Đề tài Nhân nhanh In Vitro hoa Lan Mokara

amine để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamine thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamine HCl( vitamine B1); Pyridoxine HCl (vitamine B6); Acid nicotinic; Myo-inositol 1.2.3. Nguồn sắt [7] Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Na2- Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật 1.2.4. Nguồn Carbon [18] Các nguồn carbon (sucrose; glucose) là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao của cây con. Nồng độ sucrose (20g/l và 30g/l) thường được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực nuôi cấy mô Lan. Sucrose thông thường được thêm vào môi trường để dẩy mạnh tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con.Sự vắng mặt của đường làm giảm những vấn đề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng một cách tự dưỡng trong điều kiện invitro khi nồng độ CO2 và mật độ ánh sáng tăng. 1.2.5. Các chất hữu cơ[7] Nước dừa (CW-cocount) được dùng thông dụng trong nuôi cấy mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển như cây chà là, chuối, mầm lúa mì…Nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc. 1.2.6. Than hoạt tính [6,9] Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0,3% than hoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồi. Ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con 1.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô[13] 1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã sớm mở ra  khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống.       Thông qua nuôi cấy mô và tế bào chúng ta đã tiến hành so sánh  đặc tính  của cơ thể và các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể. Thực tế đã chứng minh  là cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh  rồi từ đó là nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo và từ mô sẹo có thể kích thích thành cây hoàn chỉnh.        Bằng phương pháp nuôi cấy mô chúng ta có thể tiến hành tìm hiểu và nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và kí chủ vì vậy mà bệnh lý sẽ được giải quyết  một cách cơ bản. 1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng giống và nhân nhanh giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học. Bằng phương pháp nuôi cấy mô sau một thời gian có thể tạo thành một sinh khối lớn các hoạt chất: alkaloic, glycoside, các steoid các chất dính dùng trong thực phẩm.       Những lợi ích trong nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp: + Kiểm soát được dịch bệnh hại cây trồng, ta có thể loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh. + Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đêm vào sản xuất. + Kiểm soát được từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch. + Tạo sự đồng loạt về giống, cơ giới hoá được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Làm tăng năng suất chất lượng cao giúp tiêu thụ nhanh và đêm lại thu nhập cao. 1.4. Giới thiệu chung về hoa Phong Lan 1.4.1. Một số đặc tính đại cương về họ lan (Orchidaceae) 1.4.1.1. Đặc điểm sinh học [16] Trong số những cây cho hoa có hơn 16000 loài và 700-800 giống thuộc họ Orchidaceae đã được xác định và rất nhiều loài lai giống nhân tạo. Họ lan chiếm vị trí thứ 2 sau họ Cúc (Asteraceae) và họ lớn nhất  trong lớp một lá mầm. Riêng ở Việt Nam lan được biết gồm 750 loài khác nhau.  Khác với cây trồng cạn, trồng trong môi trường nước các loài phong lan lại có đời sống ký sinh, bì sinh nhờ bộ rễ “ăn nổi” bám vào cây rừng nhiệt đới hoặc hút chất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoai mục. Nhìn chung, họ Lan bao gồm các loài thân thảo, sống lâu năm. Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá…Căn cứ vào cấu trúc thì có 2 nhóm: nhóm đơn thân như giống Vanda, Mokara,…Và nhóm đa thân như giống Cattleya…Ngoài ra cây lan còn mang một số đặc tính: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầu hết không có chất nuôi dưỡng. a/ Rễ - Lan là họ sống phụ (bì sinh) bám, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các dạng thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. - Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bỡi lớp mô hút dày, ẩm bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Với lớp mô xốp đó, rễ có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí. b/ Thân - Lan có 2 loại thân: đa thân và đơn thân - Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nước và các chất dinh dưỡng để nuôi cây invitro - Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giảng điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao. - Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. c/ Lá - Hầu hết các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá. - Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng - Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung  hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. - Màu sắc lá thường xanh bóng, nhưng có trường hợp 2 mặt lá khác nhau. Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ. d/ Hoa -  Hoa đối xứng qua một mặt phẳng. - Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh ngoài cùng là 3 cánh đài, thường có màu sắc và kích thước giống nhau. Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc. Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi. Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. - Ở giữa hoa có một trụ nổi lên, đó là bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống. Trụ gồm nhị và nhuỵ. Sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan. e/ Quả và hạt - Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc. quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chin, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. - Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bỡi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng - Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bỡi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng thành sau 2 - 18 tháng. 1.4.1.2. Sự phân bố [14] Họ lan phân bố từ cực Bắc như Thủy Điển xuống tận các đảo cực Nam của Ostralia.Tuy nhiên trung tâm phân bố của họ này ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt ở châu Mỹ và Đông Nam Á.Theo nghiên cứu ở vùng nhiệt đới Châu Á có tới 6800 loài. Riêng ở Việt Nam có tới 800 loài .                                                                               Hình 1.1 Một số loài hoa Mokara Hình 1.3. Lan Cattleya Hình 1.2. Lan Hồ Điệp Hình 1.4. Lan Mokara Hình 1.5. Lan Đendrobium 1.5. Giới thiệu chung về hoa Mokara [12] 1.5.1. Đặc điểm sinh học của lan Mokara 1.5.1.1. Đặc điểm hình thái lan mokara Mokara là nhóm giống hoa được lai tạo từ các giống: Arachnis x Vanda x Ascocentrum. Nhóm giống này có đặc điểm tương tự như nhóm Vanda là loài Lan đơn thân, thân hình trụ dài tiếp tục mọc cao lên mãi, không có giả hành, lá dài hình lòng máng hay hình trụ mọc cách hai bên thân. Phát hoa mọc từ nách lá giữa thân, phát hoa dài mang nhiều hoa thường không phân nhánh. Hoa cỡ trung bình đến lớn, cánh đài của hoa rất lớn. Hoa có nhiều màu sắc phong phú từ trắng, tím, hồng đỏ, cam, vàng nâu, xanh, trên cánh hoa thường có chấm, có đốm hoặc hình carô rất đẹp .  Hình 1.7. Lan Mokara đỏ Hình 1.6. Lan Mokara cam Hình 1.9. Mokara vàng chấm Hình 1.8. Lan Mokara hồng Hình 1.11. Lan Mokara vàng Hình 1.10. Lan Mokara tím Hình1.5. Lan Mokara trắng 1.5.1.2. Sự phân bố Mokara là giống lan có nhiều trong họ Orchidaceae, Mokara phân bố trên các vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nan Á. Nếu như các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp của mình, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Mokara vô cùng phong phú, điều kiện sinh thái cũng rất đa dạng. Hình 1.12. Mokara -Vanda ,Arachanis, Ascocenda 1.5.2. Môi trường và các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng nuôi cấy mô hoa Mokara [13] 1.5.2.1. Nhiệt độ cây Nhiệt độ thích hợp cho Lan Mokara,  phát triển từ 25 - 30 độ C. Nhiệt độ là một trong những yếu tố quyết định sự ra hoa của Mokara. 1.5.2.2. Ẩm độ Rễ của  Mokara là rễ trần (rễ phơi ra ngoài không khí) nên đòi hỏi ẩm độ của vườn rất cao. Cây lan Mokara,  không chịu úng nên phải trồng thật thoáng. Vì đặc điểm của thân cây là lan đơn thân, không có giả hành nên khả năng mất nước rất lớn, từ đó làm cây sinh trưởng kém. Do đó, thường xuyên tưới nước mỗi ngày 2 lần (sáng sớm và chiều mát). 1.5.2.3. Ánh sáng Nhóm lan Mokara, thuộc nhóm ưa ánh sáng trung bình. Cường độ ánh sáng khoảng 50 - 60% nên cần thiết kế giàn che cho thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển. 1.5.2.4. Độ thông thoáng và giá thể Nhóm lan  Mokara rất cần độ thông thoáng nhiều, nhất là trường hợp trồng cây trong chậu vì hệ rễ của cây rất phát triển mà chất trồng (giá thể)  lại bí. Nên sử dụng chậu đất có nhiều lỗ thoát, bỏ một ít (rất nhỏ) chất trồng vào chậu. Hoặc không cần giá thể cây vẫn sinh trưởng tốt nhưng phải cung cấp thường xuyên dinh dưỡng cho cây. 1.5.2.5. Nhu cầu dinh dưỡng Mokara, cần dinh dưỡng khá cao và thường xuyên. Nên kết hợp sử dụng phân chuồng hoặc phân cá và phân hỗn hợp NPK 30 - 10 - 10 hoặc 20 - 20 - 20, tuỳ theo tuổi cây và tình hình sinh trưởng. Do đặc điểm cấu tạo của Mokara, là có hệ rễ trần nên khi sử dụng phân bón nên sử dụng với liều lượng thấp và nồng độ loãng. Lưu ý vấn đề vàng và tuột lá chân ở Mokara là do thiếu nước và thiếu dinh dưỡng, nhất là đạm  1.5.3. Gíá trị kinh tế và giá trị sử dụng hoa Mokara [15] Lan Mokara là một loài hoa đẹp có giá trị kinh tế .Mokara có hoa nhiều màu sắc