Đề tài Nguồn thu nhận và ứng dụng enzyme protease

loét, hoặc do chấn thương và nhằm giúp làm lỏng các dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh phổi và viêm xoang. - Chymotrypsin dùng hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng. Dùng trong điều trị phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ. - Giảm đau, hạ sốt, kháng viêm. - Đẩy nhanh hoạt động tuyến bã và đào thải chất ứ. III. CHYMOSIN (RENNIN) 1) Định nghĩa - Thuộc loại aspartic acid protease - lL enzim proteolytic làm đóng cục sữa bằng cách làm đông cazein của nó. - thường ở dạng dung dịch, bột hoặc viên. - có thể chứa muối (ví dụ, clorua natri, clorua canxi, sunphat natri), còn lại từ quá trình sản xuất hoặc phụ vào cho chuẩn hoá, và chất bảo quản (ví dụ, glycerol). 2) Hoạt động - hoạt động trong môi trường acid yếu (pH 5,0 - 5,3) và cần sự có mặt của Ca++ - Renine làm đông vón sữa bằng cách biến caseinogen thành caseinate calcium - Rennin bẻ gãy liên kết peptide giữa phenylalanine và methionine của casein trong sữa, gây đông tụ sữa nhưng không lảm thủy phân sâu sắc 3) Nguồn cung cấp - được lấy từ những con bê nuôi bằng sữa. - Sau khi làm thịt, ngăn bao tử thứ tư trong dạ cỏ được lấy ra và đổ hết những thức ăn chứa bên trong. Sau đó phần bao tử này được qua nhiều tiến trình bao gồm ướp muối khô, rửa, cạo mỡ bề mặt, kéo căng trên khung để lấy hết hơi ẩm, sau đó cuối cùng là xay và trộn với một dụng dịch muối cho đến khi chiết ra được men dịch vị (rennet) - Phương pháp hiện đai hơn dùng hệ enzyme đặc hiệu để tách rennin từ bao tử bê 4) Ứng dụng - Chủ yếu dùng trong công nghệ làm pho mát. Người ta đang cố gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay thế một phần rennin - Dùng sản xuất các loại sữa đông IV. PEPSIN 1) Cấu tạo - Là enzim được tách ra từ dịch vị hoặc từ tế bào chính của dạ dày động vật (vd. dạ dày lợn) - có phân tử khối khoảng 35.000 - Điểm đẳng điện khoảng pH = 1 2) Hoạt động : - Là xúc tác cho quá trình thuỷ phân một số liên kết peptit nhất định trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptit phân tử thấp. - Tiền enzim là pepsinogen do dạ dày tiết ra ở dạng không có hoạt tính xúc tác. - Dưới tác dụng của axit clohiđric (HCl) (hay ion H+) hoặc chính của bản thân Pepsin xúc tác, pepsinogen được hoạt hoá thành hoạt động. - Thuỷ phân mạnh các liên kết peptit nối mạch do các nhóm amin của các axit amin thơm trong phân tử protein và peptit tạo thành, sản phẩm được tách ra là các peptit chứa 5 - 8 axit amin và một ít axit amin tự do. - Hoạt động trong môi trường axit, thích hợp nhất trong khoảng pH 1,5 - 2; ở điều kiện này Pepsin không bền do có sự tiêu enzim ( 1 gam pepsine của dịch dạ dày có thể thủy phân 50 kg albumine trứng trong vòng 2 giờ ở những điều kiện thích hợp.) - Có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạt lực của P thấp; từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease. - Pepsine có thể thủy phân collagen và elastine nhưng không thủy phân keratin của tóc, lông và các protein đơn giản có nguồn gốc thực vật 3) Nguồn gốc : - Pepsin được sản xuất nhờ phương pháp chiết suất hoặc tự phân. - Enzim hoạt động lấy từ dịch vị hoặc từ các dịch tự phân, dịch chiết được kết tủa bằng dung môi hoặc muối trung tính rồi sấy khô ở nhiệt độ thấp. 4) Ứng dụng : - Nghiên cứu protein - Điều chế môi trường nuôi vi sinh - Sản xuất phomat - Làm đồ uống để chữa một số bệnh về đường tiêu hoá. - Men tiêu hoá T-pepsin : là sự phối hợp giữa pepsin và thiamin nitrat + Men Pepsin có tác dụng làm tăng khả năng dung nạp và tiêu hoá protid ở thực phẩm kích thích tiêu hoá và hấp thụ chất đạm nhất là thức ăn giàu chất đạm. + Thiamin nitrat (vitamin B1) là Coenzym thúc đẩy quá trình chuyển hoá glucoza ở hệ thần kinh, hệ thống tiêu hoá và tim mạch. + Ngoài tác dụng trực tiếp đến quá trình tiêu hoá, men còn có tác dụng điều hoà PH dịch vị à có tác dụng tốt trong điều trị đau dạ dày và các trường hợp cần phẫu thuật dạ dày. + Tiêu hoá tốt, ăn ngon miệng, tăng cân, chóng phục hồi sau khi ốm. ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT I. NGUYÊN NHÂN PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP NÀY: Sản xuất enzym theo qui mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh vât.So với động vật và thực vật,VSV có rất nhiều ưu điểm.Những ưu điểm đó được tóm tắt như sau: 1. Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh: _Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh khối rất lớn. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tạo sinh khối ở VSV cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật. Để đạt được tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, VSV phải chuyển hóa một khối lượng cơ chất rất lớn. Cũng từ những nghiên cứu trên E.coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong vòng 24h, vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn lần khối lượng cơ thể chúng. Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng hợp ra được lượng enzym rất lớn. Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzym đảm nhận. Chính vì thế, nếu sử dụng VSV như nguồn sinh học để sản xuất enzym rất có lợi. Trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu enzym nội bào) mà còn thu được lượng enzym ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất cao. 2. Enzym thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao: _Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát triển của VSV. 3. VSV là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp: _Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzym từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được. 4. Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm: _Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm giá thành sản xuất ở mọi nơi trên thế giới. 5. VSV có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau: _Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả mọi chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzym khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt. Trong khi đó, cơ thể đa bào được phân hóa thành các cơ quan riêng, mỗi một cơ quan (hay mô bào) thực hiện những chức năng riêng. Chính vì thế, ở động vật và thực vật, việc khai thác enzym có giới hạn ở một vài enzym nhất định. _Đặc điểm này vừa có lợi và vừa bất lợi cho kỹ thuật tinh chế sau này. Có lợi vì khi ta sử dụng một loạt phản ứng sinh hóa cần có sự chuyển hóa liên tục theo một chuỗi phản ứng, ta không cần phải sử dụng nhiều nguồn enzym khác nhau. Nhưng nếu ta chỉ cần thực hiện một phản ứng, đòi hỏi phải làm tinh sạch enzym này bằng cách loại các enzym không cần thiết khác. Nhiều trường hợp công việc này rất phức tạp và tốn kém. Do đó, những enzym sau khi được tinh sạch người ta thường ứng dụng trong y học, trong phân tích và trong kỹ thuật di truyền. Trong công nghệ thực phẩm, người ta chỉ sử dụng các loại chế phẩm enzym tương đối sạch sẽ và thế phẩm enzym thô. II. TỔNG QUÁT: 1. Enzyme protease của vi sinh vật là một protease ngoại bào: Enzyme này khác với Protease của thực