Đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương

tiêu hoá. 1.1.7 Dạng bào chế [5] [6]. - Viên nang 25mg, 50mg, 75mg. - Viên nén 100mg, 150mg. - Viến bao tan ở ruột 50mg. - Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg, 150mg, 200mg. - Thuốc tiêm 100mg. - Thuốc mỡ 2,5%. Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron…. 1.1.8 Các phương pháp định lượng. A. Phương pháp acid- bazơ: Định lượng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương bằng chỉ thị đỏ phenol [18] hoặc bằng phương pháp đo điện thế [ 10] [18]. Tiến hành: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước và vài giọt đỏ phenol. Chuẩn độ với NaOH 0,1N. Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện. 1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3. - Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tương đương bằng bước nhảy điện thế. 1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3. B. Phương pháp quang phổ [7] [8][10]: Dùng để định lượng ketoprofen trong chế phẩm. Hoà một lượng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân chính xác) trong 300 ml methanol 75 %, lắc trong 10 phút, thêm methanol 75 % vừa đủ 500 ml. Lọc. Lấy 5 ml dịch lọc pha loãng thành 100 ml với methanol 75 % và đem đo độ hấp thụ của dung dich này ở bước sóng 258nm; cuvet thạch anh có chiều dày 1 cm với mẫu trắng là methanol 75%. Tính kết quả dựa vào A (1%, 1cm) ở bước sóng 258 nm là 662. C. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ). Dùng để định lượng ketoprofen trong huyết tương và xác định tạp chất trong nguyên liệu. stt tài liệu pha động cột mẫu thử 1 [10] [18] Đệm phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55) C18 5mm 150*4,6 mm Nguyên liệu 2 [10] NH4CH3COO 1% - MeOH - ACN (55:30:15) C18 5mm 200*4,6 mm Nguyên liệu 3 [13] Đệm phosphat pH 3,2 - ACN (60:40) C18 2mm 250*4,6 mm Huyết tương 4 [12] NH4CH3COO 20 mM - MeOH; điều chỉnh pH 7,0. C18 4 mm Huyết tương 5 [11] ACN : AcOH 1% ( 38 : 62 ). C18 10mm 3,9*300 mm Huyết tương 6 [16] Đệm Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ). C18 5 mm 4,6*250mm Huyết tương D. Phương pháp điện di mao quản: Định lượng ketoprofen trong huyết tương [14] và tách đồng phân của ketoprofen [17]. 1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ). Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography ) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm cuối 1960. Nó được xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện rõ tính ưu việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dược học của thuốc. Phân loại các phương pháp sắc ký [ 2]: Sắc ký phân bố : + sắc ký lỏng- lỏng. +sắc ký phân bố pha liên kết. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao. Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel ( sắc ký theo loại cỡ ). Trong phân tích sinh dược học và kiểm nghiệm, người ta hay sử dụng phương pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography ). Đặc điểm phương pháp [2]: Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết ) với chất mang ( Silicagel ) tạo nên hợp chất cơ Siloxan Si CH3 CH3 CH3 Cl CH3 OH Si R Si Si O CH3 CH3 R + H3C H3C Nhóm Silanol Dẫn chất Dẫn chất Siloxan của Silicagel clorosilan - Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược ). - Nếu R là nhóm khá phân cực như: alkylamin - ( - CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận. - Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính chất phân cực giống các chất cần tách và khác với pha động. Nguyên tắc của phương pháp [2] [3]: Các chất trong hỗn hợp được tách dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một pha tĩnh và một pha động. Dung dịch mẫu thử được đưa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và được dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp. Tại cột xảy ra quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì được rửa giải ra trước, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì