr−ờng YPD, Hansen và MTXS (bao gồm cao men sản xuất: 4%, rỉ đ−ờng 30 ml/l, pepton: 6g/l, KH2PO4: 3g/l, MgSO4: 3g/l, pH = 6). Nấm men đ−ợc nuôi ở 30OC, lắc 200vòng/phút. Mật độ tế bào đ−ợc xác định bằng ph−ơng pháp đo OD và kiểm tra số l−ợng tế bào của chúng trên môi tr−ờng đặc ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau. Kết quả đ−ợc trình bày trên bảng 4.20, 4.21 Bảng 4.20: OD600 của tế bào các chủng nấm men ở các thời điểm khác nhau S.cerevisae 1 S.cerevisiae 2 S.cerevisiae 3 Thời gian (h) Hansen YPD MTSX Hansen YPD MTSX Hansen YPD MTSX 0 0,802 0,821 0,401 0,621 0,879 0,257 0,932 0,789 0,355 15 0,894 0,987 0,684 0,693 0,993 0,465 1,023 0,920 0,658 20 1,142 1,236 0,930 0,877 1,048 0,523 1,126 0,999 0,889 24 1,220 1,520 1,040 0,939 1,371 0,725 1,166 1,225 1,029 38 1,497 1,600 1,348 1,188 1,512 1,004 1,563 1,324 1,195 43 1,593 2,241 1,643 1,278 1,976 1,657 1,782 1,675 1,325 48 2,792 2,998 2,087 2,635 2,624 2,053 0,896 0,926 1,923 63 1,531 2,538 1,745 1,834 2,073 1,621 0,887 0,875 1,027 120 Bảng 4.21: Mật độ tế bào của 3 chủng nấm men trên các môi tr−ờng nghiên cứu (CFU/ml). S.cerevisiae 1 S.cerevisiae 2 S.cerevisiae 3 Thời gian (giờ) Hansen YPD Hansen YPD Hansen YPD 0 1,0x107 1,2x107 4,0x106 3,7x107 3,0x107 0,9x107 15 3,0x108 3,5x108 0,8x107 4,0x108 5,0x108 3,3x108 20 1,0x109 1,1x109 2,9x108 5,8x108 9,0x108 5,0x108 24 2,0x109 2,5x109 1,35x109 2,15x109 1,07x109 2,03x109 38 2,4x109 3,0x109 1,8x109 2,43x109 2,6x109 2,0x109 43 3,5x109 5,0x109 2,3x109 4,1x109 3,5x109 3,1x109 48 7,8x109 8,5x109 7,7x109 6,9x109 3,0x108 3,1x108 63 2,45x109 6,0x109 3,7x109 4,8x108 3,0x108 2,8x108 Kết quả ở bảng 4. 20,4. 21 cho thấy trong môi tr−ờng Hansen và YPD, chủng 1 và 2 đạt tốc độ sinh tr−ởng cực đại ở 48 giờ, chủng 3 đạt tốc độ sinh tr−ởng cực đại ở 43 giờ. Cả 3 chủng đều phát triển tốt hơn trên môi tr−ờng Hansen nh−ng độ chênh lệch không đáng kể. Trong môi tr−ờng MTXS cả 3 chủng nấm men có tốc độ sinh tr−ởng gần t−ơng đ−ơng với 2 loại môi tr−ờng đặc hiệu trên. Vì vậy xét về mặt hiệu quả kinh tế, chúng 121 tôi chọn môi tr−ờng MTXS cho lên men thu sinh khối phục vụ cho tách chiết β- glucan sau này. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 15 20 24 38 43 48 63 Hansen YPD Đồ thị 9: Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S.cerevisae 1 (OD600nm) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 15 20 24 38 43 48 63 Hansen YPD Đồ thị 10: Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S.cerevisae 2 122 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 15 20 24 38 43 48 63 Hansen YPD Đồ thị 11: Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S.cerevisae 3 4.2.1.3. Tìm nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của nấm men Dựa vào ph−ơng pháp đo độ đục (OD600nm) nh− đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành xác định mức độ tăng tr−ởng của 3 chủng nấm men ở hai mốc nhiệt độ 280C và 300C. Kết quả