vật(fixin,Papain,Bromelin) và động vật (Tripxin,Pepxin,Renin) hơn nữa nó còn có tính đặc hiệu rộng rãi - Chế phẩm Protease tinh khiết từ vi khuẩn Bacillus có thể thủy phân hòan tòan nhiều Protein.Chế phẩm này có tên gọi là Subtilizin.Khi tác dụng trên Cazein thì họat độ sẽ đạt cực đại khi PH trung hòa - Điều đáng chú ý là các chế phẩm Protease từ những vi khuẩn này còn có khả năng làm đông sữa bằng chế phẩm từ Bacillus mesentericus này. - Ngòai ra,một số chế phẩm protease của vi khuẩn còn có họat độ elastaza,nghĩa là chỉ có thể thủy phân các liên kết Peptit kế liền bên gốc axit amin trung tính.Đây cũng là điểm khác biệt với Protease của nấm mốc. 2. Protease là nhóm enzyme thủy phân: liên kết peptide của protein, pepetid tạo ra các sản phẩm như peptone, đi-tri-peptide, acid amin.Protease của VSV có đủ loại, tùy theo pH thích hợp ta chia ra protease trung tính, kiềm acid. - Trong côngnghiệp, người ta có thể thu protease từ nguồn *Nấm mốc: Asp.moryzae, Asp.flavus,Asp.fumigatus, Asp.Oryzae, … *Vi khuẩn: ac.Subtilispha, Bac.Cireulans, Bac.Sphaericus, Bac.Thermophilus, Bac. Aerothermophilus… *Xạ khuẩn : Str. Griseus, Str. Rimosus, Str. Fradiae, Str. faecais…. - Protease vsv có đặc điểm là hoạt động được trong khoảng pH khá rộng, chúng tổng hợp được cả 2 loại enzym endo và exo – peptidase, do vậy thủy phân được tới 80% liên kết peptide - Protease của vi khuẩn hoạt động trong vùng pH hẹp hơn (7-8) so với vsv (2-11). Chế phẩm protease từ mốc đen (Asp.niger,Asp.awamori) có pH tối ưu 2.5 – 3 - Còn chế phẩm mốc vàng có pH tối ưu lân cận 6.5 - Chế phẩm enzym từ vi khuẩn Bac.subsilis khả năng thủy phân tốt protein gọi tên subtilizin, Bacillus mensetericus thủy phân protit đến acid amin và đông tụ được sữa có thể ứng dụng để thay thế 1 phần rennin trong sản xuất phomat, một số chế phẩm từ vi khuẩn có elactase có khả năng làm mềm thịt - Protease cũng như amilase có ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp,đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm 3. Ứng dụng: Những chế phẩm này đều được sản xuất từ các loại nấm mốc,vi khuẩn. Protease được ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp nhưng nhiều nhất là ngành công nghiệp thực phẩm như: - Công nghiệp đồ hộp thịt: có tác dụng làm mềm thịt như enzym elastaza keratiza…Chế phẩm enzym này thường lấy từ canh trường nuôi xạ khuẩn actimomyces faradise.Người ta ngâm thịt,hay tim enzim vào thịt,với liều lượng nồng độ,PH,nhiệt độ nhất định,sau một thời gian nhờ sự thủy phân một phần protein(mô liên kết) làm thịt mềm ra. - Trong công nghiệp sữa : Các chế phẩm từ vi khuẩn(Bac.mesentericus) hay từ nấm mốc(Asp.candidus,Mucor) có họat tính enzym tương tự Renin có thể thay thế một phần cho Renin(từ 25-50%) - Từ tháng 7-2003, dưới sự hướng dẫn của thạc sĩ trưởng khoa Đỗ Thị Ứng Sao và thầy Hoàng Xuân Thế, giảng viên của khoa, các bạn đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch cho dịch enzyme protease acid thu nhận được từ hai điều kiện nuôi cấy bề mặt và bề sâu của nấm mốc Aspergillus awamori 9 để ứng dụng chúng trong sản xuất phô mai. - Phô mai là một sản phẩm lên men từ sữa, rất giàu giá trị dinh dưỡng, được sản xuất chủ yếu nhờ enzyme rennin cung cấp từ dạ dày bê con. Thời gian gần đây, do sản lượng phô mai tăng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng đã dẫn đến sự thiếu hụt nguồn cung cấp enzyme rennin. - Từ đó, các nghiên cứu khoa học đã được tiến hành nhằm tìm ra nguồn enzyme thay thế cho việc giết mổ bê con. Và nhóm nấm mốc Aspergillus