Đề tài Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao trong sản xuất rượu đặc sản từ bánh men lá ở một số vùng miền núi phía Bắc

khác như các loại rượu và axit hữu cơ thì mối quan hệ này là giống nhau ở tất cả các loài của cùng một giống. Axit acetic và glucose được sử dụng đồng thời. Như là một quy luật, trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn C thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được sử dụng trước. Trong nuôi cấy liên tục nấm men có tốc độ sinh trưởng cùng với tốc độ pha loãng của môi trường thì những hợp chất có nhiều C trong phân tử sẽ được sử dụng sau cùng. Những loài nấm men của cùng một giống không phải bao giờ cũng đồng hóa vật chất như nhau. Có thể nói, các loài khác nhau (dù là một giống) đồng hóa các nguồn dinh dưỡng là khác nhau. Thí dụ: các loài Candida natalensis và C. Parapsilosis và đồng hóa rất tốt galactose, nhưng C. Clausseni lại không đồng hóa được loại đường này. Saccharomyces cerevisiae chỉ bắt đầu sử dụng galactose từ ngày thứ hai sau khi nuôi cấy. Những disacarit (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phảo qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzym tương ứng của nấm men. Nấm men chuyển từ sống kỵ khí sang sống hiếu khí sẽ bị yếu khả năng sử dụng glucose và maltose, nhưng với saccharose hoạt tính sự dụng lại được tăng gấp 2,5 lần. Nấm men sử dụng maltose chỉ khi trong khi môi trường không có mặt glucose và fructose. Maltose được lên men hoàn toàn trong pha sinh trưởng ổn định của nấm men. Các axit hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men. Chúng cũng có thể là nguồn dinh dưỡng C và năng lượng duy nhất. Tất cả các sản phẩm trung gian trong trao đổi của vòng krebs đều là nguồn C dinh dưỡng cho nấm men. Song, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật này trong môi trường chỉ có axit acetic, xitric, sucinic, fumaric, malic hay oxalic đều thấp hơn so với môi trường chứa glucose. Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn C nuôi cấy nấm men rất được quan tâm trong vài thập kỷ gần đây. Đặc biệt là thu sinh khối nấm men từ hydratcacbon làm nguồn protein – vitamin dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi rất có nhiều triển vọng. Cũng có ý kiến e ngại các chế phẩm này còn dư lượng những chất nào đó còn chưa rõ hoặc rất ít không thể xác định được có ảnh hưởng tới đời sống sức khỏe của con người và động vật. Ngày nay người ta đang hoàn thiện thực nghiệm về vai trò của CO2 trong trao đổi chất của nấm men. Thật vậy, giữa tất cả các nguồn C hữu cơ thì khí CO2 là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết với CO2 đều là các sản phẩm cần thiết cho nấm men [15]. 2.5.2 Dinh dưỡng nitơ (N) Nguồn N cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa N của tế bào là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chưa N của tế bào là các axit amin, các nucleotit purin và pyrimidin, protein và một số vitamin. Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các axit amin... thành phần protein trực tiếp từ các hợp chất vô cơ trong khi sử dụng nguồn C là các chất hữu cơ - sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa hydratcacbon trong hô hấp và lên men. Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat. Song, giống Hasenula và giống Pichia lại đồng hóa được chất này. Một số loài thuộc giống Brettanomyses cũng đồng hóa được nitrat. Nguồn N vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ. Đó là amoni sulfat, phosphat rồi đến các muối axetat, lactat, malat và sucxinat. Trong môi trường có muối amoni, đặc biệt là sulfat, thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc axit còn lại sẽ được sử dụng sau hoạc ít sử dụng sẽ làm cho môi trường axit hóa, giảm pH. Trong môi trường lỏng amoniac (NH3) ở dạng NH4+ gần với tiền chất của N hữu cơ và là nguồn N rất dễ cho nấm men sử dụng, chỉ xếp sau các axit amin. Nấm men còn sử dụng được ure và pepton. Trong môi trường lỏng ure sẽ bị urease của nấm men phân ly thành NH4+ và CO2. Để thu sinh khối Saccharomyces được tốt trong môi trường nên có mặt cả nguôn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin (nấm men chỉ sử dụng được axit amin ở dạng tự nhiên), các peptit, các nucleotit... Trong thực tế ngừoi ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc...) làm nguồn N hữu cơ [15]. 2.5.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh nói chung, trong đó có nấm men, phospho (P) được quan tâm trước hết, sau đó là kali (K) và magiê (Mg), lưu huỳnh (S)... Như chúng ta đã biết phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit... Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biêth là trao đổi chất hydrocacbon trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphat. Hợp chất này chuyển thành polyphosphat và sau khi hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. Khi không đủ P trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men thay đổi đáng kể liên quan tới sự phá vỡ nhu cầu và sử dụng hydratcacbon và nito. Nhu cầu sinh lý về P đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 – 13 mg P. Trong phòng thí nghiệm vi sinh người ta thường dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K. Dinh dưỡng lưu huỳnh (S): S là thành phần của một số axit amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số enzyme CoA. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2 SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. Hàm lượng S nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men,nhưng ở nồng độ 1mg/l S đã kìm hãm quá trình này [15] 2.5.4 Dinh dưỡng vitamin: Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzym và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, cải bắp, cà chua, cà rốt, khoai tây... làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường [15]. 2.6 Sự trao đổi chất của nấm men [15]. Trong quá trình hoạt động sống của tế bào nấm men, cũng như các vi sinh vật, cần tiêu hóa các chất dinh dưỡng từ môi trường để xây dựng tế bào mới phục vụ cho sinh trưởng đồng thời sản ra môi trường một số sản phẩm. Tất cả các quá trình này được gọi là trao đổi chất ở tế bào. Sự trao đổi chất được chia làm 3 giai đoạn: Phân cắt các đại phân tử ở ngoài tế bào để có thể qua màng vào nội bào. Phân giải các phân tử bé để tạo ra các chất trao đổi chất trung gian(pyruvat, axetyl, CoA) và năng lượng hữu ích (ATP). Sự phân giải triệt để các chất trao đổi chất trung gian thành CO2 và H2O với sự giải phóng ra nhiều năng lượng ở dạng ATP với hàng loạt các phản ứng oxy hóa khử các chất hữu cơ và vô cơ. Trao đổi chất ở tế bào nấm men cũng tương tự như ở hầu hết giới vi sinh vật. Chức năng cơ bản của trao đổi chất là tạo ra các vật liệu tế bào và nguồn năng lượng phục vụ cho hoạt động sống của tế bào. Trao đổi chất ở trong tế bào nấm men gồm 2 quá trình ngược chiều nhau (có khi xen kẽ với nhau): dị hóa và đồng hóa [15]. 