trên bảng sau Bảng 4.22. OD600 của tế bào các chủng nấm men theo nhiệt độ. 280C 300C Thời gian (giờ) Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 0 0,63 0,701 0,667 0,802 0,621 0,932 15 0,745 0,774 0,702 0,894 0,693 1,023 20 1,900 1,273 1,246 1,142 0,877 1,126 24 1,936 1,447 1,293 1,220 0,939 1,166 38 2,063 1,663 1,360 1,497 1,188 1,563 43 2,205 1,747 1,589 1,593 1,278 1,782 48 2,470 1,958 1,213 2,792 2,635 0,896 63 1,678 1,618 0,989 1,531 1,834 0,887 Kết quả ở trên cho thấy tốc độ sinh tr−ởng của 3 chủng nấm men ở nhiệt độ 300C cao hơn ở 280C. Do đó nhiệt độ 30OC sẽ đ−ợc lựa chọn để lên men thu hồi sinh khối. N1: 28oC ; N2: 30o C 123 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 15 20 24 38 43 48 63 Thời gian (giờ) O D ( 60 0n m ) N1 N2 Đồ thị 12: Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S.cerevisae 1 theo nhiệt độ 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 15 20 24 38 43 48 63 Thời gian (giờ) O D ( 60 0n m ) N1 N2 Đồ thị 13: Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S.cerevisae 2 theo nhiệt độ 0 0.5 1 1.5 2 0 15 20 24 38 43 48 63 Thời gian (giờ) O D ( 60 0n m ) N1 N2 Đồ thị 14: Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S.cerevisae 3 theo nhiệt độ 4.2. 2.Tạo chủng Saccharomyces cerevisiae đột biến Từ chủng nấm men S.cerevisiae hoang dại phân lập đ−ợc, bằng ph−ơng pháp xử lý d−ới tia UV. Chúng tôi đã thu đ−ợc chủng đột biến mang các đặc điểm sau: 124 Bảng 4.23: Một số đặc điểm của chủng nấm men đột biến bằng tia UV Thời gian Đặc điểm 30 giây 1 phút 2 phút 3 phút 4 phút ĐC Hình dạng Tế bào Hình cầu, hình chanh, to Hình cầu, hình chanh, to Hình cầu, hình chanh, to Hình cầu, hình chanh, to Hình cầu, hình chanh, nhỏ Hình cầu, hình chanh, to Hình dạng khuẩn lạc To, tròn, trắng nhẵn, mép đều, bề mặt thạch không thay đổi To, tròn, trắng nhẵn, mép đều, bề mặt thạch không thay đổi To, tròn, trắng nhẵn, mép đều, bề mặt thạch không thay đổi To, tròn, trắng nhẵn, mép đều, bề mặt thạch không thay đổi To, tròn, trắng nhẵn, mép đều, tạo lỗ hổng giữa khuẩn lạc và mặt thạch To, tròn, trắng nhẵn, mép đều, bề mặt thạch không thay đổi Số l−ợng Khuẩn lạc +++ +++ +++ +++ 2.106 +++ Ghi chú: +++: số l−ợng khuẩn lạc rất nhiều. Kết luận: từ kết quả ở bảng trên, chúng tôi đã thu đ−ợc chủng S.cerevisiae 3 đột biến ở thời gian xử lý tia cực tím 4 phút. 4.2.3. Quy trình lên men thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae. - Hoạt hoá giống trên môi tr−ờng đĩa thạch và sau đó trong môi tr−ờng lỏng. - Tiến hành nhân giống cấp 1 ở quy mô bình tam giác 250ml, theo tỷ lệ đầu vào là 106CFU/ml, đến thời gian sinh tr−ởng cực đại của từng chủng trên môi tr−ờng Hansen dịch thể. - Nhân giống cấp 2 ở quy mô bình tam giác 1 lít, theo tỷ lệ giống 10%, lắc 200vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp đối với từng chủng nghiên cứu ở trên, đến giai đoạn phát triển cực đại. - Lên men ở quy mô nồi lên men 