được rửa giải ra sau. Chất ra khỏi cột được phát hiện bằng detector gắn với máy ghi, máy tính hay máy tích phân. Thời gian lưu tR là đặc trưng định tính của chất, chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất. Sắc ký được tiến hành so với chuẩn. Một số thông số đặc trưng của HPLC [2]: Ví dụ: Ta có 1 sắc đồ sau: - Thời gian lưu tR ( phút ) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó. - Thời gian chết tM ( phút ) là thời gian của một chất không bị lưu giữ tức là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi. Thời gian lưu hiệu chính tR, được tính theo công thức: tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ). - Thừa số dung lượng k’ dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất Qs t’R tR - tM VR -VM k’ = = = = QM tM tM VM - Thừa số chọn lọc a : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất. kB k’B t’R,B a = = = kA k’A t’R,A Qui ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a ³ 1. Để tách riêng 2 chất thì a > 1, thường từ 1,05 – 2,00. Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký. N = hoặc N = Trong đó: WB chiều rộng pic ở đáy pic. W1/2 chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh. - Độ phân giải RS là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký. tR,B – tR,A Rs = 1/2( WB + WA ) Để tách riêng hai chất, Rs ³ 1,5 ( khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng cỡ ). - Chiều cao pic hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất. Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện làm ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử. Pha tĩnh và pha động trong HPLC [3]. *Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3-10mm, diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g.Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trên cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha liên kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau. Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC: + Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích. + Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký. + Tính chất bề mặt phải ổn định. + Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. + Cỡ hạt phải tương đối dồng nhất. Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau: + Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO2 ) + Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al2O3 ) + Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo...) + Pha tĩnh trên nền mạch carbon. Trong 4 loại này thì nền Silicagel được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh được chế tạo trên nền này cũng có nhiều ưu việt hơn, như khả năng chịu áp cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt. *Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trính sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ như Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Nó cũng có thể là dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng cho nó, để có được hiệu quả tốt. Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký, ảnh hưởng tới sự phân giải của chất trong pha tĩnh. Pha động trong kỹ thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau: + Phải trơ đối với pha tĩnh. + Phải hoà tan được chất mẫu + Phải bền vững theo thời gian +Phải có độ tinh khiết cao + Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký + Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là hệ dung môi phân cực, nó là những dung môi trộn lẫn đượcvới nước và trong nhiều trường hợp thì nước lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và được dùng khá phổ biến trong loại sắc ký phân bố pha liên kết là các dung môi methanol, tetrahydrofuran, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm. Sắc ký phân bố pha liên kết được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực. Trong hệ pha này thì thành phần của pha động cũng ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC. - Phương pháp đường chuẩn - Phương pháp thêm - Phương pháp so sánh Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký. Phần 2: thực nghiệm và kết quả 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. 