2.6.1 Sự dị hóa Là quá trình phân giải các hợp chất dinh dưỡng có phân tử lớn để có thể qua màng vào nội bào, sau đó tiếp tục phân giải các chất có phân tử nhỏ thành các hợp chất trung gian, và thu nhận năng lượng. Tiếp tục phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ (kể cả các sản phẩm trung gian) thành sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O [15]. 2.6.2 Sự đồng hóa Là sử dụng các hợp chất trao đổi trung gian do quá trình dị hóa tạo thành hoặc có sẵn trong môi trường để thực hiện các quá trình sinh tổng hợp ra các chất cấu trúc tế bào, như các hợp chất cao phân tử polysaccarit, protein, axit nucleic, lipit... tạo ra tế bào mới từ các tiền chất đơn giản (axit amin, các bazo purin và pirimidin, axit hữu cơ, phosphat- đường). Sự tổng hợp gắn liền với nhu cầu về năng lượng tự do được giải phóng do khử phospho của ATP. Quá trình tổng hợp như vậy được gọi là trao đổi chất kiến tạo hay là cấu trúc xây dựng [15]. 2.7 Phân loại nấm men. J.Lodder (1970) đã xác định có 349 loài nấm men, thuộc 39 chi khác nhau. J.A.Barnett, R.W.Payne và D.Yarrow (1983) xác định có 483 loài nấm men, thuộc 66 chi khác nhau: Aciculoconidium: 1 loài; Ambrosiozyma: 3 loài; Arthrooascus: 1 loài; Botryoascus: 1 loài; Brettanomyces: 7 loài; Bullera: 6 loài; Candida: 155 loài; Citeromyces: 1 loài; Clavispora: 1 loài; Cryptococcus: 24 loài; Cyniclomyces: 1 loài; Debaryomyces: 11 loài; Debaryozyma: 1 loài; Dekkera: 2 loài; Eeniella: 1 loài; Endomyces: 1 loài; Endomycopsella: 2 loài; Filobasidiella: 1 loài; Filobasidium: 3 loài; Geotrichum: 10 loài; Guilliermindella: 1 loài; Hanseniaspora: 7 loài; Hansenula: 27 loài; Hormoascus: 1 loài; Hyphopichia: 1 loài; Issatchenkia: 4 loài; Kloeckera: 1 loài; Kluyveromyces: 11 loài; Leucosporidium: 6 loài; Lipomyces: 5 loài; Lodderomyces: 1 loài; Malassezia: 2 loài; Mastigomyces: 1 loài; Metschnikowia: 6 loài; Nadsonia: 3 loài; Nematospora: 1 loài; Oosporidium: 1 loài; Pachsolen: 1 loài; Pachytichospora: 1 loài; Phaffia: 1 loài; Pichia: 62 loài; Rhodosporidium: 9 loài; Rhodotorula: 18 loài; Saccharomyces: 7 loài; Saccharomycodes: 2 loài; Saccharomycopsis: 2 loài; Sarcinosporon: 1 loài; Shizoblastosporion: 1 loài; Shizosaccharomyces: 4 loài; Schwanniomyces: 1 loài; Sporidiobolus: 5 loài; Sporobolomyces: 6 loài; Sporopachydermia: 3 loài; Stephansascus: 1 loài; Sterigmatomyces: 6 loài; Sterigmatosporidium: 1 loài; Sympodiomces: 1 loài; Torulaspora: 3 loài; Trichosporo: 8 loài; Trigonopsis: 1 loài; Wickerhamia: 1 loài; Wickerhamiella: 1 loài; Williopsis: 5 loài; Wingea: 1 loài; Yarrowia: 1 loài; Zygosaccharomyces: 8 loài [6]. Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: Công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, và cao nấm men, lipit nấm men, các enzim như amilaza, invertaza, lactaza, unicaza, poligalacturonaza, sản xuất ergosterol, axit ribonucleic, riboflavin, (vitamin B2), các axit amin như lizin, xixtein, metionin. Loài Saccharomyces cerecisiae hiện đang được sử dụng như một công cụ đắc lực để mang các ADN tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của kỹ thuật di truyền. Tuy nhiên bên cạnh các nấm men có ích cũng không ít các nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc các thực phẩm chế biến. Có khoảng 13 – 15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người và động vật chăn nuôi. Đáng chú ý nhát là các loài Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Trichosporon cutaneum, T.capitatum...[6]. 