50lít (30lít môi tr−ờng), theo tỷ lệ giống 10%, cánh khuấy tốc độ 200vòng/phút, ở nhiệt độ thích hợp đối với từng chủng nh− đã nghiên cứu. 125 - Dừng lên men tại thời điểm sinh tr−ởng cực đại của từng chủng, ly tâm 4000 vòng/phút, 4OC thu nhận sinh khối. Kết quả: Từ 30lít môi tr−ờng lên men, sau khi ly tâm đã thu đ−ợc 2kg sinh khối nấm men phục vụ cho việc tách chiết β- glucan tổng số sau này. 4.2.4. Tách và thu nhận thành tế bào Saccharomyces cerevisiae. Theo ph−ơng pháp tách và thu nhận thành tế bào thứ nhất: cho dịch men (15% w/v) tự phân huỷ ở nhiệt độ 500C trong 24 giờ (Suphanthasika et all, 1997). Ly tâm 4500 vòng trong 10 phút, thu l−ợng chất rắn. Chất rắn này có trọng l−ợng khoảng 35% (w/w) chủ yếu là thành tế bào nấm men bia, giữ ở 40C cho đến khi sử dụng: từ 415g tế bào nấm men thu đ−ợc 120g thành tế bào (t−ơng ứng với 29,9% trọng l−ợng tế bào). Theo ph−ơng pháp thứ hai: cho dịch lên men ly tâm 4000v/phút, trong 20 phút, rửa 2 lần bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5. thu đ−ợc 365g tế bào nấm men. Sau đó chúng tôi tiến hành xác định nồng độ kiềm và nhiệt độ thích hợp cho quá trình tách chiết. Bảng 4.24: Trọng l−ợng thành tế bào thu đ−ợc với các nồng độ kiềm và nhiệt độ. STT Nồng độ NaOH(%) Nhiệt độ ( 0C) Trọng l−ợng thành tế bào (g) 95 70,5 100 71,3 105 69,4 1 2,0 110 68,7 95 72,8 100 73,2 105 71,3 2 3,0 110 70,6 95 94,6 100 98,5 105 97,6 3 4,0 110 97,3 95 96,5 100 97,3 105 96,6 4 5,0 110 94,1 Nồng độ NaOH đ−ợc chọn để hoà tế bào là: 1 lít 4% NaOH, và nhiệt độ đun nóng đến 1000C, khuấy mạnh trong 1 giờ. Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 1 lít n−ớc lạnh để dừng phản ứng. Ly tâm 5000 v/phút trong 15 phút. Thu cặn (thành tế bào) và bảo 126 quản ở 40C cho đến khi sử dụng: từ 365g tế bào nấm men thu đ−ợc 98,55g thành tế bào (t−ơng ứng với 27% trọng l−ợng tế bào). Nh− vậy, trọng l−ợng khô thành tế bào thu đ−ợc ở ph−ơng pháp 1 nhiều hơn ph−ơng pháp 2 nh−ng không đáng kể (chênh lệch khoảng 3%). Theo ph−ơng pháp 2 có thể xử lí thành tế bào nấm men bằng kiềm để hoà tan protein, lớp mannan, chitin của thành tế bào và các cấu tử khác. Kiềm phân huỷ các thành phần trong tế bào và tạo thành các cấu tử nhỏ hơn đi qua thành tế bào, và nh− vậy thành tế bào chỉ còn chứa bêta-glucan không bị hoà tan trong kiềm. Việc xử lý bằng kiềm đ−ợc tiến hành trong các điều kiện thích hợp có thể thu đ−ợc phần lớn cấu trúc ba chiều của thành tế bào không bị phá huỷ và tốt hơn nữa nếu β -glucan thành tế bào ở trạng thái nguyên vẹn và không bị biến đổi, nh− vậy các đặc tính sinh học của chúng sẽ không bị thay đổi. Do vậy ph−ơng pháp 2 đã đ−ợc chọn để tách thành tế bào nấm men và sản phẩm thu đ−ợc có nhiều đặc tính thuận lợi hơn trong việc tách chiết β- glucan sau này. 4.2.5. Quy trình tách chitin, manoprotein khỏi thành tế bào. Sau khi tiến hành tách và thu nhận thành tế bào nấm men của 3 chủng nấm men nghiên cứu, và từ bã men