phong phú, đa dạng được rất nhiều người ưa thích, là loại hoa có lượng lưu thông lớn trên thị trường thế giới, sản lượng đứng thứ ba thứ tư của hoa cắt cành. Hoa tươi là một sản phẩm hàng hoá đặc biệt của ngành nông nghiệp. Hiện nay trồng hoa đã trở thanh trở thành một ngành sản xuất khắp thế giới. Trong đó hoa Mokara góp một phần không nhỏ. Với ưa thế rất phong phú về hình dạng và màu sắc Hoa Mokara có gía trị kinh tế rất cao trong sản xuất mặt hàng tinh thần. Bên cạnh giá trị phong phú về tinh thần thì hoa Mokara được sử dụng để tách chiết và tinh chế dầu thơm phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm, bánh kẹo. Đối với y học, loài này cũng có giá trị nhất định Với giá trị như vậy hoa Mokara hứa hẹn mang lại một nguồn doanh thu lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này. Hiện nay trên thị trường Việt Nam, các loại hoa Mokara đang được bán phổ biến từ 10.000 đến 15.000 đồng/cành (theo điều tra của thời báo kinh tế). Như vậy đầu tư vốn vào phát triển kinh doanh mặt hàng này sẽ đem lại cho sản xuất lợi nhuận rất cao. 1.5.4. Các loại sâu hại chủ yếu trên hoa Mokara [15] Các bệnh gây hại phổ biến trên nhóm lan Mokara chủ yếu như sau:      - Bệnh đốm lá    + Do nấm Cercospora sp. gây nên. Sử dụng các loại thuốc trừ nấm  như Zineb 3/2000, Benlat 1/2000.      - Bệnh đốm vòng cánh hoa  + Do nấm Alternaria sp. gây ra. Có thể sử dụng thuốc trừ nấm phổ rộng như Daconil 500 SC . 1.5.5. Vật liệu chứa môi trường nuôi cấy hoa Mokara Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu về chuyển gen cây trồng, nhân giống các giống cây có giá trị, sản xuất nguyên liệu cho quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp, các nghiên cứu về sinh lý thực vật…Ngoài những thiết bị sử dụng trong chuẩn bị, khử trùng môi trường, hóa chất đặc trưng trong nuôi cấy mô, bình nuôi cấy là một dụng cụ không kém phần quan trọng. Nhiều nhà khoa học đã có những công trình nghiên cứu, đánh giá ảnh hưởng của bình nuôi cấy lên sự phát triển của mẫu cấy. Bình nuôi cấy có thể được làm từ nhiều vật liệu khác nhau như nhựa, thủy tinh, film nylon… Trong các phòng nuôi cấy mô trên thế giới việc sử dụng bình nuôi cấy bằng nhựa hay film nylon đã rất phổ biến, thay thế dần các bình nuôi cấy bằng thủy tinh. Hiện nay tại nước ta, việc nuôi cấy mô thực vật thực hiện chủ yếu trong các bình nuôi cấy bằng thủy tinh như bình tam giác, chai nước biển, vỏ chai rượu…Việc sử dụng những bình thủy tinh này có ưu điểm là tương đối rẻ tiền, dễ mua nhưng rất dễ vỡ, do không được thiết kế chuyên biệt cho việc nuôi cấy mô nên có nhiều chi tiết không thuận tiện, chiếm nhiều diện tích. Một số đơn vị hiện nay đã sử dụng các hộp nhựa tròn dùng được thực phẩm để làm bình nuôi cấy tuy nhiên do những hợp nhựa này được làm từ loại nhựa polypropylen nên hơi đục, không được trong suốt và dễ lão hóa chỉ qua 3 – 4 lần hấp khử trùng bằng autoclave Hiện tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM đã hoàn tất việc thử nghiệm nguyên liệu nhựa phù hợp và sản xuất thành công hộp nhựa vuông thích hợp cho nuôi cấy mô thực vật. Hộp nhựa với kích thước 65x65x95 mm làm từ nguyên liệu nhựa polycarbonate có độ bền cao, có thể hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong thời gian là 20 phút. Ngoài ra hộp nhựa vẫn trong suốt sau nhiều lần hấp khử trùng (ít nhất 30 lần hấp khử trùng), mức độ truyền sáng tốt cung cấp đủ ánh sáng cho mẫu cấy phát triển. Có thể ứng dụng hộp nhựa trong công tác giữ giống, giai đoạn vô mẫu, nhân nhanh cụm chồi, vươn thân, nuôi cấy hạt …Bên cạnh đó, hộp nhựa còn có thể xếp chồng lên nhau, tiết kiệm được không gian phòng nuôi cấy. Hình 1.13. Hoa Mokara nuôi trong hộp nhựa vuông 1.5.6. Thiết bị và các nhân tố đảm bảo trong nuôi cấy mô 1.5.6.1. Thiết bị a/ Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước 1 lần - Máy cất nước 2 lần b/ Phòng hấp – sấy - Autoclave - Tủ sấy 60 – 200oC c/ Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g) - Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g) - pH kế - Máy khuấy từ - Tủ lạnh - Lò vi sóng (microwave) d/ Phòng thao tác nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng (laminar) - Quạt thông gió - Đèn tử ngoại treo tường e/ Phòng nuôi cấy - Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang - Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang - Tủ ấm f/ Phòng thí nghiệm (phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền) - Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần) - Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần) - Microtome - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu - Quang phổ kế … 1.5.6.2. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô thực vật Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách - Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. a/ Ý nghĩa vô trùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. b/ Nguồn tạp nhiễm Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: - Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối - Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn - Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường c/ Kỹ thuật vô trùng Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường + Dụng cụ thuỷ tinh Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng. Bảng 1.1. Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử trùng Nhiệt độ (0c) Thời gian khử trùng (phút) 160 45 170 18 180 7,5 190 1,5 + Nút đậy. Do bông không thấm nước có các nhược điểm sau: - Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài - Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn - Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ Nên hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng. + Môi trường Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại. Bảng 1.2. Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi hấp (autoclave) ở 121oC tại 103,4 kPa Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng (phút) 50 15 75 20 250-500 25 1000 25 Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá chất nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng trưởng, và các chất kháng sinh. Các chất như vậy thường phải được khử trùng bằng cách lọc vô trùng. Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hoặc sợI cellulose. Các lỗ trên màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ lại các vi sinh vật gây nhiễm. + Lọc vô trùng Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore. Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc. d/ Khử trùng mô thực vật Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Để có khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin dẫn tài liệu nghiên cứu của Street (1974) ở bảng sau: Bảng 1.3 Hiệu quả của các tác nhân vô trùng Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Calci hypochlorit 9-10 5-30 Rất tốt Natri hypochlorit 2 5-30 Rất tốt Hydro peroxid 10-12 5-15 Tốt Nước Brom 1 2-10 Rất tốt HgCl2 0,1-1 2-10 Trung bình Chất kháng sinh 4-50 mg/l 30-60 Khá tốt Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải được cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết quả. Có thể dùng kháng sinh để kiểm soát hoặc loại bỏ sự nhiễm nấm trên mô cấy. Hầu hết các kháng sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô trùng. Chúng hoà tan được trong nước hoặc dung môi thích hợp khác, lọc vô trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này đã được làm nguội còn 45-500C Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và Neomycin thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một phạm vi pH nhất định. Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật sau khi bị xử lý trong một thời gian dài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc cho thực vật (và người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy mô thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh khác), các polymicin và vancomycin. *Rifampicin Khả năng hoạt động Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên các ribosome 30S hoặc 50S Gây trở ngại cho quá trình sao chép DNA bằng cách ức chế enzym DNA gyrase Ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Ức chế sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên ribosome 30S Ức chế sự sinh tổng hợptetrahydrofolate Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên Rbx 50S Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên Rbx 50S Tác động lên sự sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn. Gắn lên màng tế bào làm thay đổi dòng ion dẫn đến sự phá vỡ tế bào Tác động lên RNA bằng cách gắn vào RNA polymerase e/ Kỹ thuật cấy vô trùng Để tránh bị nhiễm trong suốt thao tác cấy mô thực vật, các nhà khoa học làm việc trong tủ cấy vô trùng (laminar). Đó là các tủ cấy có thiết bị thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Tủ cấy vô trùng loại trừ một cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm từ bên ngoài và tạo điều kiện thoải mái cho người cấy. Không khí từ bên ngoài được quạt hút vào qua một màng lọc thô. 99% bụi trong không khí được giữ lại ở màng lọc thô. Sau đó không khí được thổi qua màng lọc tinh và phân phối đều ra khắp bề mặt của tủ cấy, không tạo những xoáy không khí đưa bụi vào chỗ cấy. Màng lọc tinh ngăn cản các phần tử lớn hơn 0.3micron với hiệu quả 99,99%. f/ Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Trước khi đưa vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h. Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90%. Tia UV cũng có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và tủ