Đề tài Nghiên cứu xây dựng kĩ thuật nuôi trồng vi tảo làm thức ăn cho con giống động vật biển

L,BP,BS Nitzschia,Cyclotella BS Haptophyceae Isochrysis PL,BL,BP,BS Pseudoisochrysis BL,BP,ML Dicrateria,Coccolithus BP Prasinophyceae Tetraselmis PL,BL,BP,AL,BS,MR Pyraminonas BL,BP Chrysophyceae Monoshrysis BL,BP,BS,MR Cryptophyceae Chroomonas BP Cryptomonas BL,BP Xanthophyceae Olisthodiscus BP Chlorophyceae Carteria,Chrorococum BP Brachiomonas BP Dunaliella BP,BS,MR Chlamydomonas BP,BS,MR Chlorella BL,BP,FZ,MR,BS Scenedesmus FZ,MR,BC Cyanophyceae Spirulina PL,PP,BS,MR Bảng 1: Các lớp chi vi tảo sử dụng trong chăn nuôi thuỷ sản. Ghi chú: PL:ấu trùng tôm. AL:ấu trùng bào ngư. BL:ấu trùng nhuyễn thể hai vỏ. MR:Luân trùng. ML:ấu trùng tôm nước ngọt. BS:Artemia. BP:Hậu ấu trùng nhuyễn thể hai vỏ. SC:Saltwatercopepods. FZ:Phù du động vật. Các loài tảo trên có kích thước vài àm đến hơn 100àm,đa số là nước mặn và được sản xuất làm thức ăn tươi sống.(Đặng Đình Kim, 1998). I.3.6. các phương pháp nuôi thu sinh khối vi tảo. Việc nuôi thu sinh khối vi tảo có thể tiến hành theo các phương pháp sau: -Phương pháp gián đoạn : là phương pháp nuôi thu sinh khối gián đoạn theo mẻ sau đó thiết bị lại được khử trùng ,bổ sung môi trường và giống cho mẻ mới.Giống phải luôn sẵn sàng cung cấp đủ cho các mẻ. Ưu,nhược điểm của phương pháp là :kĩ thuật nuôi đơn giản,chi phí thấp, dễ sử lý khi gặp tạp nhiễm,nhưng vận hành khó khăn,tốn nhiều nhân lực. -Phương pháp nuôi bán liên tục: sau khi thu hoạch sinh khối tảo được giữ lại 1 phần từ 10-50% tuỳ theo từng loại tảo và từng trường hợp,điều kiện nuôi sau đó tiếp tục bổ sung môi trường ,cứ làm như vậy vài mẻ thì khử trùng toàn bộ và bổ sung giống và môi trường mới hoàn toàn cho một chu kì mới. Ưu,nhược điểm của phương pháp:Kĩ thuật nuôi đơn giản,khá hiệu quả,dễ xử lý khi tạp nhiễm nhưng vận hành phức tạp,tốn nhiều nhân công lao động. -Phương pháp nuôi liên tục: là phương pháp nuôi thu sinh khối mà môi trường nuôi đi vào liên tục và dịch tảo đi ra liên tục. Ưu,nhược điểm của phương pháp:Hiệu quả cao,năng suất cao,vận hành đơn giản nhưng đồi hỏi thiết bị phức tạp,đắt tiền,kĩ thuật cao,khó sử lý khi tạp nhiễm. -Phương pháp nuôi trong nhà: toàn bộ hệ thống nuôi được bố trí trong nhà nuôi và sử dụng hoàn toàn bằng ánh sáng nhân tạo. Ưu,nhược điểm của phương pháp:Có thể dễ dàng khống chế được các yếu tố tác động như nhiệt độ, ánh sáng nhưng giá thành cao. -Nuôi ngoài trời :Việc nuôi tảo cũng như bố trí hệ thống nuôi được tiến hành trong điều kiên tự nhiên,tận dụng được ánh sáng mặt trời nên chi phí thấp hơn nhưng khó khăn trong việc khống chế các điều kiện môi trường tự nhiên, tính ổn định không cao. -Nuôi trong hệ thống kín:Toàn bộ môi trường nuôi được cách li với môi trường bên ngoài bởi hệ thống kín. Ưu,nhược điểm của phương pháp:Hạn chế được khả năng tạp nhiễm nhưng chi phí cao,thiết bị phức tạp. -Nuôi trong hệ thống hở:Thiết bị đơn giản hơn,chi phí giảm nh dễ bị tạp nhiễm nhưng. ở Việt Nam người ta thường tiến hành theo phương pháp nuôi từng đợt và phương pháp bán liên tục. chương 2 đối tượng và CáC phương pháp nghiên cứu. Ii.1. Đối tượng nghiên cứu. Hình2 : Chủng vi tảo Nannochloropsis sp. II.1.