bia, chúng tôi tiếp tục tiến hành chiết thành tế bào với NaOH với các nồng độ và nhiệt độ khác nhau: Bảng 4.25: Hàm l−ợng manoprotein t−ơng ứng với nồng độ NaOH và nhiệt độ. STT Nồng độ NaOH (%) Nhiệt độ ( 0C) Manoprotein(%) 70 1,7 75 1,6 80 1,6 1 2,7 85 1,8 70 1,7 75 1,9 80 1,0 2 3,0 85 1,8 70 1,5 75 1,1 80 1,7 3 3,3 85 1,5 70 1,5 75 1,6 80 1,5 4 3,6 85 1,7 127 70 2,0 75 2,1 80 2,4 5 3,9 85 2,3 Với NaOH 3,3% ở 750C, chúng tôi chọn đ−ợc thời gian ủ 18giờ là thích hợp hơn cả. Để nguội dịch chiết đến khoảng 30-400C. Bổ sung tiếp 1lít n−ớc cất, lắc đều, tốc độ ly tâm lấy cặn ở tốc độ 4000v/ph trong 10phút, 40C. Để sản phẩm β-glucan tổng số thu đ−ợc có độ sạch cao, chiết tiếp lớp cặn thu đ−ợc bằng 700ml NaOH 3,3%, ở 75OC, khuấy liên tục trong khoảng thời gian 1 giờ. Hạ nhiệt độ dịch chiết đến nhiệt độ phòng, bổ sung n−ớc cất theo tỷ lệ 1:1 (v/v). Ly tâm 4000vòng/ph, trong vòng 10phút, 4OC,thu cặn. Sau khi tiến hành tách và thu nhận thành tế bào nấm men của 3 chủng nấm men nghiên cứu từ bã bia, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách chiết thành tế bào với NaOH 3,3% ở 750C trong 18h. Để nguội dịch chiết đến khoảng 30-400C. Bổ sung tiếp 1l n−ớc cất, lắc đều, ly tâm lấy cặn ở tốc độ 4000v/ph trong 10ph, 40C. Để sản phẩm β-glucan tổng số thu đ−ợc có độ sạch cao, chiết tiếp lớp cặn thu đ−ợc bằng 700ml NaOH 3,3%, ở 75OC, khuấy liên tục trong khoảng thời gian 1 giờ. Hạ nhiệt độ dịch chiết đến nhiệt độ phòng, bổ sung n−ớc cất theo tỷ lệ 1:1 (v/v). Ly tâm 4000vòng/ph, trong vòng 10phút, 4OC, thu cặn. 4.2.6. Thu nhận β -glucan tổng số. Sau khi loại bỏ lớp chitin, manoprotein, tiếp tục chiết lớp cặn thu đ−ợc bằng các nồng độ NaOH và các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Bảng 4.26: Nồng độ NaOH và nhiệt độ thu nhận glucan tổng số STT Nồng độ NaOH (%) Nhiệt độ (0C) Protein(%) Hexoza(%) 70 1,7 56 75 1,6 62 80 1,6 68 1 2,2 85 1,8 62 70 1,7 72 75 1,9 70 80 1,5 68 2 3,6 85 1,8 65 70 1,2 75 75 0,9 80 80 1,3 76 3 3,0 85 1,2 78 128 70 1,5 72 75 1,6 71 80 1,5 73 4 3,4 85 1,7 75 70 1,6 69 75 1,5 70 80 1,4 69 5 3,9 85 1,3 67 Qua bảng trên ta thấy nồng độ NaOH thích hợp là 3%, nhiệt độ thích hợp là 750C, thời gian thích hợp là 2giờ. Bổ sung 700ml NaOH 3%, khuấy đều, sau đó chỉnh pH đến 4,5 bằng HCl đặc. Khuấy dịch ở 750C trong 2giờ. Để nguội, ly tâm 2000v/ph trong 10phút ở 40C. Rửa 2 lần bằng cồn tuyệt đối, trộn đều trong 10phút. Ly tâm mỗi lần 2000v/ph, 10ph ở 40C. Rửa tiếp 1 lần nữa bằng dietylete, trong 10-15phút, ly tâm 3000v/ph, thu cặn, làm khô cặn ở nhiệt độ phòng. 