2.8 Vai trò của nấm men trong đời sống [23] Nấm men là nhóm vi sinh vật được con người sử dụng sớm nhất trong chế biến thực phẩm, hàng nghìn năm trước công nguyên con người đã biết sử dụng quá trình lên men để sản xuất rượu, làm nở bột mì. Ngày nay rất nhiều nhà máy với qui mô lớn đã sử dụng vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng để sản xuất ra các sản phẩm quan trong như glyxerin, bia, rượu nho, các sản phẩm rượu chưng cất như rum, swuytky [ 27]. Nấm men cũng đã được sử dụng làm vật chủ trong công nghệ cấy chuyển gen để tạo ra những sản phẩm rất quí giá nhờ kỹ nghệ chuyển gen và tái tổ hợp [25], [29]. Có thể kể đến một số kết quả cụ thể sau: Năm 1985 hãng Suntory (Mỹ) đã tạo được giống nấm men mới bằng công nghệ gen có thể giết chết các vi khuẩn xuất hiện trong bia. Kimura. A (Nhật) năm 1980 đã tạo ra được các chủng nấm men có khả năng sản xuất Insulin và Interferon. Tháng 3-1981 các thành viên bộ môn di truyền học, đại học Oa – sinh – ton đã sử dụng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được tái tổ hợp để sản xuất Interferon đạt hiệu suất cao...[23]. 2.9 Ứng dụng của nấm men Hơn 6000 năm trước đây người Ai Cập đã biết làm tăng hương vị và độ nở của bột bánh mì bằng cách để bột mì đã nhào vài ngày trước khi đem nướng. Thậm chí trước đó nữa người Summarian đã khắc lên bia đá phương pháp lên men để làm cồn. Ngày nay chúng ta đều biết cả hai việc này dựa trên hoạt động sống của nấm men Saccharomyces cerevisiae và một vài loài gần gũi. Một khoa học hiện đại bắt nguồn từ kiến thức cổ điển đó đã chiếm vị trí đặc biệt trong cuộc sống loài người [8]. Ngoài tác dụng làm nở bột mì, làm cồn, nâm men từ lâu đã được dùng để sản xuất các loại đồ uống rất đa dạng như bia, vang, sâm banh, nước ngọt có ga; dùng để sản xuất sinh khối, giàu đạm và vitamin, nhiều dược phẩm quý đắt tiền, các chất sinh học dùng trong phòng thí nghiệm sinh học và y học hiện đại [8]. Theo tài liệu quốc tế năm 1984, các sản phẩm từ nấm men chiếm gần 70% tổng số các sản phẩm công nghệ sinh học toàn thế giới [10]. Trong những năm tới, số lượng và chủng loại các sản phẩm từ nấm men còn tăng lên nhanh chóng do việc sử dụng kỹ thuật di truyền đưa những gen xác định từ động vật, thực vật vào nấm men và dùng nấm men như những ”nhà máy tí hon” nhưng năng suất rất cao, để sản xuất hàng loạt chất mà trước đây chỉ tách chiết được với số lượng ít ỏi và rất khó khăn từ các bộ phận thực vật, động vật như các enzyme, hoocmon ... Ngoài ra chúng ta còn thấy một ứng dụng rất quan trọng của nấm men đó là sử dụng trong chăn nuôi. Bởi vì trong tế bào nấm men chứa đầy đủ các chất cần thiết cho sự sống với hàm lượng cao. So với khối lượng khô, protein chiếm 48- 52%, hydratcacbon 13- 16%, lipit 2- 3%, các chất trích ly và vitamin 23- 40%. Việc sản xuất nấm men gia súc được thực hiện đầu tiên ở Đức vào những năm 80 của thế kỷ trước và hiện nay đã trở thành một ngành công nghiệp phổ biến ở hầu hết các nước có nền chăn nuôi phát triển. Ngoài việc thu sinh khối nấm men ở các nhà máy bia, nhà máy rượu, ngay từ những năm 70 người ta đã xây dựng các nhà máy chuyên sản xuât nấm men gia súc đi từ các nguồn thức ăn là rỉ đường, dịch thủy phân xenlulose từ nước thải các nhà máy giấy, phế phẩm của nhà máy đồ hộp quả, nhà máy sản xuất phomat,... [26]. Những năm đầu thập kỷ trước, người ta đặc biệt chú ý đến khả năng sản xuất nấm men đi từ metan [19] và nhất là từ parafin của dầu mỏ [16]. Một số nghiên cứu đề cập tới việc sản xuất sinh khối nấm men trực tiếp từ nguồn thức ăn là tinh bột [7],[19]. Trong các nguồn protein sản xuất bằng công nghệ sinh tổng hợp thì nấm men là loại được nghiên cứu sớm hơn cả. Nấm men gia súc được