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu là chủng Nannochloropsis sp có nguồn gốc từ Trung Quốc và được cung cấp bởi TS. Nguyễn Hữu Đại,Viện Hải Dương Học Nha Trang dưới dạng chủng sản xuất. Khoá phân loại của đối tượng như sau: Nhóm tảo(algae) . Ngành tảo lục (Chlorophyta). Họ (family): Monodopsidaceae. Lớp (class): Eustigmatophyceae. Giống, loại (genus): Nannochloropsis. Chủng, loài (Species): Nannochloropsis sp. Để phân loại chủng N.sp với các vi tảo khác người ta dựa vào các đặc điểm đặc thù của chúng như : sự thiếu các sắc tố quang hợp chlorophyll b, c , có thành phần axít béo ecosapentaenoic acid (EPA) cao (Maruyanma et al.,1986) và sự tồn tại của các sterol đặc thù (Pattersol et al.,1994; Gladu & Pettersol, 1995). Ngoài ra người ta còn sử dụng kĩ thuật phân tử xác định chuỗi gen rARN 18s để phân biệt và thiết lập nên khoá phân loại. Chủng Nannochloropsis sp lần đầu tiên được mô tả bởi Hibbered (1981). N.sp rất khó xác định và phân biệt với các loài tảo lam dưới kính hiển vi quang học vì chúng có kích thước nhỏ bé. N.sp là những cá thể đơn bào có dạng hình hạt như hình...., kích thước từ 2-3 àm.Dưới kính hiển vi điện tử, người ta quan sát thấy những túi mỏng dẹt bên trong tế bào chất, kết nối với màng tế bào chất và màng nhân (Santos & Leedale, 1995). Ngoài ra trong tế bào chất còn có các bào quan khác như lục lạp, nhân, màng thylacoid, và các giọt lipid. II.1.2. Thành phần hoá học. Nannochloropsis là giống tảo có nhiều thành phần axit béo,đặc biệt là các axít béo không no với hàm lượng cao và cân đối.Mà các axít béo không no được xem như là chỉ tiêu hàng đầu để đánh giá giá trị dinh dưỡng của một loài vi tảo khi sử dụng chúng làm thức ăn trong chăn nuôi thuỷ sản.Hàm lượng lipid chiếm 18%, Protein chiếm 35%,hydratecacbon chiếm 7,8% trọng lượng khô (Brown,1991). Thành phần Eicosapentaeinoic acid của Nannochloropsis cao chiếm khoảng 28,8% tổng số acid béo, hàm lượng Vitamin C và Riboflavin đạt giá trị tương ứng là 8mg/g và 50àg/g trọng lượng khô(Volkman và cộng sự,1993), có đầy đủ 19 loại axit amin cần thiết cho cơ thể động vật ( Brown và cộng sự,1993) do đó chúng đã được sử dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Brown và cộng sự (1993) khi nghiên cứu Nannochloropsis đã thấy rằng thành phần protein thay đổi mạnh ở các pha sinh trưởng khác nhau, cao nhất ở giữa và gần cuối pha logarit,hàm lượng này giảm dần ở pha cân bằng. Tương tự như hàm lượng protein,hàm lượng lipid tổng số cũng biến đổi rất nhiều trong điều kiện dinh dưỡng bị hạn chế(Sukenik, 1986, McGinnis và cộng sự ,1991,trích theo Reintan và cộng sự ,1997).Dưới đây là bảng các thành phần hoá học của tảo Nannochloropsis sp (% khối lượng khô): STT Thành phần % trọng lượng khô 1 Khối lượng khô 18.40% 2 năng lượng từ 10ml sinh khối khô 44.4 calo 3 Protein tổng số 52.11% 4 Carbohydrate 16% 5 Lipid tổng số 27.64% 6 Vitamin C 0.85% 7 Chlorophyl a 0.89% Bảng 2: Thành phần hoá học của tảo Nannochloropsis. Thành phần các axit amin và các axít béo của tảo Nannochloropsis được thể hiện theo bảng sau: STT Thành phần axit amin(a) % Thành