awamori đã được chú ý bởi có khả năng sinh ra enzyme protease acid gây đông tụ sữa cao. Vì thế, việc nghiên cứu tinh sạch và ứng dụng các chế phẩm enzyme protease acid thu nhận từ nấm mốc dùng cho sản xuất phô mai đã được tiến hành rộng rãi ở các nước châu Âu, Nhật Bản và Hoa Kỳ... - Đặc biệt trong công nghệ sản xuất nước chấm như nước tương,tương hột, chao…đều sử dụng chế phẩm protease từ vi sinh vật. - TS Trần Bích Lam (Bộ môn vi sinh Đại học Bách khoa TPHCM) cũng cho biết để sản xuất nước tương có tới 3 phương pháp công nghệ: công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công nghệ enzym. Phương pháp công nghệ vi sinh có thể sử dụng nguồn enzym protease do vi sinh vật sinh ra trong quá trình lên men. Đặc điểm là hiệu suất thủy phân thấp, thời gian thủy phân kéo dài, sản phẩm khó bảo quản, mùi vị thường bị đắng. Còn để sản xuất nước tương “sạch” hoàn toàn thì phương pháp lên men là tối ưu nhưng cần có thời gian đầu tư mặt bằng, dây chuyền thiết bị và nhất là làm sao cho người tiêu dùng quen dần với mùi vị nước tương lên men - Trong công nghiệp hương liệu mỹ phẩm,dùng chế phẩm protease pha lẫn xà bông, dầu gội đầu,kem chải tóc…làm cho tóc mềm mại,loại bỏ biểu bì đã chế t(sạch gầu). - Trong chế biến các loại bột giặt: Ngày nay, enzym được dùng nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy vết bẩn protein, vết máu, vết hồ... - Trong sản xuất tơ tằm,dịch enzym Protease từ nấm mốc vi khuẩn có tác dụng làm bóng sợi tơ,tách rời các sợi tơ tằm do thủy phân lớp xerixin(là một protit). Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên(luợng xerixin sấp xỉ 30%), làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. - Trong công nghiệp thuộc da: Dùng chế phẩm Protease thô từ VSV có thể dùng trong thuộc da,tách lông,làm mềm da(chủ yếu phá bỏ colagen,protit trong da). Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi colagen. Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút ngắn được quá trình tẩy lông. Lượng lông thu được tăng lên khoảng 25 ¸ 30% so với khi sử dụng phương pháp hóa học.Ở Mỹ chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. - Trong y học: Chế phẩm Protease để điều chế dịch thủy phân Protein dùng làm môi trường nuôi vi sinh vật(ví dụ Pepton).Cô đặc tinh chế huyết thanh kháng độc(huyết thanh miễn dịch) III. NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE: - Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease.Các enzym này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy.Một số protease nội bào đã sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp ,trong nông nghiệp và y học.Các lọai VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease được trình bày : VSV Ghi chú Vi khuẩn Bac. subtilispha Bac. cireulans Bac. sphaericus Bac. thermophilus Bac. aerothermophilus Bac.thermoacidurans Bac.thermoproteoly ticus Bac.brevis Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium Cl.perfingens Cl.histolyticum Cl.sporogens Ps.aeruginosa Protease trung tính, protease kiềm(subtilizin) Protease kiềm Protease trung tính Protease trung tính, Protease acid Protease acid và protease kiềm Colagenase Protease trung tính, Protease kiềm Xạ Khuẩn Str. griseus Str. rimosus Str. fradiae Str. faeca is Str.reetus var. pro-teolyticus Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, M ỹ, gồm ít nhất là 11 enzym với cơ chất procolagen phân giải 70% đến amino acid có 5 protease, 2 peptidase (lơxinamino-peptidase, cacboxypeptidase), 2 protease: protease-serin. Nấm mốc