sản xuất đầu tiên ở Đức là Saccharomyces cerevisiae và sau đó là loài Torula utilis. Từ lâu Liên Xô đã sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc trên cơ sở phụ phẩm nông nghiệp và phế liệu công nghiệp. Ở Mỹ cũng vậy, sản phẩm nấm men gia súc từ bã rượu đã được tiến hành từ những năm 40. Ở nước ta, vấn đề nghiên cứu và sử dụng nấm men trong chăn nuôi cũng đã tiến hành từ vài chục năm trước đây. Năm 1961, một số nông trường và hợp tác xã dùng men bia [19] S.cerevisiae có khi thêm Bac.subtilis để ủ thức ăn. Trong thời kỳ 1963- 1967 [19] Viện chăn nuôi đã tiến hành nghiên cứu men bia và xây dựng quy trình phổ biến cho nhiều hợp tác xã. Năm 1964 trường Đại học Nông nghiệp đã đúc kết kinh nghiệm quần chúng về men rượu và làm bánh men thuốc bắc đem ứng dụng ở các hợp tác xã. Năm 1965 trường Đại học Tổng hợp đã phân lập, nuôi cấy và hướng dẫn làm bánh men thuốc bắc đưa áp dụng và có kết quả ở nhiều địa phương [2] và trường Đại học Tổng hợp tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men và điều kiện sản xuất sinh khối để đưa ứng dụng [4]. 2.10 Các loại lá trong bánh men Ngoài gạo các loại lá (các vị thuốc nam) cũng là nguyên liệu chính không thể thiếu được cho vào bánh men cổ truyền. Với kinh nghiệm gia truyền, ở từng địa phương khác nhau thậm chí ở từng gia đình nhất định, số vị thuốc trong một bài thuốc làm bánh men là khác nhau. Với người Thái: Những thứ quả lá chủ yếu gồm có: bơ hinh ho, khi mắc cái, củ riềng, lá trầu không, quả ớt... Với người Tây Nguyên: Men rượu được người dân tộc chế từ vỏ cây hiam lấy trong rừng trộn với bột ớt, bột gừng, riềng, bột gạo, một số thứ lá và rễ cây khác. Các loại lá cho vào bánh men của các dân tộc là khác nhau, song vẫn có một số vị chung như: lá quế, lá mít, lá nhân trần, giềng, gừng, ớt. Theo công dụng thành phần hóa học của các vị thuốc có thể chia làm 3 nhóm: Nhóm chất có giá trị dinh dưỡng đối với các vi sinh vật gồm protein, gluxit (tinh bột, các chất đường), lipit, vitamin,chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng... Nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng bao gồm: Tinh dầu, chất nhựa, alcaloit và glucozit... Nhóm chất vô hại gồm chất xơ, chất màu... Đồng thời cũng chính các vị thuốc nam này, từ lâu nhân dân ta đã dùng để chữa bệnh. Trong đó có các bệnh viễm nhiễm đường ruột, đường hô hấp, tiết niệu, mụn nhọt...[13]. Tác dụng chữa bệnh của các vị thuốc nhờ vào tính kháng khuẩn của chúng. Mỗi vị thuốc có tính kháng khuẩn mạnh yếu khác nhau và khả năng kháng đối với các vi khuẩn cũng rất đa dạng. Các vị thuốc đều có tác dụng đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh. Tối đa ví dụ như tinh dầu quế, tinh dầu húng chanh có tác dụng với 11 loại vi khuẩn ở mức độ chúng bị tiêu diệt hoàn toàn (hoàn toàn không phát triển được). Dựa trên tác dụng của các vị thuốc mà nhân dân ta đã phát huy tác dụng tối ưu của môi trường đặc hiệu tự nhiên. Qua nhiều thế hệ từ năm này qua năm khác tạo ra những thích ứng tiến hóa cho hệ sinh vật có lợi cho quá trình sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột. Còn các vi sinh vật tạp (không có lợi cho quá trình sản xuất rượu) không phát triển được hoặc phát triển rất yếu, nhờ tính kháng khuẩn của các vi thuốc trong môi trường [8]. 2.11 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Các yếu tố ảnh hưởng ở đây là nhiệt độ, oxy hòa tan hay độ hiếu khí, pH môi trường, hàm lượng sản phẩm chính tạo ra, thành phần môi trường và các điều kiện khác của môi trường nuôi cấy 2.11.