phần axit béo (b) % 1 Aspatic 8.4 Lauric acid 0.35 2 Glutamic 9.48 Myristic acid 3.29 3 Serin 3.31 Pentadecanoic acid 0.23 4 Histidin 0.61 Palmitic 16.57 5 Glysin 5.11 Palmitoleic acid 21.25 6 Prolin 9.2 Heptadecanoic acid 0.36 7 Alanin 1.54 Stearic acid 0.54 8 Arginin 3.57 Oleic acid 5.3 9 Tyrosin 1.06 Linoleic acid 3.4 10 Threonin 5.28 Linolenic acid 0.47 11 Valin 6.9 Octadecatetraenoic 0.47 12 Methionin 2.64 cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid 0.21 13 Phenynalanin 1.92 Arachidonic acid(AA) 3.94 14 Isoleucin 1.47 Eicosatetraenoic acid 0.21 15 Leucin 8.57 Eicosapentaenoic acid 31.42 16 Lysin 9.07 Docosahexaenoic acid 0.22 Bảng 3: Thành phần axitamin và axit béo của tảo Nannochloropsis. (a):Theo số liệu của Brown và cộng sự,1993. (b):Theo số liệu (2) Như vậy các axit amin không thay thế ở tảo Nannochloropsis sp như : Phenylalanin,methiolin,Leucin,Lizin...,những axit béo không no quan trọng như EPA,DHA,AA,có hàm lượng khá cao, và được đánh giá là cao hơn hẳn ở tảo chlorella sp và ở nấm men (Kobayashi và CS, 1995). Thành phần sắc tố quang hợp: Nannochloropsis.sp thiếu sắc tố chlorophyll b, c (Whittle and Caselton, 1975). Sắc tố quang hợp chính ở chủng N.sp là violaxanthin, vaucherxanthin, beta-caroten (Anita và Cheng, 1982; Karsol et al .,1996). Zeaxanthin và anthraxanthin là hai sắc tố phụ nhưng lại được xem là thành phần của chu trình xanthophyll ở vi tảo Nannochloropsis (L.M.Luban,personal communication). II.1.3. Sinh trưởng và phát triển. Quá trình phát triển của vi tảo Nannochloropsis được chia thành 4 pha chính gồm: pha thích nghi, pha luỹ tiến, pha cân bằng, và pha tàn lụi. Với các đặc trưng của các pha như sau: -Pha thích nghi: Dung dịch tảo có màu xanh trong. -Pha luỹ tiến: Dung dịch tảo có màu xanh đục. -Pha cân bằng: Dung dịch tảo có màu xanh đậm, có độ đục cao. -Pha tàn lụi: Dung dịch tảo nhạt màu, trở lên trong, tảo kết tụ lắng xuống đáy, có màu xanh bạc, có mùi tanh. II.1.4. ứng dựng của tảo Nannochloropsis. Khi sử dụng 100% Nannochloropsis cho ấu trùng sò huyết ở giai đoạn sống trôi nổi, có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất, và tỷ lệ sống cao nhất. Nhưng ở giai đoạn sống đáy của sò huyết lại sử dụng hỗn hợp vi tảo Nannochloropsis (50%), Chaetoseros sp (25%) và Isochrysis sp (25%) thì sò có tốc độ tăng trưởng nhanh và tỷ lệ sống cao. Đó là do ở giai đoạn ấu trùng sò (cũng như các loại ấu trùng khác) có kích thước nhỏ chỉ 60-120 àm và chỉ có khả năng sử dụng vi tảo có kích thước nhỏ như Nanochloropsis (2-3 àm) làm thức ăn(Lê Trung Kì, Viện nghiên cứu thuỷ sản III, 2004). Vi tảo Nannochloropsis có hàm lượng lipid các axít béo không no cao, đặc biệt là các axít béo cần thiết cho sự phát triển của ấu trùng động vật biển. Lipid và các axít béo không no (polyunsaturated fatty acids) như omega-3, omega-6... là những chất thiết yếu không thể thiếu được trong cơ thể sống và chỉ được bổ sung vào cơ thể sống qua con đường thức ăn. Do đó chúng được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng con giống động vật biển. II.2. Các phương pháp nghiên cứu. II.2.1. Các phương pháp phân lập vi tảo. Việc phân lập vi