Asp. oryzae Asp. sato Asp. awamorl Asp. niegr Asp. shirousami Asp. fumigatus Asp. tericola Asp. candidus Asp. ocharaceus Asp. sojae Asp. flavus Pen. janthinellum Pen. chrysogenum Mucor. pusillus Rh. chinensis Rh. delemar Rh. niveus Rh. nodous Rh. pseudokinensis Rh. peka Phymatorrichum omnivorum Protease-kim loại protease serin,có 3 loại protease acid,protease trung tính,protease kiềm.Protease acid(aspergilopepti-dase A) Protease acid Hai protease acid Protease acid Hai protease:protease acid và protease kiềm Protease acid có tác dụng làm đông sữa Protease trung tính Protease kiềm Hai protease:protease kiềm và protease trung tính Protease acid Protease kiềm Protease acid có tác dụng lám đông sữa được dung ở Nhật thay cho rennin IV. ĐẶC ĐIỂM VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE VI SINH VẬT: - Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều.Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất.Căn cứ vào cơ chế phản ứng,pH hoạt đông thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành 4 nhóm như sau:Protease-xerin; protease-thiol; protease-kim loại;protease-acid - Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm,dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm:Protease-acid,protease trung tính,protease kiềm. - Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của amino acid.Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng.Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé nhất là protease-xerin. - Các protease-xerin có trọng lực vào khoảng20.000-27.000 dalton.Tuy nhiên, cũng có một số protease-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn nhu các enzyme của Penicillium cyoneo-fulvum(44.000),Asp.oryae OUT 5038(52.000).Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin( vào khoảng 33.800-48.400 ).Protease-tiol và nhiều loại protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000. - Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm protease này ở bảng sau: NHÓM NGUỒN ENZYME CHẤT KÌM HÃM ĐẶC ĐIỂM TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG pH tối thích Protease Xerin Bac.subsilis Bac.pumilus Str.tradiae Art.hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.sojae E.coli Xerin Proteinasetiol Streplococcus Clostridium histoly-ticum Lodoaxeta-mit Ps.cloromer-curbenzoat -SH 7.5 7.0 Protease Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac.subtilisamy Losaccarilicis Bac.megaterium Pseudomonasaeruginosa Atreptomyces naraensis Asp.oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolyticum EDTA++ 1,10ota-fenantrolin Proteinse Acid Asp.niger Asp.awamori Asp.sailoi,Peniccillum Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pusillus Endothia parasilica Diazoaxetil DI norlox-inmetil este COOH acid - Cách phân loại trên được nhiều tác giả nhất trí và được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, trong thời gian sau này, số protease vi sinh vật nghiên cứu ngày càng nhiều, ngày càng nhận được nhiều enzyme mang các tính chất trung gian của các nhóm kể trên,nhất là giữa nhóm 1 và nhóm 3.Do đó người ta bắt đầu có ý kiến về cách phân loại trên.Năm 1975,Morihara đã thừ phân loại protease vi sinh vật được chia thành 4 nhóm lớn,dựa vào tính đặc hiệu của nó đối với cơ chất thích hợp hoặc đối với chuỗi b-insulin đã bị oxy hóa: *Nhóm một có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về phía nhóm – CO2 của liên kết peptit,do dó còn được gọi là carboxyendopeptidase *Nhóm ba có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid về phía nhóm –NH- cùa liên kết peptit(aminoendopeptidase). *Nhóm thứ tư có đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở cả hai phía của liên kết peptit - Mỗi nhóm này được phân thành các nhóm nhỏ dựa vào tính đặc hiệu của chung và một số tính chất khác - Nói chung,tính đặc hiệu của các protease không chỉ thể hiện đôí với gốc amino acid chứa nhóm –CO-hoặc nhóm –NH- của liên kết bị phân giải(đặc hiệu sơ cấp) mà còn cả đối với các gốc amino acid ở xa liên kết bị phân giải(đặc hiệu thứ cấp hoặc tương tác thứ cấp.Các enzyme cùng một nhóm, có tính đặc hiệu giống nhau cũng chịu ảnh giống nhau của tương tác thứ cấp.Nói chung,các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp ít hơn và ngược lại.Chẳng hạn các protease-xerin giống trpysine của Streptomyces, protease kim loại trung tính,…thường ít chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp khi chúng tác dụng với cơ chất phân tử bé cũng như các peptit phân tử lớn hoặc protein.Ngược lại,các protease-xerin kiềm hoặc protease acid chiụ ảnh hưởng lớn của tương tác thứ cấp mặc dù các enzyme này có tính đặc hiệu nghiêm ngặt đối với cơ chất phân tử bé.Khi tác dụng trên các cơ chất phân tử lớn tính đặc hiệu của các enzyme này cũng đựơc xác định bởi tương tác thứ cấp - Các protease vi sinh vật mới được nghiên cứu từ năm 1960.Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rông quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng protease trong thực tế V. Một số loài vi sinh vật tổng hợp Enzym Protease: 1.Bacillus: a\ Đặc trưng,đặc tính: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: firmicutes - Bộ: Bacillales - Họ: Bacillacease - Các loài: Bac. subtilispha Bac. cireulans Bac. sphaericus Bac. thermophilus Bac. aerothermophilus Bac.thermoacidurans Bac.thermoproteoly ticus Bac.brevis Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium - Hình dạng: hình que - Hiếu khí bắt buộc - Bacillus thuộc loại vi khuẩn Gram dương nhưng nhiều bào tử có thể chuyển sang Gram âm vào những giai đoạn phát triển nào đó. - Trong tự nhiên, Bacillus bao gồm 2 loại là: loại gây bệnh và loại sống tự do. - Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt tế bào có khả năng sinh nội bào tử,chúng tồn tại ở dạng thể nghỉ trong suốt thời gian dài - Hai loại Bacillus được xem là có ý nghĩa trong y học là B.antharasis, vi khuẩn gây bệnh than và B.cereus cũng gây bệnh giống với Staphylococcu; B,thurigiensis được dùng để tiêu diệt côn trùng. Hai loại cơ bản nữa là B.subtilis và B.coagulans, chúng là nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm. b\ Nhu cầu dinh dưỡng và sự phát triển: b.1\ Nhu cầu dinh dưỡng: - Hầu hết Bacillus là sinh vật dị dưỡng hóa học,chúng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ khác nhau như:đường, amino acid, acid hữu cơ.Trong vài trường hợp chúng lên men carbohydrat qua một loạt các phản ứng để tạo glycerol và rượu butanediol - Một vài loại như vi khuẩn Bacillus megaterium không cần các chất hữu cơ để phát triển.Những loại khác có thể cần đến amino acid hoặc Vinamin B, hoặc có loài cần cả hai - Phần đông chúng là những sinh vật ưa ấm với khoảng nhiệt tối ưu từ 30oC-45oC, tuy nhiên cũng có loại chịu nhiệt với khoảng nhiệt tối ưu là 65oC b.2\ Sự phát triển: - Vi khuẩn Bacillus dễ dàng được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm vi khuẩn học - Cách đơn giản để tạo ra những bào tử hiếu khí là dùng phương pháp diệt khuẩn Pasteur một mẫu đất ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút.Sau đó đặt