Đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của một số chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng xử lý phế thải ligno-xenluloza

có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối với tác dụng của các enzym. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất. Ba cấu tử xenluloza, hemixenluloza, lignin tạo nên ligno-xenluloza. Thành phần lignin, xenluloza, hemixenluloza trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật lý và thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau.[5, 20] 2.6.Cơ chế chuyển hoá ligno-xenluloza Từ các yếu tố trên ta thấy rằng ligno-xenluloza là một chất rất khó chuyển hóa và chuyển hoá rất chậm trong điều kiện tự nhiên. Đặc tính khó chuyển hoá này do một số nguyên nhân: Ligno-xenluloza là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzym. Các cấu phần hợp thành nên ligno-xenluloza được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ. Do thành phần cấu tạo của ligno-xenluloza rất đa dạng và phức tạp nên để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzym tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng hợp một phức hệ enzym phong phú và đa dạng như vậy. Muốn chuyển hoá được ligno-xenluloza cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau. 2.6.1.Enzym và cơ chế thuỷ phân xenluloza a) Enzym thuỷ phân xenluloza: xenlulaza Xenlulaza ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzym thuỷ phân xenluloza tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác giả cho rằng phức hệ enzym xenlulaza bao gồm ba enzym chủ yếu sau: -Exo-β(1,4)-glucanaza (Avicelaza) hay xenlobiohydrolaza (1,4 β-D-glucanxenlobiohydrolaza E.C.3.2.1.91) Enzym này phân cắt chuỗi xenluloza từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzym này không thuỷ phân xenluloza kết tinh cũng như xenluloza hoà tan (caboxymetyl xenluloza) nhưng có thể thuỷ phân được xenluloza đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ vai trò chính của enzym này là giúp cho enzym endoxenlulaza tác động lên được xenluloza kết tinh. -Endoglucanaza hay Endoxenlulaza (1,4 β-D-glucano-hydrolaza E.C.3.2.1.4) Enzym này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết β 1,4-glucozit trong phân tử xenluloza một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobioza và glucoza. Enzym này phân giải mạnh mẽ các xenluloza vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên xenluloza kết tinh và không phân giải được xenlobioza. Chính nhờ sự phân cắt trước của endoxenlulaza, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzym xenlobio-hydrolaza, do đó mà thuỷ phân được xenluloza kết tinh. Còn thứ tự ngược lại thì hiện nay người ta chưa biết. -Enzym β-1,4-glucozidaza hay xenlobiaza Đây là những enzym rất đặc hiệu. β-glucozidaza làm thuỷ phân xenlobioza và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucoza. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân xenluloza phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiaza. Tuy nhiên theo một số tác giả cơ chế thuỷ phân xenluloza bởi phức hệ enzym trên diễn ra theo một trật tự khác nhau. b)Cơ chế thuỷ phân xenluloza Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzym “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu. Các enzym này chỉ có tác dụng làm trương xenluloza tự nhiên. Các xenluloza tự nhiên sẽ được chuyển thành các xenluloza hoạt động trương nở có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzym Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đường tan (xenlobioza) và sau cùng thành glucoza[11]. Xeluloza tự nhiên Xenluloza hoạt động Đường tan Glucoza C1 Cx Xenlobiaza Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzym endoglucanaza tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt xenluloza, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanaza sẽ cắt ra tạo thành những đoạn xenlobioza. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit mạch ngắn,xelobioza, glucoza. Cuối cùng enzym xenlobiaza thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucoza. Endoglucanaza Vùng vô định hình Vùng kết tinh Exoglucanaza β-glucozidaza Glucoza Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzym C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở xenluloza kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra xenluloza biến tính. Sau đó enzym endoglucanaza tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobioza. Ông cho rằng sự thuỷ phân xenluloza là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanaza, enxoglucanaza và xenlobiaza. Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân xenluloza nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân xenluloza vẫn chưa hoàn toàn thồng nhất. 2.6.2. Enzym và cơ chế thuỷ phân hemixenluloza Khi nghiên cứu hemixenluloza, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống nhau giữa hai thành phần này.Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzym hemixenlulaza cũng có nhiều điểm tương đồng với xenlulaza ví dụ như cơ chế tác động.... Tuy nhiên, giữa hemixenlulaza và xenlulaza vẫn còn nhiều điểm khác biệt: - Hemixenluloza có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền hơn so với xenluloza - Hemixenluloza là cơ chất dễ đồng hoá hơn xenluloza do đó hemixenlulaza thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemixenluloza thường diễn ra song song với quá trình phân giải xenluloza.[5] 2.6.3. Enzym và cơ chế thuỷ phân lignin Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra ligninaza. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzym tham gia vào quá trình thuỷ phân lignin . Ligninaza không thuỷ phân lignin thành các tiểu phần hoà tan như phân giải xenluloza và hầu hết các polime khác, vì lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác ligninaza lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với lignin . Quá trình thuỷ phân có thể diễn ra theo điều kiện phản ứng hoá học sau: -Cắt oxy hoá mạch bên của đơn vị phenylpropan -Hình thành nhóm carboxyl thơm -Tách nhóm methoxyl - Hydroxyl hoá vòng thơm 2.7. Vi sinh vật phân giải xenluloza và một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật 2.7.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza vô cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. 2.7.1.1. Nấm sợi Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp xenlulaza thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp xenlulaza mạnh nhất. Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzym chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn.[11] Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzym cần cho quá trình chuyển hoá xenluloza đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài loại enzym nào đó mà thôi. Các loại nấm đáng chú ý nhất là:Alternaria tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [10] Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzym bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh xenluloza nhưng hoạt tính xenlulaza của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất xenlulaza cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6.[11] 2.7.1.2. Vi khuẩn Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kỵ khí có khả năng phân giải xenluloza. Những năm đầu thế kỷ XX(1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza, niêm vi khuẩn chiếm một vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận được năng lượng khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải xenluloza thành CO2 và H2O.[11] Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân huỷ xenluloza. Trong điều kiện kỵ khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải xenluloza. Chúng phát triển yếu trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải xenluloza thành glucoza và xenlobioza, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O. Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt. Chúng có khả năng phân giải xenluloza thành các sản phẩm.Các vi sinh vật đó thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium....[11] Ngoài ra còn có Cellulomonas, Bacillus cũng có khả năng phân giải xenluloza rất mạnh. 2.7.1.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng: Xạ khuẩn ưa ấm: phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300C Xạ khuẩn ưa nhiệt: phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 700C Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Xenlulaza của xạ khuẩn là enzym ngoại bào.[5] Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân xenluloza. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazein thường thuận lợi cho sinh trưởng. xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng .[11] Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp xenluloza và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và cộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzym xenlulaza của hai chủng Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp. 0143 với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C và pH tối thích là 5,9.[11] 2.7.2. Vi sinh vật phân giải hemixenluloza Hemixenlulaza là enzym ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanaza vì xylan là một loại hemixenluloza phổ biến trong tự nhiên.Các tác giả cho rằng nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả xenlulaza đồng thời tổng hợp cả hemixenlulaza. Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium. Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp xylanaza. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, ,T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium... 2.7.3. Vi sinh vật phân giải lignin Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Các vi sinh vật phân giải lignin thường là các loại nấm mục xốp như Paocylimyces,Allescheria, Pseussis, Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites... Ngoài ra còn có các loại nấm trắng như Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus... 2.7.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzym xenluloza của vi sinh vật 2.7.4.1.ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Xenlulaza là enzym cảm ứng, cơ chất của enzym này là xenluloza. Vì thế, xenluloza có ảnh hưởng rất rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp xenlulaza. Xenluloza gây cảm ứng cho việc hình thành xenlulaza ở nhiều loại nấm khác nhau.[11] Nấm sợi Trichoderma lignorum và Trichodema koningi tổng hợp rất nhiều enzym C1 và enzym Cx khi cho vào môi trường dinh dưỡng nguồn cacbon giấy lọc. Còn T.reesei lại rất thích hợp trong môi trường gồm cám bã và củ cải đường. Một số nguồn cacbon khác lại gây ức chế quá trình sinh tổng hợp xenlulaza như glucoza, xenlobioza... Khi nuôi cấy nấm trên môi trường chứa giấy lọc và tăng dần lượng glucoza lên, người ta nhận thấy khi glucoza tăng lên đến 2-3% sẽ xảy ra sự ức chế việc sinh tổng hợp xenlulaza. Với Pyrenochaeta terrestris là 0,001% với Fusarium culmorum là 2%.....[11] 2.7.4.2.ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Nguồn nitơ có ảnh hưởng rất rõ tới quả trình sinh tổng hợp xenlulaza của nấm mốc và vi sinh. Sin cho thấy khi sử dụng hết 1 gam nitơ, nhiều vi khuẩn có khả năng phân huỷ hết 24- 25 g xenluloza.[5] Nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp xenlulaza ở rất nhiều nấm sợi như: Aspergillus, Fusarium, Trichoderma. Muối amôn thường làm ức chế sinh tổng hợp enzym xenlulaza ở Aspergillus, Trichoderma và một số nấm khác. Nguyên nhân có thể là do muối amôn làm giảm pH của môi trường, làm bất hoạt một số enzym và làm cho các enzym này nằm trong khuẩn ty của nấm mà không thoát ra ngoài được. Các nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng không giống nhau đến các loài vi sinh vật. Pepton làm kích thích sinh tổng hợp ở Helminihosporium, Penicillium oxalicum. Nhưng pepton lại ức chế quá trình sinh tổng hợp ở Myrothecium, các loài nấm sợi Aspergillus, Chaetomium. Pepton có ảnh hưởng tốt đối với Trichoderma lignorum.[5,11] Urê làm giảm khả năng sinh tổng hợp của một loài các vi sinh vật. Cao ngô với lượng 0,5% sẽ làm kích thích sự sinh tổng hợp xenlulaza của T.koningi, A.niger, nhưng lại ức chế sự sinh tổng hợp xenlulaza ở nấm chịu nhiệt. Một số axit amin có ảnh hưởng rất rõ rệt đến quả trình tổng hợp xenlulaza của một số nấm. Khi bổ sung 0,01% valin và axit aspartic vào môi trường có thể làm tăng quá trình tổng hợp của Trichoderma. Đối với Aspergillus, một số axit amin như arginin, leuxin, histidin, cystein làm tăng khả năng sinh tổng hợp xenlulaza. Nhưng các axit amin khác lại làm giảm khả năng này.[5,11] 2.7.4.3.ảnh hưởng các nguyên tố vi lượng tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Trong các nguyên tố vi lượng, các nguyên tố sau có ảnh hưởng kích thích đến sinh tổng hợp xenlulaza: Fe, Mn, Co. Nồng độ thích hợp cho tuyệt đại đa số các loài nấm là: Zn từ 2-10 mg/l, Fe tử 3,4-27,2 mg/l. Các nguyên tố vi lượng khác từ 0,11-2,2 mg/l. 2.7.4.4.ảnh hưởng pH môi trường tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Đại đa số các loài nấm sợi phát triển và sinh tổng hợp xenlulaza mạnh ở pH=4-6. Tuy nhiên cũng có một số loài nấm sợi phát triển và phân huỷ xenluloza ở pH=1,8-2,0 như Fusarium oxysporum, Trichoderma koning. 2.7.4.5.ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp của các loài nấm rất khác nhau. Đại đa số chúng phát triển ở nhiệt độ 28-320C. Nhưng các loài ưa nhiệt có thể phát triển được tới 650C. Các chủng A. fumigatus ưa nhiệt thích hợp sinh trưởng và hình thành enzym phân giải xenluloza ở 650C. Những nghiên cứu của các tác giả trên về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cho thấy khả năng phân huỷ ligno-xenluloza tập trung chủ yếu ở hai nhóm nấm sợi và vi khuẩn. Cả hai nhóm nấm sợi và vi khuẩn đều có khả năng phân huỷ ligno-xenluloza trong điều kiện tự nhiên. Các loài vi sinh vật thường không có khả năng sinh tổng hợp cùng một lúc tất cả các enzym trong phức hệ enzym xenlulaza. Phân huỷ ligno-xenluloza trong thiên nhiên được thực hiện bởi hàng loạt các vi sinh vật. Các vi sinh vật này thay phiên nhau phân huỷ các thành phần hữu cơ chứa ligno-xenluloza, tạo nên một chuỗi phản ứng liên tục cho đến khi nguyên liệu ligno-xenluloza được chuyển hoá hết. Enzym xenlulaza là một loại enzym cảm ứng. Xenluloza là cơ chất cảm ứng của enzym xenlulaza. Tuy nhiên tính chất cảm ứng của xenluloza không chặt chẽ.Tính không chặt chẽ này có lẽ phụ thuộc nhiều vào cấu tạo của cơ chất xenluloza. Trong đó tỷ lệ xenluloza kết tinh và xenluloza vô định hình có tính chất quyết định đặc tính này. Chính vì thế có loài nấm sợi phát triển tốt trên giấy lọc, loại khác lại không thể phát triển tốt được. Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp xenlulaza của sinh vật là nitơ từ các muối nitrat. Các nguyên tố vi lượng như Fe, Mn, Co; pH của môi trường trong khoảng 4-6; nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng 28-32oC thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật phân giải ligno-xenluloza. III. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1. Nguyên vật liệu - Vi sinh vật: Các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza được phân lập được từ mẫu rác được lấy từ xí nghiệp xử lý chất thải Cầu Diễn-Hà Nội. - Dụng cụ: Máy so màu; Máy ly tâm; Kính hiển vi; Máy đo pH; Máy lắc; Cân điện; Tủ sấy; Nồi hấp; Tủ ấm. - Hoá chất: Các hoá chất dùng để làm môi trường phân lập và môi trường nuôi cấy, xác định hoạt lực enzym có tại phòng thí nghiệm tại Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường ĐH Bách khoa HN - Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Để phân lập, nuôi cấy và giữ các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza, chúng tôi sử dụng các môi trường sau: - Môi trường 1: Để giữ giống nấm, chúng tôi sử dụng môi trường Czapek có thành phần như sau (g/l). Saccaroza 30,0 NaNO3 2 KH2PO4 1 MgSO4. 7 H2O 0,5 FeSO4. 7 H2O 0,01 KCl 0,5 Agar 20 Nước 1000 ml ; pH = 6; Khử trùng ở 1 at trong 30 phút. - Môi trường 2: Để phân lập và giữ giống vi sinh vật chúng tôi sử dụng môi trường Hutchinson-Clayton có thành phần như sau Thành phần g/l KH2PO4 1 CaCl2 0.1 MgSO4.7H2O 0.3 NaCl 0.1 FeCl3 0.01 NaNO3 2.5 CMC 5 Agar 20 Khử trùng ở 1at trong 30 phút - Môi trường 3: Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi khuẩn và nấm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường dịch thể có thành phần như môi trường 2 nhưng không có Agar. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Các phương pháp vi sinh vật học. 3.2.1.1. Phương pháp phân lập. Để thu nhận được những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza từ mẫu rác chúng tôi sử dụng môi trường 2. Môi trường sau khi khử trùng được phân phối ra các đĩa petri vô trùng. Sau đó bao gói và đặt vào tủ ấm 300C trung bình 2 ngày cho khô mặt thạch và kiểm tra mức độ vô trùng của môi trường. Chỉ những đĩa không bị nhiễm mới dùng để phân lập. Mẫu rác lấy về phòng thí nghiệm được nghiền nhỏ rồi pha ở các độ loãng khác nhau bằng cách lấy 1g rác đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng, lắc đều rồi dùng pipet hút 1 ml dịch huyền phù từ bình sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng. Cứ như vậy pha loãng tới nồng độ mong muốn. Hút ở mỗi độ pha loãng 104, 105, 106 ra 0,1 ml dịch huyền phù và nhỏ vào các đĩa petri chứa môi trường 2 đã vô trùng. Dùng que trang dàn đều dịch trên bề mặt môi trường. Đậy nắp hộp lại, bao gói và nuôi trong tủ ấm ở 300C. Phía dưới giá nuôi vi sinh vật đặt một khay nước để tạo ẩm không khí thích hợp. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong 5 - 7 ngày. Từ môi trường phân lập, chọn các khuẩn lạc phát triển mạnh, mọc riêng rẽ dùng que cấy đầu tròn cấy dích dắc vào ống thạch nghiêng chứa môi trường 2 đã vô trùng. Nuôi ở tủ ấm 300C trong 7 ngày cho vi sinh vật phát triển tốt rồi đưa các ống giống vào bảo quản lạnh trong tủ lạnh 40C. 3.2.1.2. Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Cân 1g mẫu cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng, lắc đều. Sau đó pha loãng, rồi dùng pipet vô trùng hút từ mỗi nồng độ pha loãng đó ra 0,1 ml dịch huyền phù và cấy lên các hộp petri chứa môi trường 4 vô trùng. Dàn đều bằng que trang, đậy nắp, bao gói rồi đưa vào nuôi trong tủ ấm. Sau 2 ngày đem ra đếm số lượng vi sinh vật. Số lượng vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau: X = x . k. v x: Số vi sinh vật trung bình trong một hộp petri k: Nồng độ pha loãng v: Thể tích dịch huyền phù dùng để cấy. 3.2.2. Các phương pháp hoá sinh 3.2.2.1. Chiết rút enzym Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng với tốc độ lắc 200vòng/phút. Sau đó loại bỏ sinh khối, dịch trong thu được chính là dịch enzym thô. 3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xenlulaza ngoại bào Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza ngoại bào của nấm sợi chúng tôi sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch, hiện màu bằng Lugol. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: Khi enzym xenlulaza thuỷ phân CMC (Cacboxymetyl Xenluloza) có trong thạch sẽ tạo thành vòng thuỷ phân màu vàng xung quanh lỗ trên nền xanh tím (do còn CMC). Dựa vào hiệu số giữa đường kính của vòng thuỷ phân và đường kính của lỗ đục mà ta xác định được hoạt tính enzym xenlulaza của vi sinh vật. Cách tiến hành như sau: Hoà tan 20g Agar và 1g CMC bằng cách đun nóng trong 500 ml nước cất. Sau đó thêm 500 ml dung dịch đệm xitrat - photphat 0,2 M (pH = 5,5). Đổ dịch lỏng vào các hộp petri sao cho chiều dày của lớp thạch khi đông lại là 3 mm. Dùng ống đục lỗ tròn với đường kính 10 mm Nhỏ vào lỗ 0,2 ml dịch enzym, lỗ đối chứng nhỏ nước cất. Để vào tủ lạnh trung bình 12h cho enzym khuếch tán sau đó cho vào tủ ấm 400C trong 6h để enzym tác dụng với cơ chất (CMC). Lấy ra, cho vào mỗi đĩa 5 ml dịch Lugol, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết dịch Lugol đi. Đo vùng CMC bị phân giải xung quanh lỗ (Vùng mầu vàng trên nền xanh tím). Hoạt tính CMC – aza biểu thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ khoan: D - d(mm) Trong đó: D - Đường kính vòng phân giải d - Đường kính lỗ khoan 3.2.2.3. Xác định sinh khối nấm sợi Cân giấy lọc đã được sấy khô ở 1050C đến trọng lượng không đổi. Dùng giấy lọc này lọc dịch nuôi cấy vi sinh vật rồi lại đem sấy khô đến trọng lượng không đổi. Cân và xác định trọng lượng khô của vi sinh vật theo công thức: P = P2 - P1 P1: Trọng lượng khô của giấy lọc P2: Trọng lượng khô của giấy lọc và vi sinh vật 3.2.2.4. Xác định sinh khối vi khuẩn Lấy 2,5 ml dịch nuôi cấy vào ống li tâm. Lắc li tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút. Thêm 1ml NaOH 2N lắc đều. Đun sôi cách thuỷ 5 phút sau đó làm lạnh. Cho thêm 0,5 ml CuSO4 2,5%, lắc đều. Đưa vào máy li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. So màu ở bước sóng 555nm. Mẫu đối chứng cũng làm tương tự nhưng thay dịch nuôi cấy bằng nước cất. Dựng đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein (casein trong nước cất) làm như trên. So màu ở bước sóng 555 nm. Sau đó dựng đồ thị chuẩn. IV. Kết quả và thảo luận 4.1. Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cao. Sau khi lấy mẫu rác và thực hiện quá trình phân lập trên môi trường 2, tôi đã lựa chọn ra 10 chủng vi khuẩn phát triển mạnh và có hình thái bên ngoài khác nhau. Các chủng này được đặt tên quy ước là: V1,V2,V3,V4,V5,V6,V7,V8,V9,V10. Bên cạnh đó, tôi cũng phân lập được 7 mẫu nấm. Các chủng này cũng được đặt tên quy ước là: N1, N2, N3, N4, N5, N6 ,N7. Nhằm mục đích tuyển chọn ra những chủng có hoạt tính xenlulaza cao nhất từ những chủng vi khuẩn kể trên, tiến hành tiếp tục quá trình nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trên môi trường 3 (môi trường 2-dịch thể). Sau khi nuôi cấy các mẫu được đem xác định hoạt tính CMC-aza. Các kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng sau: Bảng1: Khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi khuẩn. Chủng vi sinh vật V1 V2 V3 V4 V5 Hoạt tính CMC-aza (D, mm) 22 21 18 23 22 Chủng vi sinh vật V6 V7 V8 V9 V10 Hoạt tính CMC-aza (D, mm) 21 26 19 22 16 Đối với nấm, tiến hành nuôi cấy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trên môi trường 3 (môi trường 2-dịch thể), sau đó tiến hành xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp CMC-aza. Kết quả được trình bày trong bảng sau: Bảng 2: Khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng nấm. Chủng vi sinh vật N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 Hoạt tính CMC-aza (D, mm) 24 21 18 20 19 20 18 Kết quả thực nghiệm cho thấy, các chủng vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza khá cao. Trong các chủng vi khuẩn chọn chủng V7, còn đối với nấm tôi chọn chủng N1 làm đối tượng nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza. Đây là những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza cao hơn cả. 4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. 4.2.1. ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của chủng nấm N1. Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của N1, tiến hành nuôi lắc chủng N1 trên môi trường 3. Sau đó, chủng N1 được tiến hành xác định hoạt tính CMC-aza, cân sinh k