tảo có thể tiến hành bằng nhiều cách như kỹ thuật dùng micropipet, kỹ thuật phun, kỹ thuật thay đổi áp suất thẩm thấu, dùng thạch nghiêng Trong điều kiện phòng thí nghiệm chủ yếu dùng phương pháp thạch nghiêng: Dùng pipet lấy khoảng 0,1-0,5ml dịch tảo rót lên bề mặt thạch đã cứng,dùng chang thuỷ tinh dàn đều lên bề mặt thạch, sau 3-5 ngày có thể thu được tập hợp các tế bào tảo đồng nhất. II.2.2. Làm sạch vi tảo. Có các phương pháp như: phương pháp li tâm, phương pháp dùng tia cực tím, phương pháp sử dụng kháng sinh, phương pháp lọc. Trong đó người ta thường hay dùng phương pháp lọc. Phương pháp lọc dùng để lọc tảo sợi khỏi vi khuẩn hoặc lọc tảo có kích thước nhỏ như tảo Nannochloropsis (2-4 micromet) khỏi những tạp nhiễm có kích thước lớn. Các loại lưới lọc thường sử dụng là 10-30-100 micromet. II.2.3. Bảo quản giống tảo. Sau khi thu nhận được tảo sạch từ tự nhiên hoặc từ các tập đoàn giống khác, giống tảo cần phải được bảo quản để có thể xây dựng được một tập đoàn giống. Việc bảo quản giống bao gồm các thao tác sau: -Khử trùng: Khử trùng dụng cụ và môi trường bảo quản bằng phương pháp thích hợp. Có thể khử trùng bằng nồi áp suất hoặc bằng màng lọc để tránh làm kết tủa các muối trong môi trường nước biển đối với tảo nước mặn. -Chiếu sáng và nhiệt độ: Để duy trì và giữ giống tảo thông thường người ta chọn phương án dùng ánh sáng yếu và nhiệt độ từ 15 - 200C. -Cấy truyền: Tần số cấy truyền phụ thuộc vào điều kiện giữ giống và loài tảo. Các loài tảo đơn bào hay đa bào không chuyển động có tần số cấy chuyển thưa hơn so với các loài có roi. -Môi trường dinh dưỡng: Tuỳ từng loài tảo mà có môi trường dinh dưỡng thích hợp riêng bao gồm các thành phần là: các muối khoáng đa lượng, vi lượng, các vitamin cần thiết. II.2.4. Các phương pháp đánh giá sinh trưởng tế bào vi tảo. Có nhiều phương pháp đánh giá sinh trưởng tế bào vi tảo trong đó phương pháp cảm quan là nhanh nhất, có thể xác định khi có sự chênh lệch lớn về tốc độ sinh trưởng. Tảo lục phát triển tốt có màu xanh thẫm, độ đục cao, tảo kém phát triển nhiễm tạp có thể xanh vàng, độ đục không cao thậm chí tảo chết làm môi trường trở nên trong. Các phương pháp đánh giá sinh trưởng tế bào gồm: Phương pháp đo mật độ quang. Lấy mẫu từ các môi trường tảo cần so sánh đem đo mật độ quang. Hiện tại đang sử dụng phương pháp này là chủ yếu do thời gian nhanh, thao tác đơn giản, cho biết khả năng tăng sinh khối chứ không trực tiếp xác định được số lượng tế bào. Việc đo OD được tiến hành ở kính lọc 680nm (là bước sóng mà môi trường cần đo hấp thụ ánh sáng mạnh nhất). Môi trường đối chứng là môi trường nuôi không chứa vi tảo. Đếm tế bào. Có thể đếm trực tiếp bằng kính hiển vi hoặc bằng buồng đếm hồng cầu. Môi trường cần xác định mật độ tế bào nếu được dự đoán có mật độ tế bào rất lớn thì cần được pha loãng 101,102,103...lần rồi đem đếm. Việc xác định chính xác mật độ tế bào tảo có thể cho ta kết luận chính xác hơn về sự so sánh giữa các môi trường vi tảo nuôi ở những điều kiện khác nhau, ở các thời điểm khác nhau. * Thiết lập đường chuẩn giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Thông thường để xác định mật độ tế bào