Đề tài Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nhóm 7:Nuôi cấy huyền phù tế bào Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra. Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn năng. Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học và dược liệu rất quan trọng. Tuy nhiên trong những năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như: - Điều kiện tự nhiên không thuận lợi. - Chi phí lao động ngày càng tăng. - Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt. Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên. NỘI DUNG Khái niệm nuôi cấy huyền phù tế bào Lịch sử nghiên cứu Các phương pháp nuôi cấy Đặc trưng của tế bào nuôi cấy huyền phù Các chỉ tiêu xác định tốc độ sinh trưởng Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào Công trình nghiên cứu cụ thể Kết luận I. KHÁI NIỆM Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures): Phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy. Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. I. KHÁI NIỆM 1949: Caplin và Steward đã nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trường lỏng có khuấy. Muis (1954) và Nickell (1956) cho thấy rằng các tế bào thực vật có thể sinh trưởng được như các cơ thể vi sinh vật. 1959, Melches và Beckman đã tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn và huyền phù tế bào. II. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU Nuôi cấy huyền phù tế bào Khoai tây III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY Tùy điều kiện và mục đích mà có các phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù khác nhau. Chủ yếu là phương pháp: Nuôi cấy dịch thể động. Trong nuôi cấy dịch thể động có hệ thống cung cấp khí (thổi khí), các khí đều được “vô trùng”. 3.1. Nuôi cấy dịch thể động 3.1.1. Nuôi cấy chìm liên tục Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường. Sự thông khí được thực hiện nhờ máy lắc chạy ở tốc độ 100 - 150 vòng/phút. Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng. Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 ml, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút. Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình. Máy lắc tròn Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày. Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được cấy chuyển sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 3.1.2. Nuôi cấy chìm tuần hoàn Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với những khoảng thời gian được đưa ra ngoài môi trường. Quá trình được thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của các bình nuôi cấy. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY Khi chuyển động: Khối tế bào ở đầu này được đưa vào môi trường. Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí.  Steward và cộng sự (1952) cũng đã thiết kế những bình nuôi cấy đặc biệt theo phương pháp nuôi cấy chìm tuần hoàn. Hệ thống nuôi cấy chìm tuần hoàn III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 3.2. Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor: Hệ thống nuôi cấy được thông khí hoặc được trao đổi khí. Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới theo từng thời kỳ. Tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu thường xuyên cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống trộn môi trường. Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có sự liên kết giữa bioreator với hệ thống chiếu sáng. Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp. Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa. VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất 100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY  Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY  Thuận lợi: Thể tích nuôi cấy tăng giúp sản xuất nhiều hơn mà không cần những kĩ thuật cao cấp. Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quốc Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lí có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Điều này không thể thực hiện với hệ thống nuôi cấy bình tam giác.  Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY Bioreactor trong phòng Nuôi cấy mô tế bào và công nghệ tế bào thưc vật -Viện DT nông nghiệp Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979). Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được điều chỉnh bởi thành phần môi trường. VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp.  Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi cấy: Pha lag: bắt đầu khi đưa mô sẹo vào môi trường, kéo dài cho tới lần phân bào đầu tiên. Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia và số lượng tế bào tăng dần. Pha hàm số mũ: số lượng tế bào tăng theo hàm số mũ. Pha ổn định: số lượng tế bào đạt cực đại và không đổi theo thời gian, số tế bào sinh ra (do phân bào) xấp xỉ số tế bào chết đi. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn sớm của pha ổn định. Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung là nên bắt đầu khi mật độ tế bào cực đại. Mật độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày, với huyền phù sinh trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ 6 – 9 ngày. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn, các mảnh từ mẫu cấy ban đầu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền. Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm bảo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ không sinh trưởng được. VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thích hợp 9 – 15.103 tb/ml. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy, sinh trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào. Đặc điểm của dòng tế bào: Khả năng tách tế bào cao. Hình thái tế bào đồng nhất. Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc. Nhiều hạt tinh bột. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Tương đối ít các yếu tố mạch. Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72h. Mất tính toàn năng. Quen với chất sinh trưởng. Tăng mức đa bội thể. Tế bào trong nuôi cấy huyền phù 5.1. Số lượng tế bào Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút. Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy. V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.2. Thể tích tế bào Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Thu tế bào và đem xác định thể tích. Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ %. V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.3. Khối lượng tươi và khối lượng khô tế bào Khối lượng tươi: Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định. Rửa bằng nước cất vô trùng Làm khô trong chân không. Cân để xác định khối lượng. Khối lượng khô: Lấy một thể tích mẫu xác định. Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman. Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi. V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.4. Xác định thành phần Protein Thu thập tế bào, chuyển lên lọc qua giấy Whatman. Rửa tế bào trong ethanol 70% đang sôi. Làm khô với Aceton rồi chuyển vào dung dịch NaOH 1M. Đun nóng đến 850C trong 1.5h. Lọc và xác định Protein thủy phân trong dịch theo phương pháp Lowry và cs (1951). V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.5. Xác định chỉ số nguyên phân Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào. Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân. V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 6.1. Sản xuất sinh khối tế bào và các hợp chất thứ cấp Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng là những chất có giá trị cao và cần ở lượng nhỏ. Có thể chia thành các nhóm dựa theo công dụng: Hợp chất thứ cấp trong y học. Hợp chất thứ cấp trong hóa mỹ phẩm. Hợp chất thứ cấp trong công nghiệp. VI. ỨNG DỤNG Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối? Tàn phá môi trường và sự xói mòn di truyền. Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lượng không ổn định. Nhiễm bẩn do thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng …  Nuôi cấy huyền phù tế bào khắc phục được các nhược điểm trên. VI. ỨNG DỤNG VI. ỨNG DỤNG Ngoài ra, nuôi cấy huyền phù tế bào còn có một số ưu điểm sau: Sản xuất một cách có định hướng, theo quy mô công nghiệp, khối lượng sản phẩm lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ. Tỷ lệ % khối lượng khô các hợp chất thứ cấp cao hơn so với nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên. Không tốn nhiều diện tích gieo trồng. Thu sinh khối tế bào lớn trong thời gian ngắn. Một số hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật: Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp khớp, đau lưng, đau dây thần kinh. Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) trong bioreactor đã thu được năng suất diosgenin cao hơn so với hiệu suất có được từ nguyên liệu tự nhiên. Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7.8 % khối lượng khô, trong khi chỉ chiếm 2 % với nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên. VI. ỨNG DỤNG VI. ỨNG DỤNG Codein: Giảm đau và giảm ho. Papaver somniferum là nguồn của 2 hợp chất rất quan trọng trong y học là morphine và codein. Sản xuất morphin đã được thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào tế bào Papaver somniferum. Cây anh túc (Papaver somniferum) VI. ỨNG DỤNG Steviol: Chất tạo vị ngọt được biết đến rộng rãi, thu nhận từ cây Stevia rebaudiana. Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong tích lũy steviol. Trong nuôi cấy callus, hiệu suất đạt tới 36.4 %. Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) VI. ỨNG DỤNG Taxol: - Là một nhóm chất trong hóa trị liệu ung thư, điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, khối u ác tính, và các dạng u bướu khác. - Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (T. cuspidata, T. baccata, T. mairei). Cây thông đỏ (Taxus brevifolia) VI. ỨNG DỤNG Scopolamine và hyoscyamine: Là 2 loại tropane alkaloid được sử dụng để trị co thắt và gây mê. Có nhiều trong các cây thuộc họ Solanaceae. Nuôi cấy huyền phù tế bào Scopolia japonica có bổ sung tropic acid (như 1 tiền chất) thì có thể tăng hàm lượng alkaloid lên 15 lần. Cà độc dược (Datura metel) VI. ỨNG DỤNG Saponin và sapogenin: Là một dược phẩm quý giá, có nhiều trong rễ cây nhân sâm (Panax ginseng), có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy nhược cơ thể, tăng cường sinh lực. Nuôi cấy huyền phù tế bào cây P. ginseng đang tiến hanh trên quy mô công nghiệp. Đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Nhân sâm (Panax ginseng) VI. ỨNG DỤNG Betalaine: Là một nhóm các chất nhuộm màu thực phẩm. Bao gồm betaxanthine (màu vàng) và betacyane (màu đỏ). Thành tựu nuôi cấy cơ quan cây Beta vulgaris, nuôi cấy callus và huyền phù của Portulaca americana. Củ cải đỏ (Beta vulgaris) 6.2. Trong công tác chọn giống cây trồng:  Sử dụng để chọn lọc các dòng tế bào mong muốn qua các test thanh lọc. Sau đó tái sinh các tế bào đã chọn lọc thành cây hoàn chỉnh. Cây hoàn chỉnh sẽ trở thành vật liệu khởi đầu quan trọng trong công tác giống. Ngoài ra, tách protoplast hoặc là nguồn để sản xuất các phôi vô tính. VI. ỨNG DỤNG Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Bắt ruồi Drosera indica L. cho mục tiêu thu nhận Plumbagin. (Quách Diễm Phương). Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Bèo đất Drosera burmalni Vahl cho mục tiêu thu nhận 1 hợp chất Anthraquinone. Quách Diễm Phương (đề tài NCCB của ĐH Quốc gia TP HCM) VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Mãn Đình Hồng Althaea rosea L. nhằm thu nhận Rutin trong điều trị tim mạch. (Quách Diễm Phương). Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào họ cây Drosera.sp để thu nhận các hợp chất Quinone có hoạt tính sinh học. (Quách Ngô Diễm Phương). VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Thành công trong quy trình tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh bằng ứng dụng công nghệ Biomass – Học viện Quân Y. Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và Công nghệ Việt nam) đã hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh sinh khối mô của cây Hoàng Liên gai (Berberis Wallichiarna DC) bằng công nghệ tế bào thực vật để làm nguồn dược liệu sản xuất thuốc becberin. VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Tuy nhiên, do những khó khăn trong việc tìm kiếm tài liệu nên nhóm chúng em không đưa ra được một quy trình sản xuất dựa trên nuôi cấy huyền phù tế bào, mà chỉ đưa ra được một công trình nghiên cứu ở giai đoạn đầu: ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐƯỜNG SACCHAROSE LÊN DỊCH NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS Tác giả: Bùi Văn Lệ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Nguyễn Ngọc Hồng, Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Dừa cạn Catharanthus roseus.G.Don thuộc họ Trúc đào Apocynaceae là một trong những dược liệu chứa nhiều alkaloid. Từ dừa cạn người ta chiết được chất chữa ung thư như vinblastin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin. Tuy nhiên hàm lượng của những chất này có trong cây là rất thấp. Việc nuôi cấy tế bào cây dừa cạn để nâng cao hàm lượng alkaloid mong muốn đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất. VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Cây dừa cạn Catharanthus roseus Ajmalicin Vinblastin 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mô sẹo màu xanh được nuôi trong điều kiện chiếu sáng từ lá dừa cạn in vitro 4 tháng tuổi được chuyển vào 100 ml môi trường cảm ứng trong erlen 250 ml. Môi trường cảm ứng gồm môi trường MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trưởng thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kin hoặc BAP) + 30g/l đường sucrose. Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25± 2oC trong điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày. VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Xác định sinh khối bằng phương pháp cân. Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phương pháp của Kutney và cộng sự (1983). Xác định alkaloid toàn phần bằng phương pháp acid-baz - khan theo dược điển Việt Nam và dược điển Anh. VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Quy trình thực hiện thí nghiệm 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối Đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào dừa cạn trong môi trường bổ sung NAA và cytokinin 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối Kết luận: Ở bảng trên cho thấy môi trường chỉ bổ sung NAA có sự tạo sinh khối thấp hơn so với môi trường bổ sung NAA kết hợp với Kin. Môi trường K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) và K8 (MS + NAA (1mg/l) + BAP (0.5 mg/l) cho sinh khối tươi và khô đều cao hơn các môi trường khác. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối Đường tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào dừa cạn sau 28 ngày nuôi trong môi trường có bổ sung các hormone thực vật khác nhau. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối Kết luận: Môi trường có bổ sung 2,4-D tạo sinh khối tươi nhiều hơn so với môi trường bổ sung NAA nhưng trọng lượng khô lại rất thấp. Môi trường K3 và K4 có trọng lượng tươi thấp hơn môi trường K1 và K2 nhưng cho sinh khối khô nhiều hơn. Môi trường K3 cho sinh khối tươi và khô đều cao hơn môi trường K3 nhưng xét về mặt thống kê, hai môi trường này không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0.01. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối Kết luận:  2,4-D kích thích sự phân chia tế bào nhanh nhưng lại phá hủy cấy trúc chặt chẽ của tế bào làm cho tế bào xốp và giảm đi việc tạo các sản phẩm thứ cấp. Cytokinin cần thiết cho sự hình thành các hợp chất thứ cấp, khi kết hợp cytokinin với NAA giúp duy trì sự tăng trưởng cũng như tạo ra alkaloid cao. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3. Ảnh hưởng của đường sucrose đến việc tạo sinh khối 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3. Ảnh hưởng của đường sucrose đến việc tạo sinh khối Đường tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trường có bổ sung các nồng độ đường khác nhau 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3. Ảnh hưởng của đường sucrose đến việc tạo sinh khối Kết luận: Nồng độ đường tăng dần từ 20 - 60 gam/l sinh khối tươi và khô thu được trong môi trường tăng dần theo. Môi trường tối ưu cho thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự tạo sinh khối là môi trường Đ5. Tuy nhiên khi tăng nồng độ đường lên cao hơn là 70 - 80 gam/lít thì trọng lượng tươi và khô giảm dần. Nồng độ đường có ảnh hưởng đến sự tạo thành các sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào. Ở nồng độ đường sucrose cao vừa phải khoảng 50 –60 gam/lít sẽ kích thích tạo sinh khối và alkaloid. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.4. Định lượng alkaloid vinblastin và vincristin có trong lá cây không qua nuôi cấy in vitro và trong dịch huyền phù tế bào 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.4. Định lượng alkaloid vinblastin và vincristin có trong lá cây không qua nuôi cấy in vitro và trong dịch huyền phù tế bào Kết luận:  bằng phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù có bổ sung 2,4-D thì lượng vincristin và vinblastin không có trong mẫu alkaloid toàn phần còn dịch huyền phù NAA + Kin cho lượng vinblastin thấp hơn so với cây trồng ngoài tự nhiên nhưng cho lượng vincristin khá cao trong khi cây trồng ngoài tự nhiên trong thí nghiệm này lại không có. 4. KẾT LUẬN: Tìm được nồng độ hormon phù hợp: Ở nồng độ 1 mgl-1  -naphthaleneacetic acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận được sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu được sinh khối và alkaloid toàn phần thấp. Nồng độ đường tối ưu cho việc nuôi dịch huyền phù tế bào dừa cạn: ở nồng độ 60 gl-1 cho lượng sản phẩm là cao nhất. VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VIII. KẾT LUẬN Với nhiều ưu điểm vượt trội của mình, phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu cũng như trong thực tiễn sản xuất. Nuôi cấy huyền phù tế bào đang mở ra nhiều định hướng phát triển cho tương lai. Tuy nhiên, do cơ sở vật chất cơ bản cho một phòng thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào còn cao nên ở Việt Nam, hướng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu. Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình áp dụng các phương pháp của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế phẩm sinh học, y học … VIII. KẾT LUẬN Tài liệu tham khảo Công nghệ sinh học. Tập 2: Công nghệ tế bào. NXB Giáo dục. Các nguồn tài liệu trên Internet…