2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất *Nguyên vật liệu: - Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001). - Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24). - Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24). *Hoá chất: - Acetonitril ( HPLC grade-Merck ). - Methanol ( HPLC grade- Merck ). - Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck ). - Triethylamin ( PA grade - Merck ). *Dụng cụ: - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. + Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000. + Detector Merck-Hitachi L-4000 UV. + Máy tích phân Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator. + Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 - USA. - Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ). - Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh). - Cân phân tích Satorius (Đức). - Ly tâm điện Jouan (Pháp). - Máy siêu âm Branson (Mỹ). - Máy lắc Labinco. - Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl. - Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức. 2.1.2 Phương pháp thực nghiệm a.Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát chọn dung môi chiết Ketoprofen trong huyết tương Khả năng chiết hoạt chất được biểu thị bằng hiệu suất chiết và khả năng loại tạp cản trở sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích. Lắc 1 phút Cắn Dung môi hữu cơ Mẫu thử được xử lý với các dung môi khác nhau theo sơ đồ sau: Huyết tương Lắc 5 phút Ly tâm 15phút(3000 vòng/phút) Khí Pha động Dịch chiết Lọc Ly tâm 15 phút(3000 vòng /phút) Dịch lọc Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương ( chiết đơn ) Để tăng hiệu suất chiết, nhằm mục đích chiết kiệt hết hoạt chất trong huyết tương, ta tiến hành chiết lặp (chiết 3 lần). Tiến hành như sơ đồ 1 thực hiện thêm hai lần từ lúc thêm dung môi hữu cơ đến khi thu được cắn. Tất cả các dịch chiết của 3 lần được tập trung vào một ống nghiệm, đuổi dung môi thu được cắn như sơ đồ 1. Tìm chất chuẩn nội. Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoprofen cho vào huyết tương đã chứa ketoprofen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1. Chạy sắc ký để xác định thời gian lưu của chất chuẩn nội và ketoprofen, tính thừa số chọn lọc a ( tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất ) xem mức độ tách của hai chất. Chất chuẩn nội phải tách hẳn với ketoprofen , hiệu suất chiết ổn định, bền vững, phát hiện dễ dàng ở điều kiện sắc ký trên. Khảo sát chọn hệ dung môi ( pha động ) chạy sắc ký. Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm. Chuẩn bị các hệ dung môi khảo sát, tiến hành chạy sắc ký với từng hệ dung môi mẫu huyết tương có chứa ketoprofen và chuẩn nội được xử lý như sơ đồ hình 1.Tính RS của từng hệ dung môi từ đó chọn được hệ để phân tích ketoprfen trong huyết tương. b.Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương Xây dựng đường chuẩn trong pha động: Pha 1 dãy dung dịch hỗn hợp ketoprofen và chất chuẩn nội trong pha động với nồng độ ketoprofen lần lượt là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml và nồng độ chất chuẩn nội là 25mg/ml. Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lưu và diện tích pic của ketoprofen và chuẩn nội, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội . Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ ketoprofen và tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội. Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương. Chủ động cho ketoprofen vào huyết tương để được một dãy các nồng độ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml. Tiếp đó cho vào các ống nghiệm cùng một nồng độ chất chuẩn nội. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1.Chạy sắc ký, từ đó tìm ra mối tương quan giữa nồng độ ketoprrofen và tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội. Xác định tính chính xác của phương pháp (trong cùng một ngày và giữa các ngày phân tích). Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phương pháp ( biểu thị bằng RSD ). Làm ở hai nồng độ : 0,5mcg/ml; 4mcg/ml. Xác định tính đúng của phương pháp: Bằng phương pháp thêm Thêm chính xác một lượng mẫu chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ ketoprofen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký. Tính % ketoprofen chuẩn tìm lại được. ứng dụng Dùng phương pháp đã xây dựng để định lượng ketoprofen mẫu huyết tương người sau khi uống viên nang ketoprofen 50 mg; 1,50 giờ và theo dõi độ bền vững của ketoprofen trong huyết tương bảo quản ở - 300C, sau 1; 2; 3 tháng. 2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2.2.1 Khảo sát tìm dung môi chiết xuất Dung môi hữu cơ dùng để chiết xuất phải có khả năng hoà tan tốt ketoprofen và chất chuẩn nội, đồng thời phải loại được tạp chất và làm đông vón protein huyết tương. Khảo sát khả năng chiết của một số dung môi ta thu được kết quả sau: Bảng 1: Hiệu suất chiết ketoprofen từ huyết tương. Dung môi Hiệu suất chiết (%) Cloroform Ether Acetonitril Ethylacetat Dichloromethan 51.5 53.8 91.2 78.3 36,6 Từ kết quả trên cho thấy acetonitril có hiệu suất chiết ketoprofen cao nhất. Dùng Acetonitril chiết ketoprofen ở nồng độ 4mcg/ml. Chiết 1 lần và chiết 3 lần ta thu được kết quả sau: Bảng 2 : Hiệu suất chiết Ketoprofen bằng ACN. Lần Chiết đơn ( % ) Chiết lặp ( % ) 1 83,32 96,45 2 84,56 99,91 3 80,44 96,72 4 82,32 95,1 5 81,5 97,12 Trung bình 82,43 97,06 RSD 1,934 1,818 Thời gian chiết 60 phút 160 phút Đối với mẫu chiết lặp, sau khi lấy riêng dịch chiết lần đầu, chiết lần hai, chiết lần ba, chiết lần bốn đuổi dung môi, hoà tan trong pha động và tiến hành chạy sắc ký thì không phát hiện được ketoprofen trong dịch chiết lần bốn. Như vậy chiết ba lần là phù hợp. Nhận xét: Chiết lặp ketoprofen bằng ACN hiệu xuất chiết cao, gần như chiết được hết (97,06%) ketoprofen trong huyết tương, nhưng thời gian xử lý mẫu quá dài. Còn chiết đơn (chiết dưới hợp thức) ketoprofen trong huyết tương hiệu xuất chiết tuy thấp hơn ( 82,43% ), nhưng sai lệch giữa các lần làm không cao ( RSD = 1,934 ), so với chiết nhiều lần ( RSD = 1,818 ), và thời gian xử lý mẫu không quá dài. Do đó, có thể dùng ACN chiết một lần để chiết ketoprofen trong huyết tương mà vẫn thu được kết quả tốt. 2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Dùng sắc ký phân bố pha đảo Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột sắc ký khác nhau: cột C8, cột C18, cột phenyl. Qua các kết quả thu được thấy cột C18 phù hợp. Khảo sát tìm chất chuẩn nội : Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoprofen, khảo sát để tìm ra chất chuẩn nội. Chất chuẩn nội phải đảm bảo tách khỏi ketoprofen và ổn định trong điều kiện sắc ký. Pha các dung dịch ketoprofen và acid-2-(4-isobutylphenyl) propionic, ketoprofen và acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) trong pha động và trong huyết tương. Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lưu tR của các chất, tính thừa số chọn lọc a của các chất đối với ketoprofen, từ đó xác định chất nội chuẩn ( chất có a lớn nhất nhưng thời gian làm mẫu không quá dài). Kết quả thu được như sau: Chất tR a CH CH3 COOH C O Ketoprofen Acid - 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic 6,77 CH3 CH COOH H3CO Acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) 6,90 1,019 CH3 CH COOH CH2 CH CH3 CH3 Acid - 2- ( 4 -isobutylphenyl ) propionic (IS2) 9,95 1,47 Trong đó a là tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bởi đại lượng thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc. a càng lớn thì hai chất càng tách ra khỏi nhau, thường dùng a trong khoảng 1,05- 2,0. ở đây aIS2/ket > aIS1/ket nên khả năng tách của IS2 và ketoprofen sẽ tốt hơn khả năng tách của