nó lên môi trường Agar giàu dinh dưỡng ( pepton:5g/l. nước chiết thịt bò: 3g/l, Agar 15g/l ; pH=6,8 ), và để ở to 37oC từ 24h đến vài ngày.Chúng có thể tạo bào tử trong vòng 24h nhưng có thể quan sát kích thước và hình dạng của những bào tử này ta phải đợi từ 5 đến 7 ngày - Các loại B.lariase, B.popilliae, B.lentimorbis thì khó khăn để nuôi cấy hơn.Chúng phải được nuôi trên loại J-Agar ( tryptone: 5g/l ,nước chiết nấm men: 15g/l ,K2HPO4: 3g/l, glucode 2g/l, agar 20g/l, pH=7,4) - Nhu cầu dinh dưỡng trung bình của Bacillus megaterium: Thành phần Lượng Sucrose 10g K2HPO4 2,5g KH2PO4 2,5g (NH4)2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,2g FeSO4.7H2O 0,01g MnSO4.7H2O 0,007g H2O 985ml Hỗn hợp có pH=7 - Người ta nuôi vi khuẩn trên môi trường CFB(cuttlefish power) và nhận thấy chúng sinh trưởng và sản xuất protease tốt trên môi trường này, điều này chứng tỏ vi khuẩn đã sử dụng nguồn C và N có trong môi trường để sinh trưởng và sản xuất protease.Ngoài ra, khi cho thêm vào môi trường FWW(fishery wastwaters) được pha loãng, các quá trình này lại được tăng trưởng, đặc biệt với môi trường FWW thêm vào được pha loãng 5- 10 lần, hiệu suất quá trình có thể lên đến 467% và 75%( đối với B.cereus BGL và B.subtilis) - Hồ tinh bột và (NH4)2SO4 là nguồn C và N tốt nhất cho vi sinh vật, ngoài ra CaCO3 cũng làm thúc đẩy sự sản xuất protease - Bacillus proteolyticus: + Sản xuất protease kiềm + Điều kiện tối thích để phát triển và sản xuất protease là: .to=37oC .pH=9 .thời gian 96h +protease sinh ra có độ hoạt động ở 40oC đến 50oC, mất 20% hoạt tính ở 60oC.Phân tử lượng vào khoảng 29kD, nó có tác dụng ngăn chặn sự sinh trưởng của sinh vật gây bệnh như:Escherichia coli,Cisteria manocytogenes, Bacillus cereus và Tersinia eterocolytica.Phương pháp quang phổ (SEM) cho thấy protease sẽ ảnh hưởng đến những tế bào của sinh vật gây bệnh này. 2.Penicillium: : a\Đặc trưng đặc tính - Giới : nấm - Ngành: Ascomycota - Lớp : Ecurotiomycetes - Bộ : Eurotialles -Họ : Trichocomaceae -Các loài : Pen. janthinellum Pen. Chrysogenum - Nấm Penicillium dễ nhận biết bởi cấu trúc của nó giống những cây bụi mang bào tử - Bào tử được sinh ra trên một túi ở phía đỉnh , chưa trưởng thành chúng có màu xanh - Hình dáng dạng nhánh là đặc trưng để nhận biết với các loại khác nấm Penicillium.Vài loài không có nhánh chúng chỉ gồm một bao túi phía trên cuống (hình trên cùng) - Một số loài khác có mang những cụm nhánh, mỗi nhánh mang túi chứa bào tử (hình bên trái) - Loại thứ ba chúng cũng có nhiều nhánh, và từ mỗi nhánh đó lại có thêm nhiều nhánh con và ở đỉnh cũng có túi mang bào tử - Penicillium sinh sản vô tính , không có khả năng sinh bào tử trong điều kiện khắc nghiệt , có bề mặt kị nước tuy nhiên vẫn có khả năng bị ẩm ướt , tạo điều kiện để mọc mầm . - Penicillium có thể phát triển tốt trong hai môi trường thiếu nước và hàm lượng nước cao - Penicillium là chủng sinh vật phổ biến rộng rãi chúng ta có thể gặp ở mọi nơi, chúng chiếm đa số trong giới nấm b\ Penicillium trong đời sống: - Sự xuất hiện phổ biến của Penicillium trong thức ăn là vấn đề đáng quan tâm, vài loài trong số đó sinh chất độc làm thức ăn hư hỏng dẫn đến nguy hiểm.Sự xuất hiện của Penicillium làm chúng ta phải bỏ các thực phẩm này - Penicillium là sinh vật dị dưỡng, là nhân tố phá hủy trái cây, chúng tạo nên lớp màng màu xanh bao bên ngoài , sản sinh etylen kích thích sự chín của trái cây , một số loài làm trái cây khô, quéo lại, có khi xuất hiện lớp màng nhầy bên ngoài, nhiệt độ thấp là thích hợp ch