4.2.6.1. Xác định hàm l−ợng protein và hàm l−ợng hexoza trong sản phẩm β- glucan từ các chủng S. cerevisiae nghiên cứu và từ b∙ men bia. Dựa vào đ−ờng cong chuẩn glucoza và protein, kết quả đo OD của các mẫu β- glucan tách chiết từ 4 chủng nấm men nghiên cứu và từ bã men bia, hàm l−ợng protein, glucoza đã đ−ợc xác định. Bảng 4.27: Hàm l−ợng protein và hexoza trong sản phẩm glucan của các chủng nấm men nghiên cứu. Chủng OD (595nm) OD (488nm) %protein %Hexoza S. cerevisiae1 0,734 0,400 0,99 80 S. cerevisiae2 0,872 0,272 1,30 54,4 S. cerevisiae3 0,793 0,276 1,20 55,2 S. cerevisiae3 đột biến 0,658 0,142 0,99 28,4 Bã bia 0,454 0,056 0,68 11,2 Kết quả trên bảng 4.27 cho thấy β-glucan từ chủng số 1 có chất l−ợng tốt nhất, với hàm l−ợng hexoza 80% và l−ợng protein còn lại d−ới 1%. β-glucan từ chủng số 2 và 3 vẫn còn bị nhiễm nhiều protein (trên 1%) và sản phẩm từ chủng đột biến cũng 129 nh− từ bã men bia có hàm l−ợng hexoza thấp, mặc dù l−ợng protein trong β-glucan d−ới 1%. 4.2.6.2. Xác định hàm l−ợng axit amin tự do trong sản phẩm β-glucan tách chiết từ thành tế bào của các chủng S. cerevisiae nghiên cứu Sau khi đã tiến hành các b−ớc xử lý mẫu và phân tích nh− phần ph−ơng pháp, kết quả xác định sự có mặt của các axit amin tự do trong mẫu β-glucan thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 4.28. Kết quả nhận đ−ợc cho thấy, trong sản phẩm β-glucan tách từ thành tế bào các chủng nấm men S. cerevisiae gần nh− không có các axit amin tự do. Bảng 4.28: Hàm l−ợng các axit amin tự do từ thành tế bào S. cerevisiae. STT Axit amin S.cerevisiae 1 (mg%) S.cerevisiae2 (mg%) S.cerevisiae3 (mg%) 1 Aspartic Vệt - - 2 Glutamic 0,14 0,10 0,14 3 Serine - 0,04 0,12 4 Histidine - - - 5 Glycine - 0,12 0,16 6 Threonine - 0,05 0,04 7 Alanine - - 0,03 8 Arginine - 0,23 0,13 9 Tyrosine - - - 10 Cysteine+Cyst ine - - - 11 Valine - - - 12 Methionine - - - 13 Phenylalanine - - - 14 Isoleucine - - - 15 Leucine - 0,11 0,17 16 Lysine - - - 17 Proline 2,14 0,03 0,11 Tổng số 2,24 0,68 0,90 Phổ các axit amin tự do trong mẫu β-glucan chủng S. cerevisiae 1trên máy HP- Amino Quant Series II. 130 4.2.6.3. Kiểm tra cấu trúc β – glucan bằng ph−ơng pháp cộng h−ởng từ hạt nhân. Mẫu đ−ợc phân tích trên máy quang phổ Avance 250 của Hãng BRUCKER- Viện Công nghệ Hoá học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Mẫu đ−ợc phân tích trên máy quang phổ Avance 250 của Hãng BRUCKER- Viện Công nghệ Hoá học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. - Qua phân tích mẫu chế phẩm β-glucan tách chiết từ chủng S. cerevisiae1 cho thấy chỉ có một loại mạch polysaccarit β- 1,6 glucan t−ơng đ−ơng với kết quả đo phổ của mạch β- glucan chuẩn. - Mẫu chế phẩm β-glucan tách chiết từ chủng S. cerevisiae 3 sau khi phân tích cũng cho thấy có 2 loại mạch polyme của glucoza. Trong đó, mạch 1,3 β- glucan có tỉ lệ khoảng 20%, mạch 1,6 -β- glucan có tỉ lệ khoảng 75%. Từ các kết quả phân tích chế phẩm cho thấy sản phẩm β-glucan tách chiết đ−ợc từ chủng S.cerevisiae 1 có hàm l−ợng protein thấp (xấp xỉ 1%), hàm l−ợng hexoza tổng số cao (80%). Chúng tôi chọn chủng S.cerevisiae 1 cho sản xuất β-glucan, ứng dụng trong d−ợc phẩm. 4.2.7. Ph−ơng pháp nghiên cứu tác dụng phục hồi đáp ứng miễn dịch của chế phẩm β-glucan trên thực nghiệm. Sau khi tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã tiấn hành phân tích các đối t−ợng sau: - Trọng l−ợng t−ơng đối lách, hạch lympho vùng nách và tuyến ức (so với trọng l−ợng cơ thể) 131 - Số l−ợng bạch cầu máu ngoại vi - Sự thay đổi mô học của lách, hạch lympho và tuyến ức - Khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng: + Phân lập đại thực bào ổ bụng chuột bằng ph−ơng pháp bơm rửa ổ bụng chuột với dung dịch n−ớc muối sinh lý; ly tâm rửa tế bào, pha thành huyền dịch tế bào 2ì106 tế bào/ml trong môi tr−ờng nuôi cấy RPMI. + Tiến hành kỹ thuật thực bào in vitro: ủ đại thực bào với tụ cầu S. aureus chủng Oxford 209 (do bộ môn Vi sinh vật - Học viện Quân y cung cấp), ở nhiệt độ 370C trong 30 phút, tỷ lệ đại thực bào/tụ cầu khoảng 1/10; tiếp đó ly tâm lấy cặn tế bào, dàn tiêu bản, nhuộm và đọc kết quả d−ới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 2000X Số liệu đ−ợc ghi nhận bao gồm: Tỷ lệ phần trăm thực bào = (Số ĐTB có nuốt tụ cầu / Tổng số tế bào ĐTB đếm đ−ợc)ì100% Chỉ số thực bào = Tổng số tụ cầu bị nuốt / Tổng số tế bào ĐTB có nuốt tụ cầu - Tỷ lệ tế bào lách sản xuất kháng thể đặc hiệu với hồng cầu cừu (kỹ thuật tạo quầng dung huyết Cunningham) + Gây mẫn cảm cho chuột bằng hồng cầu cừu 1 ngày sau khi kết thúc chiếu xạ + 1 tuần sau khi gây mẫn cảm với hồng cầu cừu: phân lập tế bào lách chuột, ủ với hồng cầu cừu in vitro với sự có mặt của bổ thể chuột nhắt trắng; đếm và xác định tỷ lệ tế bào lách tạo kháng thể chống hồng cầu cừu d−ới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400X - Phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu: + Gây mẫn cảm cho chuột bằng kháng nguyên OVA (albumin lòng trắng trứng): trộn lòng trắng trứng gà với tá chất Freund (tỷ lệ 1:1), tiêm 0,1 ml dung dịch, đ−ờng tiêm d−ới da, dọc sống l−ng (vào ngày thứu 3 sau chiếu xạ) + 4 ngày sau khi gây mẫn cảm: thử thách với kháng nguyên OVA bằng cách tiêm kháng nguyên vào d−ới da gan bàn chân, đánh giá đáp ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên OVA tại thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau tiêm kháng nguyên bằng cách đo độ dày bàn chân; sử dụng kháng nguyên đối chứng là BSA (bovine serum albumin), tiêm trong da gan bàn chân bên đối diện với cùng thể tích nh− tiêm OVA. 132 Bảng 4.29: Kết quả thực nghiệm Chứng SH Xạ-uống n−ớc Xạ-Bơm n−ớc Xạ-Thuốc TL cơ thể 26,42 ± 3,48 24,04 ± 2,29 23,13 ± 2,18 24,24 ± 1,8 p > 0,05 TL hạch 4,51 ± 1,34 1,97 ± 0,53 2,23 ± 0,52 2,16 ± 0,56 p > 0,05 TL lách 117,2 ± 32,71 88,97 ± 23,91 96,9 ± 24,49 91,7 ± 22,07 p > 0,05 TL tuyến ức 85,58 ± 12,61 65,5 ± 16,96 62,06 ± 16,45 62,98 ± 11,79 p > 0,05 SL tế bào tuỷ 3368 ± 790 1831 ± 480 1111 ± 356 1537 ± 725 p > 0,05 SL Bạch cầu 74,17 ± 23, 07 31,76 ± 9,32 25,55 ± 7,16 36,18 ± 10,4 p < 0,005 % Thực bào 31,05 ± 5,05 20,69 ± 2,66 18,45 ± 2,39 26,22 ± 3,49 p < 0,01 Chỉ số TBào 4,23 ± 0,58 4,11 ± 0,32 4,62 ± 0,79 3,97 ± 0,51 p < 0,05 Quầng DH 16,44 ± 7,73 28,12 ± 12,02 31 ± 10,25 49,6 ±32,27 p > 0,05 Qua bảng bảng trên ta thấy: Chuột tại các lô thí nghiệm có trọng l−ợng cơ thể, hạch, lách và tuyến ức hầu nh− không thay đổi so với đối chứng. Số l−ợng tế bào tuỷ có sự thay đổi nh−ng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số l−ợng bạch cầu tại lô thí nghiệm lớn hơn hẳn so với các lô đối chứng. Chỉ số thực bào cũng nh− % thực bào của lô thí nghiệm so với các lô đối chứng đều có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Từ những kết quả trên có thể rút ra một số kết luận - Chế phẩm có tác dụng phục hồi số l−ợng tế bào bạch cầu máu ngoại vi của động vật gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng chiếu xạ - Chế phẩm có tác dụng phục hồi khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng chiếu xạ. 133 Quầng dung huyết của hồng cầu cừu với tế bào lympho từ máu ngoại vi. Hiện t−ợng thực bào của đại thực bào ổ bụng của chuột 134 Quy trình tách chiết β- glucan Thuyết minh quy trình công nghệ tách chiết β-glucan B−ớc 1: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae sau khi tinh sạch tiến hành hoạt hoá trên môi tr−ờng Hansen đặc, sau đó tiến hành nhân giống cấp 1 trên môi tr−ờng Hansen lỏng tỉ lệ giống 10% ở nhiệt độ 300C, lắc 200 vòng/phút. Sau 24h thu dịch lên men thu sinh khối trong nồi lên men 100 lít, môi tr−ờng Hansen, nhiệt độ 300C, tốc độ khuấy 200 vòng/phút. B−ớc 2: Sau 43h nuôi cấy, ly tâm dịch nuôi cấy thu hồi sinh khối: tốc độ 4000vòng/phút, trong 15 phút, 40C. B−ớc 3: Rửa cặn tế bào 2 lần bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5. Hoà cặn tế bào trong 1 lít 4% NaOH, đun nóng đến 1000C, khuấy mạnh trong 1 giờ. Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 1 lít n−ớc lạnh để dừng phản ứng. Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae Ly tâm 5000 vòng/phút, 15 phút Lên men nhân sinh khối 43h, 300C, 200 vòng/phút Ly tâm 5000 vòng/phút, 15 phút Tách thành tế bào nấm men β- glucan Tách chitin, manprotein, 750C, 18h Ly tâm 4000 vòng/phút,10 phút, 40C 135 B−ớc 4: Ly tâm hỗn hợp phản ứng 5000 v/phút trong 15 phút. Thu cặn (thành tế bào) và bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng. B−ớc 5: Tách chitin, manoprotein: Chiết thành tế bào với NaOH 3,3% ở 750C trong 18h. Để nguội dịch chiết đến khoảng 30-400C. Bổ sung tiếp 1l n−ớc cất, lắc đều. B−ớc 6: Ly tâm lấy cặn ở tốc độ 4000v/ph trong 10ph, 40C. B−ớc 7: Chiết lớp cặn thu đ−ợc bằng 700ml NaOH 3%, khuấy đều, sau đó chỉnh pH đến 4,5 bằng HCl đặc. Khuấy dịch ở 750C trong 2h. Để nguội, ly tâm 2000v/ph trong 10phút ở 40c, àm khô cặn ở nhiệt độ phòng. Quy trình tinh sạch β-glucan β -glucan Chiết kiềm 3%, khuấy 750C, 2h Ly tâm thu cặn, 2000 v/p, 10phút, 40C Rửa 2 lần bằng cồn, 10 phút Ly tâm thu cặn, 2000v/p trong 10 phỳt Rửa lần 3 bằng dietylete, trong 15 phỳt Ly tâm thu cặn, 3000vũng/ phỳt, trong 10 phỳt Sấy khô chân không 136 Thuyết minh quy trình tinh sạch β-glucan β