của vi sinh vật trong dung dịch lỏng, người ta phải tiến hành đếm trên buồng đếm hồng cầu nhưng biện pháp này phức tạp, thời gian lâu. Do đó người ta thực hiện đo độ đục tế bào bằng máy so màu quang điện ở bước sóng 680 nm rồi từ đường chuẩn OD-mật độ tế bào xác định được mật độ tế bào. Việc thiết lập đường chuẩn được tiến hành như sau: Chọn mẫu môi trường nuôi tảo có chất lượng tốt, có độ đồng đều cao, ít bị kết lắng, có độ sánh, đem pha loãng 1 ; 2 ; 4 ;.. lần. Đo mật độ quang ở bước sóng 680nm. Sau đó tiến hành đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tế bào tảo trên 1ml môi trường nuôi ở các mẫu pha loãng tương ứng. Tiến hành như vậy với 2 mẫu tảo .Ta lập bảng tương ứng giữa mật độ quang và mật độ tế bào tảo đo được và thiết lập đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Do mật độ tế bào tỷ lệ thuận với độ đục của môi trường hay tỷ lệ với mật độ quang của mẫu đó ,do đó đường chuẩn phải có dạng đường thẳng và đi qua gốc toạ độ. Môi trường so sánh khi đo mật độ quang là môi trường pha nuôi tảo. Đường chuẩn có dạng đường thẳng: y = ax + R2 Với : a là hệ số góc. R2 là sai số khi đo. Kết quả đo thu được theo bảng sau: Mật độ quang 0.000 0.180 0.278 0.365 0.557 0.741 Mật độ tế bào(x107TB/ml) 0.000 0.281 0.450 0.623 0.897 1.178 Bảng 4: Các giá trị xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn thu được như hình dưới: OD(680nm) tế bào/ml(x107) Hình 3: đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Như vậy từ đường chuẩn trên ta có thể xác định được mật độ tế bào bằng cách xác định mật độ quang ,từ đó một cách tương đối có thể xác định mật độ tế bào bằng đường chuẩn. Phương pháp xác định trọng lượng khô. Phương pháp dùng đánh giá tăng trưởng tế bào. Phương pháp gồm các bước sau: thu mẫu, ly tâm thu sinh khối, sấy và cân trọng lượng khô. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyl. Là một trong phương pháp hoá học để xác định nhanh tăng trưởng của vi tảo. Phương pháp gồm các bước: Tách tế bào, chiết rút chlorophyll, đo độ hấp thụ (A) ở các bước sóng 630nm, 665nm, 645nm, và tính hàm lượng chlorophyll theo công thức: Chl a = 15,6 x A665 - 2,0 x A645 - 0,8 x A630. Chl b = 25,4 x A645 - 4,4 x A665 -10,3 x A630. Chl c = 109 x A630 - 12,5 x A665 - 28,7 x A645. Tuy nhiên ở vi tảo Nannochloropsis thiếu chlorophyl b,c nên chỉ xác định được chlorophyl a. II.2.5. Phương pháp đo cường độ quang hợp. Dùng điện cực oxi như một loại tế bào điện hoá để đo tốc độ thải oxi của tảo trong quá trình quang hợp. Tốc độ thải oxi là một thông số quan trọng cho thấy hoạt tính trao đổi chất của vi tảo. Hình 4:Tốc độ tăng oxi biểu kiến theo thời gian. * Kĩ thuật xác định cường độ quang hợp như sau: -Mẫu cần đo ban đầu được đặt trong buồng tối để nồng độ oxi giảm đến mức tối thiểu. -Đậy kín, đặt mẫu cần đo vào vị trí đo, bật đèn halogen tức thời. -Đo nồng độ oxi tại thời điểm t1 bằng điện cực oxi (Ct1). -Đo nồng độ oxi tại thời điểm t2 bằng điện cực oxi (Ct2). -Đo hàm lượng chlorophyll có trong mẫu đo (m) -Tính toán cường độ quang hợp. Cường độ quang hợp tính bởi công thức: Iqh = (mg O2/mg chl.h). Trong phương pháp này để đơn giản hoá, pha loãng