Đề tài Nhân giống vô tính invitro

vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội Tự thụ phấn qua nhiều thế hệ Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần thông thường phải mất 5 - 6 đời tự thụ phấn. Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử. Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ. Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình. Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh. Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị giao tử là nguyên liệu cho chọn giống. Khả năng ứng dụng của cây đơn bội. Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen. Tạo đột biến ở mức đơn bội. Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng. Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội Dòng thuần ổn định ( F1, F2) Chọn giống ưu thế lai dòng đồng hợp tử tuyệt đối. Nhị bội hóa số lượng nhiễm sắc thể (Tự phát, xử lý, colchicine) Cá thể đơn bội. Nuôi cấy tế bào trần của các cá thể đơn bội Lai các thể đơn bội khác bằng dung hợp tế bào trần. (lai soma) Gây đột biến, chọn lọc in vitro Tái sinh cây Nguyên liệu khởi đầu cho chọn giống. Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Nguyên lý: Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội. Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược). Hạt phấn đơn nhân  phôi 1n cây 1n Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô) Hạt phấn đơn nhân  mô sẹo 1n  chồi 1n cây1n Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô tính đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết. Ví dụ: cà chua. Các phương pháp cơ bản Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là: Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn. Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học, hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng. Kỹ thuật nuôi cấy Kỹ thuật này bao gồm những bước chính như sau: Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ bào tử đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn. Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội. Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng. Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước. Tách các bao phấn Khử trùng bề mặt Nhuộm acetoarmine để xác định GĐPT của hạt phấn Nuôi cấy trên mt đặc Nuôi cấy trên mt lỏng Phát triển phôi Loại bỏ chỉ nhị Hoa Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro Kiểu gen Đóng vai trò chính quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiệm. Do tác dụng của kiểu gen, việc sử dụng ngày càng nhiều sự đa dạng về di truyền sẽ càng tốt khi triển khai quy trình sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy hạt phấn. Mật độ bao phấn, hạt phấn Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối bởi mật độ bao phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường và thay đổi tùy theo loài thực vật Tuổi hạt phấn. Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể tứ bào tử cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn. Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng. Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo. Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn. Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến hành xử lý mẫu trước khi cấy. Xử lý Nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn, đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu hơn. Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn. Dinh dưỡng, hoocmon và các nhân tố khác Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là: MS-1962, LS-1965, B5-1968, N6-1976. Các Auxin ngoại sinh (IAA, NAA, IBA, 2,4 D) và cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin ,) cần được đưa vào môi trường để thúc đẩy quá trình phát sinh phôi Các nguồn chất hữu cơ không xác định như: dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, cà chua… và các axit amin, glutamin có tác động tích cực với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội. Khi sử dụng môi trường đặc cần lựa chọn thạch có độ tinh khiết cao sẽ cho hiệu quả tạo mô sẹo và cây con cao hơn. Hàm lượng đường cho vào môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng. Tình hình nghiên cứu: 1964 Guka và Maheshwasi lài hai nhà khoa học Ấn Độ lần đầu tiên đã tạo thành công cây đơn bội qua nuôi cấy bao phấn cây cà độc dược. Kĩ thuật đơn bội được ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các nước có công nghệ chọn giống trên thế giới. Công nghệ đơn bội đã được áp dụng đối với hầu hết các cây trồng quan trọng và mang lai hiệu quả kinh tế cao. Đối với một số cây như lúa, ngô, đại mạch, măng tây…thì đây là công nghệ không thể thiếu được trong chọn tạo giống. Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi cấy đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá. Thành tựu: Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985). Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105, VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS mới. Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây… Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Nuôi cấy bao phấn: Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng. Môi trường nuôi cấy đơn giản. Nuôi cấy hạt phấn: Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao. Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền. Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được. Nhược điểm của việc nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Nuôi cấy hạt phấn: Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ. Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo cây đơn bội không cao. Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng do tỉ lệ tái sinh cây thấp. Nuôi cấy bao phấn: Khó sàng lọc cây đơn bội. Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY NOÃN CHƯA THỤ TINH Khái niệm: Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là sự kích thích tế bào trứng hay các tế bào đối cực,tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh thành cây đơn bội.Sự hình thành từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh Đã có nhiều thành công trong nghiên cứu tạo các cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn. Nhưng ở một số loại cây như hành,hoa hướng dương hay củ cải đường… thì phương pháp này tỏ ra không hiệu quả. Chính vì vậy trong những năm 70 các nhà nghiên cứu đã tiến hành tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh và đã giành được một số kết quả đáng kể. Quy trình tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh Noãn chưa thụ tinh Nuôi cấy in vitro Phát sinh thể giao tử cái Hình thành túi phôi Tế bào trứng Tế bào kèm Tế bào cực Tế bào đối cực Callus Thể tiền phôi Tái sinh chồi Tạo cây hoàn chỉnh Cây đơn bội Tự đa bội hóa Cây đơn bội kép phôi Những nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách noãn khó và dễ gây tổn thương Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để tạo cây đơn tính mong muốn Kiểu gen của cây mẹ là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với quá trình nuôi cấy Người ta nhận thấy mỗi một kiểu gen có phản ứng khác nhau trong quá trình sinh trưởng nên phải xác định quy trình riêng cho từng loại cây cụ thể của từng kiểu gen nhân tố này đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa,hoa đồng tiền. Giai đoạn phát triển của noãn Giai đoạn phát triển của noãn có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội Túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn Tuy nhiên việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái là rất phức tạp vì túi phôi nằm trong bầu quả do đó khó quan sát trực tiếp để xác định được thì phải sử dụng các phương pháp tế bào học như tách túi phôi,nhuộm màu bằng lát cắ mỏng Môi trường nuôi cấy Các môi trường như MS, B5, MF thừng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Môi trường này chủ yếu ở dạng đặc Để cảm ứng được sự trinh sinh cần thiết thì phải bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thực vật Ngoài ra nồng độ đường cũng là một yếu tố cần được quan tâm,nồng độ phải phù hợp cho từng loại cây Trong nhiều trường hợp việc bổ sung thêm một số chất phụ gia như nước dừa có tác dụng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây Điều kiện nuôi cấy Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 25-28 độ Đối với đa số loài thường ở giai đạn đầu của quá trình nuôi cấy tiến hành trong điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây yêu cầu ánh sáng 2000-3000 lux Những thành tựu đạt được trong phương pháp tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh Tỉ lệ tạo cây đơn bội theo phương pháp này có nhiều khả quan như ở hành và củ cải đường :5-20%,ở dâu tằm là 3-6% Cây tái sinh ít bị bạch tạng ngay ở cả họ hòa thảo,trong khi nếu nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn có tỉ lệ bạch tạng 60-90% Ở các loại cây ngũ cốc ở VN thì biện pháp này tương đối đơn giản và dễ thành công như ở cây ngô So sánh Giống nhau: Đều dùng giao tử để tạo tế bào đơn bội. Đều nhằm tạo ra những cây đơn bội qua sự cảm ứng phát sinh phôi từ những phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội,các tiểu bào tử, các hạt phấn non. Khác nhau Phương pháp nuôi cấy hạt phấn tách rời tạo tế bào đơn bội cần phải tách rời các hạt phấn khỏi bao phấn khi nuôi cấy. Các hạt phấn này thường được nuôi cấy trên môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy chìm trong môi trường bán lỏng. Phương pháp nuôi cấy bao phấn được áp dụng trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau: ngô, lúa, thuốc lá… nhưng không áp dụng trên các cây hành, củ cải đường, hoa hướng dương. Phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh chủ yếu trên các đối tượng hành, củ cải đường, ngô, các cây ngũ cốc. Tuy nhiên kỹ thuật này còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách vách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn do vậy người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy… Hiện trạng Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội. Còn nuôi cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết quả về nuôi cấy hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium electum (Saparov và cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa belladonna (Bajaj,1974). Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành công hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao. Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao. Ví dụ cấy bao phấn giống lúa Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica lại có vai trò quan trọng hơn nhiều giống Japonica Nuôi cấy bao phấn thuốc lá Nguyên liệu và thiết bị: Nụ hoa thuốc lá (Nicotiana tabacum) Nước cất 2 lần vô trừng Etanol 90% Dung dịch hipoclorit natri 10% (V/v) Thuốc nhuộm acetocacmin Agar Đĩa petri Môi trường MS hoặc môi trường NN Kính hiển vi giải phẫu Dao, kéo, panh,... Dùng cho nuôi cấy Một số hóa chất để pha môi trường lỏng: saccarozo, KNO3,… Tiến hành Thu hái các nụ hoa của thuốc lá khi chúng có tràng hoa dài 21-23mm (thời điểm các hạt phấn thuốc lá hoàn thành phân bào nguyên phân đầu tiên) Xử lý lạnh các nụ hoa khoảng 12 ngày ở 7-8oC, sau đó khử trùng bề mặt nụ hoa bằng etanol 90% trong 30s, sau đó chuyển chúng sang các đĩa petri đã chứa dung dịch hipoclorit natri 10% trong 10 phút Rửa các nụ hoa vài lần trong nước cất 2 lần vô trùng. Dùng dao, kim và panh giải phẫu cẩn thận nụ hoa và lấy ra các bao phấn (có thể sử dụng kính hiển vi giải phẫu để hỗ trợ cho quá trình thao tác) Lấy 1 bao phấn của mỗi nụ hoa và ép trong acetocacmin để xác định giai đoạn phát triển của hạt phấn. Nếu hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp thì các bao phấn còn lại của nụ hoa được dùng trong nuôi cấy Các bao phấn có thể được nuôi cấy theo 2 cách: Trên môi trường MS đặc (có 0,6-1,0%(W/v) agar) Nuôi cấy nổi trên môi trường lỏng gồm: KNO3-950(mg/l); NH4NO3- 825(mg/l); MgSO4.7H2O- 185(mg/l); CaCl2- 220 (mg/l);KH2PO4-85 (mg/l); FeSO4.7H2O-27,8 (mg/l) ; Na2EDTA-37,3 (mg/l);saccarozo-20000 (mg/l) 6. Quá trình nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25oC trong tối hoặc ở ánh sáng yếu. Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng 300lux. Sau 4-6 tuần nuôi cấy, các cây con sẽ xuất hiện từ một số bao phấn. Khi mô bao phấn đạt 3mm thì tách cây con ra khỏi mô và chuyển sang môi trường tạo rễ (có thể dùng môi trường MS với thành phần khoáng giảm 1 nửa). Cường độ ánh sáng cao hơn thời gian chiếu sáng khoảng 10-12h/ngày TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬTĐề tài: Nuôi cấy tế bào trần G/V hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh Nhóm thực hiện : Trần Thị Chiên Lê Thị Cẩm Lê Phan Thị Thanh Phạm Thu Trang Nguyễn Thị Tuyết Mở đầu Các tế bào thực vật có tính toàn năng,có thể nuôi cấy, điều khiển sự phát sinh hình thái của chúng cho tới thành một cây hoàn chỉnh. Có thể nói, nội dung bên trong vỏ tế bào trong đó vật chất chính là các thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết định mọi đường hướng của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào. Vì thế,hoàn toàn có thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân của tế bào. Từ đấy đưa đến khái niệm nuôi cấy tế bào trần thực vật. Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinh vật. Protoplast 1.Khái niệm về Protoplast Protoplast là các tế bào trong đó có thành tế bào được loại bỏ và màng tế bào chất là lớp ngoài cùng nhất trong tế bào. Protoplast có thể thu được bằng enzyme lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp. Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzym; Pectinase phân hủy pectin, cellulas phân hủy hemicellulose. Các tế bào trần nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia.Các tế bào trần, thậm chí khác loài,có thể kết hợp với nhau tạo tế bào lai và quan trình này gọi là sự dung hợp tế bào trần. 2. Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào trần ? Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi Xenluloz để xác định hướng kéo dài tế bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia. So với các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khác, nuôi cấy dung hợp tế bào trần giúp tạo ra các cơ thể lai mang các đặc điểm di truyền của các bố mẹ có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thể thực hiện được. 3.So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào: So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào. Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một một đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi trường). Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh rất mạnh, ví dụ tế bào mô thịt lá ở thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh. Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thành tế bào. Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản. Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào – gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào tạo nên một thể lai vô tính mà không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh,trực tiếp và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…)giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp. Tế bào lai thu được từ việc dung hợp hai tế bào trần được tái sinh và thành một cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào. Từ phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài- điều không thể thực hiện bằng phương pháp lai hữu tính thông thường. Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại đó là: Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện. Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp. 4. Kĩ thuật tách tế bào trần: 4.1. Phương pháp cơ học: Phương pháp này dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc nhọn ( sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. 4.2. Phương pháp enzyme: Để phá vỡ thành tế bào người ta thường sử dụng các enzyme chiết xuất từ các sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành vách tế bào như: nấm, ốc và mối. Các enzyme này đã được thương mại hóa theo các phương pháp khác nhau với mức độ tinh khiết khác nhau Hỗn hợp enzyme thường dùng là enzyme celluloza và macerozim được chiết xuất từ nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger và đã được sản xuất công nghiệp. Nồng độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng. Các hỗn hợp enzyme thường được sử dụng ở pH 5,5 – 5,8 trong 3-8h. Ngoài ra để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy người ta phải bổ sung những chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để duy trì cân bằng thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài. Các dung dịch thường dùng là dung dịch đường manitol, sorbitol. Nồng độ sử dụng khoảng 0,3 – 0,7M tùy theo đối tượng thực vật. So với phương pháp cơ học thì phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Có thể thu được từ 1 gam lá cỏ luzec hoặc khoai tây là 6-12 triệu tế bào trần. Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế bào đơn… Xác định chất lượng tế bào trần Sau khi phá vỏ tế bào vẫn có những mảnh thành tế bào còn xót lại làm ảnh hưởng đến những nghiên cứu sau này Cách tốt nhất để phát hiện thành tế bào là dùng calcofluor, một hóa chất sẽ bám vào phân tử xenlulozo và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím. Nếu các tế bào trần đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào hiển vi trường có màu tối thẫm các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể Còn một phương pháp khác là dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh Evan để xác định sức sống của tế bào trần. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất ngược lại các tế bào có màng sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được 5. Nuôi cấy tế bào trần Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy - Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vật liệu thực vật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân chia đầu tiên. - Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa, mạch nha… - Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu…. - Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao, Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu. Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào. Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng nồng độ Auxin. Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn Giai đoạn 1 Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành microcallus. Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus. Điều kiện nuôi cấy Nuôi trong môi trường lỏng lắc Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng thấm từ dưới lên, callus từ mô tế bào mà từ đó tách tế bào trần,agar. Nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nuôi tối. Ánh sáng thẩm thấu đẳng trương.Thời gian nuôi từ 1 đến 2 tuần. Giai đoạn 2 Microcallus thành callus ổn định hình thành phát sinh cơ quan. Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo. Từ đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh. Điều kiện nuôi cấy. Nuôi cấy trên môi trường đặc Chú ý tới ánh sáng và quang chu kì Có chất điều tiết sinh trưởng cho qua trình tái sinh cây Loại bỏ chất gây ánh sáng thẩm thấu Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào. 6. Dung hợp tế bào trần Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân tố bê