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ [15] Đối với sinh trưởng của đa số nấm men nhiệt độ tối thích vào khoảng: 28- 32oC Đối với lên men rượu etylic để sản xuất rượu trắng (cồn thực phẩm, rượu vodka, các loại rượu trắng truyền thống) thì nhiệt độ tối thích là: 30- 35 oC, với lên men rượu vang là 20-25 oC, lên men bia là 6-10 oC hoặc 8-12 oC... Nhiệt độ lên men cao ở khoảng 30-35 sự bắt đầu tích tụ rượu etylic càng sớm, tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm, nhưng không lên men được hết đường(đường sót lại với một lượng khá lớn) thì điều này có thể là nguy hiểm vì đường sót sẽ bị lên men bởi vi khuẩn lactic để tạo thành axit lactic, làm chua dịch lên men, làm ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm, kể cả rượu trắng, bia và rượu vang. Lên men ở nhiệt độ cao cũng làm cho các vi khuẩn tạp nhiễm phát triển nhanh làm biến đổi xấu về chất lượng sản phẩm. 2.11.2 Ảnh hưởng của PH môi trường [15] pH của môi trường lên men hay môi trường vi sinh vật nói chung với mỗi chủng hay mỗi nhóm vi sinh vật đều có khoảng pH tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển. Đối với nhóm nấm men, với các giống men rượu Saccharomyces cũng có những pH tối thích khác nhau Với men rượu và men bia thuộc giống Saccharomyces pH ban đầu thích hợp cho lên men là khoảng 5.5. trong quá trình lên men pH giảm xuống 4.4- 4.5 rồi lại tăng dần lên. Nguyên nhân giảm pH là do sự tạo thành CO2 và các axit hữu cơ trong quá trình lên men Với men rượu vang có thể lên men ở pH là : 2.8- 3.8, so với men rượu thì men rượu vang chịu được độ axit cao hơn. Nâng cao độ axit của môi trường sẽ làm cho nấm men thay đổi hình dáng: tế bào nhỏ hơn với dạng hình tròn nhiều hơn, trong tế bào chất tích tụ các chất béo. 2.11.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch đường Nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men Nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men, mặt khác sẽ tốn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.[21] Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16-18% tùy theo mức độ thuần khiết, tương đương 13-15% đường, để sau khi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8.5 đến 9.5% V. 2.11.4 Ảnh hưởng của oxy hòa tan- độ hiếu khí [15] Quá trình lên men rượu thường được thực hiện trong điều kiện kỵ khí nhưng khi nấm men mới được nhân giống thì nhất thiết phải có một lượng oxy nào đó để nấm men sử dụng. Trong thực tế sản xuất đây là thời điểm duy nhất trong quá trình lên men rượu oxy có ích cho nấm men. Thời gian đầu nấm men sinh trưởng mạnh nhờ có lượng oxy của không khí hòa tan vào dịch lên men. Nếu lượng giống tiếp vào lên men ít (còn xa mới tới lượng cần để cho lên men) người ta phải thổi khí sạch để cho giống nấm men sinh trưởng. Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp. Trong môi trường có khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn. Do đó tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn. Bình thường oxy hòa tan tối đa trong nước đến 9mg/l. Nồng độ giảm xuống còn 1mg/l nấm men sẽ ngừng sinh sản 2.11.5 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới quá trình lên men Nấm men sử dụng nitơ để tổng hợp tế bào mới và các enzyme protease trong quá trình sinh trưởng và sinh sản. Trong quá trình lên men, việc cung cấp đủ lượng nitơ mà nấm men có thể đồng hóa được là rất cần thiết. Nó ảnh hưởng tới tốc độ chuyển hóa đường thành rượu và khả năng chịu cồn của nấm men. Nếu không đủ nguồn nitơ trong dịch