IS1 và Ketoprofen. Tốc độ di chuyển tỷ đối của IS2 và ketoprofen a = 1,47 và tR,IS2 = 9,96 nên thời gian làm mẫu cũng không quá lâu. Vì vậy, có thể dùng acid -2-(4 - isobutylphenyl) propionic làm nội chuẩn trong phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương . Pha động: Tiến hành khảo sát trên các hệ pha động khác nhau, xác định độ phân giải và khả năng tách của ketoprofen với các tạp chất trong huyết tương và khả năng tách của ketoprofen với chất chuẩn nội. Chúng tôi đã tiến hành sắc ký, dùng cột C18 với các hệ pha động sau: ACN: dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 7 (90 : 10). NH4CH3COO 1%: MeOH: ACN (điều chỉnh về pH= 6,5 bằng CH3COOH băng) ( 55 : 30 : 15 ) MeOH: AcOH: H2O ( 50 : 1 : 49 ). ACN: AcOH : H2O ( 60 : 1 : 39 ). Nhận xét : Các hệ 1, 2, 3 cho kết quả tách không tốt, ketoprofen chưa tách được khỏi tạp chất cũng như chất chuẩn nội. Riêng hệ 4 đã cho kết quả tách tốt nhưng các pic còn bị tù và chân pic tách không gọn. Khi ta cho thêm Triethylamin vào thì các pic sắc nét hơn và chân pic gọn hơn. Khảo sát hệ dung môi gồm 4 thành phần ( ACN, AcOH, Tri, H2O ) với các tỷ lệ ACN là 60, 50, 40, ta thu được các sắc đồ sau: Hình 2: Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 40 : 1 : 0,3 : 58,7 ). Hình 3 : Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 1 : 0,3 : 48,7 ). Hình 4 : Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 60 : 1 : 0,3 : 38,7 ). Hình 2 Hình 3 Hình 4 Bảng 3: Kết quả RS của các hệ dung môi đã chạy STT ACN AcOH Tri Lưu lượng dòng (ml/phút) RS , 1 RS ,2 RS ,3 Thời gian (phút) 1 60 1 0,3 0,85 0,97 0,99 0,97 11 2 60 1 0,3 1,2 1,05 1,44 1,22 10,62 3 60 1 0,3 0,5 1,23 1,41 0,98 12,5 4 50 1 0,3 0,5 1,05 1,28 0,99 20,28 5 50 1 0,3 0,85 1,63 1,61 1,09 17,94 6 50 1 0,3 0,85 1,39 2,99 1,35 16,52 7 40 1 0,3 1,2 2,04 6,39 6,39 25,5 8 40 1 0,3 0,5 7,35 17,28 17,28 50,71 9 40 1 0,3 0,85 2,2 8,08 6,96 30,28 Nhận xét: Độ phân giải RS của các hệ tăng dần khi tỷ lệ ACN giảm dần. Nhưng thời gian chạy sắc ký cũng tăng lên rất nhiều. Hệ 7, 8, 9 ( tỷ lệ ACN là 40 ) có độ phân giải RS cao nhất nhưng thời gian chạy sắc ký quá lâu. Hệ 6 có độ phân giải RS,1 =1,39; RS,2 =2,99; RS,3 =1,35 ; các pic tách nhau gần như hoàn toàn và thời gian chạy sắc ký không quá lâu. Do đó trong đề tài này chúng tôi chọn hệ dung môi pha động số 6. ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 49,2 ). *Bước sóng: Để tăng độ nhạy khi phát hiện ketoprofen trong huyết tương chúng tôi tiến hành xác định cực đại hấp thụ của ketoprofen trong điều kiện giống như phân tích mẫu thực. Pha dung dịch ketoprofen chuẩn trong dung môi pha động. Quét phổ UV. Ketoprofen có cực đại hấp thụ ở bước sóng 253 nm. Từ các kết quả trên, điều kiện sắc ký được chọn là: - Pha tĩnh : Cột Nucleosil ODS 5mm (4,6*250 mm) - Pha động: ACN: AcOH : Tri :H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 48,7). - Lưu lượng dòng: 0,85ml/ phút. - Bước sóng : 253 nm. - Thể tích mẫu tiêm : 50ml. 2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương. Xây dựng đường chuẩn trong pha động: Pha một dãy các dung dịch hỗn hợp ket và IS trong pha động với các nồng độ của ket là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml ; 0,8mcg/ml ; 2mcg/ml ; 5mcg/ml và nồng độ IS là 25mcg/ml. Tiến hành chạy sắc ký với điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic từ đó tính tỷ số diện tích pic của ket và IS . Bảng 4: Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Ketoprofen trong pha động Nồng độ ( mcg/ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 4245 17779 900375 242424 613525 AIS 118674 110665 127804 119413 114211 RKet/IS 0,036 0,161 0,704 2,030 5,372 Đồ thị 1 : Đường chuẩn Ketoprofen trong pha động. Phương trình hồi qui y = 1,085 x - 0,087 Trong đó: y là tỷ số diện tích pic giữa Ket và IS x là nồng độ Ketoprofen (mcg/ml ). Hệ số tương quan hồi qui : r = 0,9998. Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương . Chuẩn bị một thang chuẩn trong huyết tương với các nồng độ ket là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml, nồng độ IS 25mcg/ml. Tiến hành xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ đó tính RKet/IS. Bảng 5 : Kết quả xây dựng đường chuẩn Ketoprofen trong huyết tương. Nồng độ ( mcg /ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 3882 14047 86292 232658 607150 AIS 105190 105131 105812 104177 106458 RKet/IS 0,037 0,134 0,815 2,233 5,730 Đồ thị 2 : Đường chuẩn định lượng Ketoprofen trong huyết tương . Phương trình hồi qui : y = 1,154x - 0,074 Trong đó : y là tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS x là nồng độ Ketoprofen ( mcg/ml ). Hệ số tương quan hồi qui : r= 0,9998 y + 0,074 Từ đó suy ra: x = 1,154 Như vậy, đường chuẩn của ket/ huyết tương có độ dốc lớn hơn (1,154) so với đường chuẩn của nó trong pha động (1,085), do đó đường chuẩn có xu hướng đi lên. Xác định tính chính xác của phương pháp. Lấy các mẫu huyết tương có chứa ketoprofen với các nồng độ 0,5 mcg/ml; 4mcg /ml và chất chuẩn nội có nồng độ 25 mcg /ml. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS. C 0,5 mcg/ml 4mcg/ml AKet AIS RKet/IS AKet AIS RKet/IS 1 55794 119470 0,4659 484278 115522 4,192 2 61432 128838 0,4768 483315 116414 4,152 3 57239 118666 0,4723 475357 114211 4,162 4 57678 129152 0,4466 483012 115792 4,171 5 58622 125792 0,4660 482356 116534 4,139 6 64353 148740 0,4426 476235 115235 4,132 TB Phương sai RSD 0,4617 TB Phương sai RSD 4,158 0,0139 0,0219 3,016 0,528 Chúng tôi tiến hành xác định độ chính xác như trên ở một ngày phân tích khác. Kết quả thu được như sau: 0,5 mcg/ml 4mcg/ml TB Phương sai RSD 0,4922 TB Phương sai RSD 4,037 0,0123 0,023 2,5 0,581 Từ các kết quả thu được (trong cùng một ngày và giữa các ngày phân tích) để đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương ở 2 nồng độ 0,5mcg/ml; 4mcg/ml với n = 6, cho thấy phương pháp có tính chính xác cao. Tính đúng của phương pháp: - Mẫu thử: huyết tương người sau khi uống viên nang ketoprofen 50 mg khoảng 90 phút, thêm IS 25mcg/ml. - Mẫu chuẩn: Ketoprofen chuẩn 0,8mcg/ml trong huyết tương, thêm IS 25 mcg/ml. - Mẫu chuẩn + thử: mẫu thử + ketoprofen chuẩn 0,8mcg/ml + IS 25mcg/ml. Xử lý các mẫu trên như sơ đồ hình 1. Tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Xác định tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS, ta có các sắc đồ sau: Hình 5: Mẫu trắng. Hình 6: Mẫu chuẩn trong pha động. Hình 7: Mẫu chuẩn trong huyết tương. Hình 8: Mẫu thực. Hình 5 Hình 6 Hình 7 Hình 8 Kết quả thu được biểu thị bằng tỷ số diện tích pic giữa Ketoprofen và chất nội chuẩn. Mẫu Chuẩn Thử Thử + Chuẩn 1 0,704 1,116 1,867 2 0,684 1,217 1,845 3 0,712 1,119 1,905 4 0,728 1,136 1,83 5 0,685 1,122 1,901 Trung bình 0,7032 1,142 1,8696 RSD 2,5506 3,372 1,778 Bảng 7 : Kết quả xác định tính đúng của phương pháp. % Tìm lại = Nhận xét: Như vậy, lượng ketoprofen chuẩn tìm lại là 103,5%, RSD = 1,778, n = 5 cho thấy phương pháp định lượng này có tính đúng đảm bảo cho phép định lượng ketoprofen trong huyết tương. Kết luận: Với tính đúng đảm bảo, tính chính xác tốt và sự tuyến tính chặt chẽ giữa tỷ số diện tích pic ketoprofen / IS và nồng độ ketoprofen trong khoảng khảo sát, cho thấy phương pháp này có thể áp dụng để định lượng ketoprofen trong huyết tương. * áp dụng áp dụng định lượng mẫu thực: một người tình nguyện khoẻ mạnh, uống1 viên nang 50 mg, sau 90 phút lấy máu đem ly tâm để lấy huyết tương. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1, tiến hành chạy sắc ký thu được sắc đồ hình 9. Thẩm định phương pháp dùng Detector UV Diod arrays (Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế) để định lượng ketoprofen trong mẫu thực Chọn 5 điểm: chân phía trước của pic, 1/2 phía trước của pic, đỉnh pic, 1/2 phía sau của pic, chân phía sau của pic của Ketoprofen. Quét phổ hấp thụ. Song song làm mẫu chuẩn Ketoprofen trong pha động, chồng phổ hấp thụ của mẫu thực và mẫu