các mẫu cần đo sao cho có mật độ quang đo ở bước sóng 600 nm (đo hàm lượng chlorophyll) bằng nhau và bằng giá trị thống nhất là 2 (trong nghiên cứu của chúng tôi) rồi tiến hành đo cường độ quang hợp. Các mẫu đo cường độ quang hợp lúc này có m như nhau, có khoảng thời gian delta t = t2-t1 như nhau.Nồng độ oxi ban đầu thường gần bằng nhau, thấp hơn một chút so với nồng độ oxi trong nước( 5,1- 5,8 mg/l) như vậy chỉ cần dựa vào nồng độ oxi đo được sau thời gian t(khoảng 5 phút) Ct là có thể so sánh được cường độ quang hợp của các mẫu thí nghiệm. Đem các mẫu đó nuôi trong cùng điều kiện ,môi trường để so sánh khả năng sinh trưởng của chúng. II.3. Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu. II.3.1. Dụng cụ, thiết bị. * Các dụng cụ: ống đong, cốc đong, pipet, đầu côn, nhiệt kế thuỷ ngân. * Các thiết bị nuôi vi tảo trong thí nghiệm đều là các thiết bị bằng thuỷ tinh hoặc bình nhựa trong suốt để ánh sáng có thể chiếu xuyên qua dễ dàng.Các thiết bị bao gồm: -Thiết bị bảo quản giống : ống nghiệm 50ml, 100ml, đĩa petri. -Thiết bị nhân giống sơ cấp: bình tam giác 150 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml. -Thiết bị nhân giống lớn: thẩu2l, bình 5l, bình 25l hoặc lớn hơn nữa là thùng 50l. -Bể xi măng nuôi sinh khối 300 lit. Các thiết bị này đều có thể nhập nội hoặc tự đặt mua. * Thiết bị khử trùng khô. Dựa trên nguyên tắc khử trùng bằng không khí nóng, nhiệt độ từ 165-1800C trong 2 giờ. * Thiết bị khử trùng ướt. Thiết bị hoạt động trên nguyên tắc tiêu diệt vi sinh vật và bào tử ở nhiệt độ cao của hơi bão hoà. Đối với môi trường cần khử trùng ở 0,08-0,1at trong vòng 30 phút. * Máy khử trùng Ozon. * Buồng cấy vô trùng. * Máy lắc. Hiệu Gerharadt.Tốc độ 120 nhịp/phút. * Hệ thống sục khí. Hệ thống bao gồm: bình chứa CO2, máy nén khí, hệ thống ống dẫn, hệ thống lọc khí, thiết bị khử trùng bằng đèn cực tím. Sử dụng máy nén hiệu RESUN có nhiều loại khác nhau,có công suất thay đổi từ 35W hoặc lớn hơn,tạo áp suất P=0.03Mpa,năng suất 60lít/phút.Thiết bị nhập ngoại của Trung Quốc. * Bơm chìm. Hiệu Lifetech AP 1300,công suất 8,5W.Có thể dùng loại công suất lớn hơn đến AP 3500 (25W).Thiết bị nhập từ Trung Quốc. * Kính hiển vi quang học. Nhãn hiệu: Laboval-4.Với các độ phóng đại:3,2-10-40-100 lần. Nguyên tắc hoạt động: dựa trên nguyên tắc về sự tạo ảnh qua hai thấu kính . * Buồng đếm hồng cầu: Bukne,do Liên Xô cũ sản xuất. * Thiết bị đo oxy hoá khử. Nhãn hiệu:IMS-DOT 01.Nhập nội,do Viện Công Nghệ Vật Liệu thiết kế và sản xuất. Nguyên tắc: đo điện trên thế điện kế căn cứ vào sự sai khác điện thế giữa hai điện cực: điện cực cần đo và điện cực so sánh Ag/Pb. * Thiết bị so màu quang điên. Nhãn hiệu Pharmacia Biotech. Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên sai khác giữa khả năng hấp thụ (hay phát xạ) ánh sáng của môi trường nuôi tảo và môi trường so sánh thông qua tế bào quang điện. * Cân điện tử. Nhãn hiệu Mettler toledo. Max 210g Sai số e =1mg. Min 10g d =0,1mg. II.3.2. Môi trường, hoá chất sử dụng trong thí nghiệm. * Môi trường sử dụng trong phân lập và bảo quản giống vi tảo là môi trường Walne - aga. Cách pha môi trường Walne như sau: - Pha môi trường A:(Pha trong 1lít nước cất) NaNO3: 100g. Na2EDTA,NaH2PO4: 20g. H3BO3: 33,6g. MnCl2.4H2O: 0,4g. FeCl3: 0,8g. 1ml dung dịch B. - Pha môi trường B:(pha trong 100ml nước cất,đun nóng ,hoà tan) ZnCl2: 2,1g. CoCl2: 2,0g. (NH4)6Mo7O24.4H2O: 0.9g. CuSO4: 2,0g. Dùng 1ml môi trường A pha cho 1lít môi trường nuôi. Các loại hoá chất chủ yếu nhập ngoại từ Trung Quốc. * Môi trường trong nhân giống sơ cấp là môi trường Walne cải tiến, có bổ sung vitamin các loại: Vitamin B1, B12, H. * Môi trường trong nhân giống thứ cấp và thử nghiệm nuôi sinh khối là môi trường phân bón :phân đạm, phân lân,nhập nội, hoá chất ure, axit citric nhập ngoại từ Trung Quốc. chương iii kết qủa và bàn luận. III.1. Nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm. III.1.1. Phân lập lại và bảo quản giống. Vì đối tượng nghiên cứu do nhà cấp giống cung cấp dưới dạng chủng sản xuất nên chúng tôi phải tiến hành phân lập lại để thu được giống thuần chủng phục vụ cho nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng môi trường Walne - aga (aga-aga 4g/lit) phân lập lại và bảo quản vi tảo. * Phân lập lại: Chúng tôi sử dụng phương pháp cấy chuyển trên môi trường thạch đĩa. Dịch chứa vi tảo được trải đều trên bế mặt môi trường thạch đĩa sau đó đem bảo quản nơi thoáng mát, sạch sẽ, sử dụng ánh sáng đèn neon (2 bóng 40W). Đảm bảo điều kiện vi hiếu khí. Sau 25 ngày thu được kết quả vi tảo phát triển tốt trên môi trường thạch đĩa. * Bảo quản: Sau khi vi tảo trên môi trường thạch đĩa đã phát triển tốt (20 - 30 ngày), các phần tảo phát triển tốt mọc lan ra tách biệt khỏi các tạp nhiễm được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống thuần khiết và tạo nguồn giống cho nhân giống sơ cấp. Giống trong môi trường thạch nghiêng được bảo quản giống như điều kiện bảo quản giống trên môi trường thạch đĩa. Kết quả bảo quản giống trong môi trường thạch nghiêng sau 25 - 30 ngày như hình 4. iii.1.2. Nhân giống sơ cấp. Sau khi thu được giống vi tảo thuần chủng trong môi trường thạch nghiêng, chúng tôi tiến hành nhân giống sơ cấp trong các bình tam giác theo thứ tự lần lượt từ ống nghiệm sang bình tam giác 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml. Sử dụng môi trường Walne. Nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm, môi trường và dụng cụ được khử trùng ướt trong điều kiện 0,1 at trong 30 phút. Nhiệt độ nuôi cấy 200C -250C, ánh sáng 3000 - 4000 lux, điều kiện hiếu khí lỏng lắc. Kết quả nhân giống sơ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm sau 8-10 ngày thu được như hình 6. Hình 5 :bảo quản vi tảo trong môi trường thạch nghiêng. Hình 6: Nhân giống sơ cấp và thứ cấp trong phòng thí nghiệm. III.1.3 Nhân giống thứ cấp. Giống sạch từ nhân giống sơ cấp được nhân giống thứ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sử dụng môi trường Walne, nuôi trong bình thuỷ tinh 2 lít, chế độ khử trùng nhiệt. Điều kiện nhiệt độ 20-250C, ánh sáng 5000 - 6000 lux, sục khí vô trùng. Kết quả nhân giống thứ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm như hình 6. Sau 7 ngày thu được OD = 5,36 tương đương 9,5 triệu tế bào/ml. III.