lên men, có thể dẫn tới sinh trưởng của nấm men chậm, kéo dài thời gian lên men hoặc lên men không triệt để, giảm năng suất. Thêm vào đó, số lượng các sản phẩm chuyển hóa có thể làm giảm chất lượng do acid amin và các peptide tạo thành H2S, các este không bình thường và thay đổi sự tạo thành diacetyl. Trong công nghiệp sản xuất nước uống có cồn, có thể khắc phục sự thiếu hụt nitơ trong môi trường lên men bằng cách thay đổi các điều kiện lên men, thêm enzyme protease để tăng quá trình thủy phân protein trong nguyên liệu hoặc bổ sung một lượng lớn nitơ để nấm men sử dụng [11], [21], [24]. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu vật: Bánh men ở một số vùng núi phía bắc Men lá: Thôn Bản Chằng - xã Yên cử - Huyện Chợ Mới – Bắc Kạn Men lá: Thôn Thái Lạo – Xã Yên Cử - huyện Chợ Mới – tỉnh Bắc Kạn Men lá: Bắc Kạn Men lá: Cao Bằng Men lá: Lạng Sơn 3.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 3.2.1 Hóa chất: Các hóa chất được sử dụng cho thí nghiệm làm đề tài thực tập tốt nghiệp: Đường glucoza xuất xứ Trung Quốc Pepton xuất xứ Trung Quốc KH2PO4, Trung Quốc MgSO4.7H2O, Trung Quốc Agar – agar, Trung Quốc 3.2.2 Thiết bị: Tủ ấm (Nhật Bản) : Nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp Tủ cấy (Nhật Bản) vô khuẩn có đèn UV Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản): Quan sát tế bào vi sinh vật Tủ sấy (Nhật Bản) : dùng để sấy khô, khử trùng dụng cụ chịu được nhiệt nóng khô Nồi thanh trùng (HIRAYAMA HV- Nhật Bản): Hấp khử trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm. Cân điện tử SARORIUS ( Nhật Bản): Cân hóa chất. Máy đo pH METTLER TOLEDO, Thụy Sĩ Máy đo quang Model 80- 2088- Anh Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản) Pipetman, lò vi sóng, đèn cồn,... 3.2.3 Môi trường nuối cấy: 3.2.3.1 Môi trường nuôi cấy nấm men ( môi trường Hansen) STT Tên hóa chất Hàm lượng (g/l) 1 Glucoza 20g/l 2 Pepton 10g/l 3 KH2 PO4 3g/l 4 MgSO4.7H2O 2,5g/l 5 Agar - agar 20g/l 6 Nước cất 1(l) Thanh trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút Đây là môi trường giữ giống và nhân giống nấm men 3.2.3.2 Môi trường thử khả năng lên men của nấm men Sử dụng dịch chiết Malt để thử khả năng lên men của nấm men 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp pha loãng [9] Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Tiến hành: cân 1g bánh men, sau đó cho vào 9ml nước cất vô trùng khi đó ta được nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết. 3.3.2 phương pháp phân lập và thuần khiết [14] Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. Tiến hành: Nghiền bánh men Pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2,... 10-10 Trải đều 0.1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2,... 10-10 lên bề mặt môi trường thạch Hansen trong hộp petri. Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc sau 24 giờ đến 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ cấy trong ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng để tăng sinh. Nuôi trong tủ ấm 300C và theo dõi sự phát triển của nấm men sau 24 giờ. Pha loãng dịch nấm men đến các nồng độ 10-5, 10-6. Trải đều 0.1 ml dịch pha loãng trên môi trường thạch Hansen trong hộp petri, nuôi cấy trong tủ ấm 300C sau 24 giờ đến 48 giờ quan sát sự đồng nhất của khuẩn lạc trên mặt thạch. Từ các khuẩn lạc đã chọn, dùng que cấy tách chúng ra khỏi môi trường thạch trên hộp petri và nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng Hansen ở 300C, sau 48 giờ chuyển các ống thạch nghiêng này