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. III.1.4.1. Xác định phương pháp khử trùng phù hợp với điều kiện nuôi vi tảo trong thí nghiệm cũng như khi ứng dụng vào sản xuất. Đối với việc bảo quản giống và nhân giống nhỏ thì việc khử trùng bằng phương pháp khử trùng ướt (0,1 at) là cần thiết để đảm bảo độ vô trùng cao. Tuy nhiên trong nhân giống lớn cũng như khi ứng dụng vào sản xuất, việc khử trùng môi trường nuôi bằng phương pháp nhiệt có những hạn chế của nó. Việc khử trùng dụng cụ nuôi nhân giống lớn bằng nước zaven 10%, cồn cũng tỏ ra không hiệu quả, đó là do: Giá thành cao. Thao tác khó khăn. Thời gian lâu. Việc khử trùng nhiệt có thể làm tủa một số muối khoáng có trong nước biển và muối khoáng bổ sung vào môi trường nuôi, làm thay đổi thành phần của môi trường nuôi ,ảnh hưởng tới sự phát triển của vi tảo. Đặc biệt khi đưa ra sản xuất với việc khử trùng môi trường cho 1 mẻ từ nửa khối tới vài khối thì việc khử trùng nhiệt và việc khử trùng dụng cụ là không kinh tế . Hiện nay có một phương pháp khử trùng khá là hiệu quả cả về mặt kinh tế lẫn thao tác mà đang được sử dụng đó là phương pháp khử trùng bằng Ozon. Tuy nhiên việc khử trùng bằng chất oxi hoá mạnh là ozon có thể tiêu diệt được vi sinh vật cùng bào tử của chúng nhưng cũng có thể làm oxi hoá các chất cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của vi tảo. Do đó cần phải đánh giá sự phát triển của vi tảo trong môi trường và dụng cụ khử trùng bằng phương pháp ozon. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu như sau : Ba mẫu tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiệt độ 20-280C ,sử dụng môi trường cơ bản Walne làm môi trường nuôi vi tảo, ánh sáng đèn Neon (4 đèn) , nuôi trong bình thuỷ tinh 2 lít, có sục khí vô trùng. Chỉ khác nhau về chế độ khử trùng như sau: Mẫu 1 : (Mẫu đối chứng ĐC ) Dụng cụ được khử trùng bằng cồn 90 độ, môi trường được khử trùng bằng đun sôi trong 30 phút. Mẫu 2 : Dụng cụ cùng môi trường nuôi được khử trùng bằng ozon. Môi trường gốc được bổ sung sau khi tiến hành khử trùng (OZON1). Mẫu 3 : Dụng cụ cùng môi trường nuôi được khử trùng bằng ozon. Môi trường gốc được bổ sung trước khi tiến hành khử trùng (OZON2) Bổ sung lượng giống như nhau, cùng 1 nguồn giống. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh khả năng phát triển của vi tảo. Kết quả đo OD tại các thời điểm khác nhau đối với các các mẫu thí nghiệm về điều kiện khử trùng như sau: ngày 0 1 2 3 4 ĐC 0,128 0,144 0,18 0,244 0,32 OZON1 0,135 0,149 0,187 0,26 0,344 OZON2 0,147 0,16 0,188 0,235 0,3 5 6 7 8 9 10 0,382 0,477 0,527 0,521 0,495 0,468 0,412 0,492 0,546 0,541 0,526 0,486 0,36 0,401 0,389 0,36 0,335 Bảng 5 :OD của các mẫu thí nghiệm về điều kiện khử trùng. Từ các giá trị OD đo được ta xây dựng được các đường cong sinh trưởng như hinh 7. * Bàn luận: Mẫu1 đạt được mật độ tối đa là cao nhất (OD=0,532 tương đương 9,46 triệu tế bào/ml) mẫu 2 đạt tối đa là 0,531 Cũng tương đương với mẫu 1 nhừng thời gian đạt tối đa chậm hơn.Còn ở mẫu 3 ,vi tảo phat triển hoàn toàn kém hơn so với ở hai mẫu kia,mật độ tối đa chỉ đạt 0,452 tương đương 7.47 triệu tế bào/ml, thời gian đạt cực đại xớm hơn và pha cân bằng ngắn hơn. Như