Đề tài Phân tách sắc tố cà chua chín, cà rốt và đu đủ chín bằng sắc kí bản mỏng

hiệu quả trong chống ung thư phổi, dạ dày, trực tràng. − Trong quả cà chua màu ñỏ licopen thường ñược tập trung ở vỏ, khi nấu chín cà chua mới giải phóng ñược licopen. Vì vậy khi ăn cà chua chín không nên ăn sống mà phải nấu chín và ăn cả vỏ. − Ngoài ra nó là carotenoit duy nhất có khả năng ngừa ñược chứng nhồi máu cơ tim và bảo vệ gan khỏi bị tổn thương. Licopen là một carotenoit cơ thể con người không thể tự tổng hợp ñược mà phải lấy từ thức ăn. 1.5. Sơ lược về sắc kí 1.5.1. Sơ lược về lịch sử phát triển sắc kí [3] − Năm 1903 nhà khoa học Nga Mikhail TsVet ñã dùng cột nhôm oxit tách thành công các picmen của lá cây xanh thành các vùng màu riêng biệt. Ông ñã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp thụ khác nhau của sắc tố và ñặt tên phương pháp này là phương pháp sắc kí vì ñã tách ñược những chất có màu. Tuy nhiên phát minh của TsVet gần như lãng quên trong một thời gian dài. Mãi ñến năm 1931 sau khi Vinterstin và PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 14 Lederer dùng phương pháp của TsVet tách caroten thô thành β-caroten và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương diện ñiều chế, phương pháp sắc kí mới bắt ñầu ñược chú ý ñúng mức và phát triển nhanh chóng. − Năm 1938, Izmailov và Shraiber ñặt nền móng ñầu tiên cho sắc kí lớp mỏng và sau ñó những công trình của Stahl ñã làm cho sắc kí lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi. − Năm 1941 sắc kí phân bố ra ñời khi Martin và Synge ñề xuất tách không phải theo ái lực của các cấu tử ñối với chất hấp thụ mà do sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn. Các tác giả trên ñã phát triển một dạng mới của sắc kí phân bố: sắc kí giấy.Vào những năm 1941 – 1942 Martin ñã làm một bước ngoặc lớn trong sắc kí do dùng sắc kí giấy tách thành công các ancaloit chiết ñược từ các cây thuốc. − Năm 1952 Martin công bố công trình ñầu tiên về sắc kí khi dựa trên sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha ñộng là chất khí. Chỉ trong vài ba chục năm, sắc kí khí ñã ñạt ñược nhiều thành tựu tuyệt vời và hiện nay là một trong những phương pháp hiệu nghiệm nhất về phân tích hỗn hợp các chất ñặc biệt là các chất hữu cơ. 1.5.2. Sắc kí bản mỏng [2].[3],[4]. − Sắc kí bản mỏng hay còn gọi là sắc kí phẳng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng. Trong ñó pha ñộng là chất lỏng ñược ñi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này ñược tráng thành một lớp mỏng, ñều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Do chất hấp thụ ñược tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này ñược gọi là phương pháp sắc kí lớp mỏng (hay sắc kí bản mỏng) − Trước ñây sắc kí bản mỏng chủ yếu dùng trong phân tích ñịnh tính, nhưng từ năm 1966 ñã áp dụng sang phân tích ñịnh lượng do những tiến bộ của kĩ thuật làm tăng tính lặp lại và ñộ chính xác. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 15 − Trong thời gian gần ñây, nhờ sử dụng tổ hợp sắc kí bản mỏng với các phương pháp phân tích có ñộ nhạy cao như cực phổ, ñộng học xúc tác, huỳnh quang… sắc kí bản mỏng ñược phát triển thêm một bước. 1.5.2.1. Nguyên tắc [1],[4]. − Bản mỏng ñược chuẩn bị sẵn là loại bản có thể tự tráng hoặc mua loại có sẵn trên thị trường, sau ñó chấm mẫu phân tích (mẫu ñã ñược hòa tan trong một dung môi dễ bay hơi sau ñó dùng vi quản ñể chấm) lên bản mỏng, chấm thành một vết nhỏ gọn, sấy nhẹ ñể ñuổi phần dung môi hòa tan mẫu, khi ñó mẫu chất chỉ còn lại bột khô trên tấm lớp mỏng. ðặt tấm bản mỏng theo chiều thẳng ñứng trong bình có chứa sẵn dung môi phù hợp. Do tác dụng của lực mao quản dung môi thấm theo bản mỏng qua ñiểm xuất phát. Sau ñó các vết sẽ ñược xác ñịnh bằng phương pháp vật lý (nhìn bằng mắt, soi dưới ñèn tử ngoại…) bằng phương pháp hóa học (phun lên tấm bảng các loại dung môi thuốc thử). − Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn có giá trị Rf không ñổi trong một dung môi xác ñịnh. − Các yếu tố ảnh hưởng ñến Rf + Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ + Bề dày của lớp mỏng + Chất lượng và ñộ tinh khiết của pha ñộng + ðộ bão hòa của dung môi trong bình sắc kí + Lượng mẫu ñưa lên bản mỏng 1.5.2.2. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký bản mỏng [2] Trong sắc kí bản mỏng thông thường người ta dùng các chất hấp thụ sau: silicagen, nhôm oxit, xenlulo, tinh bột, nhựa trao ñổi ion…ngoài ra còn dùng các chất hấp thụ biến tính khác. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 16 Bảng 1.1: Các chất hấp thụ dùng trong sắc kí lớp mỏng (SKLM) (sắp xếp theo Stahl ) Chất hấp thụ ðộ axit Hoạt năng Cơ chế Công dụng Silicagen Axit Có Hấp thụ và phân bố Cho tất cả các hợp chất Oxit nhôm Kiềm Có Phân bố Steorid Magie photphat Yếu Hấp thụ Carotenoit, tocopherol Caxihydroxit Yếu Hấp thụ Tocopherol Canxi sunfat Kiềm Yếu Hấp thụ Tocopherol Fe(OH)3 Có Hấp thụ Chất phân cực Than Có Hấp thụ Chất không phân cực 1.5.2.3. Dung môi khai triển: Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi và thuốc thử khác nhau. Bảng1.2: Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất tự nhiên Hợp chất Chất hấp thụ Hệ dung môi Thuốc thử hiện màu Ankaloic SiO2G 3 3 3 3 (9 :1) (20 : 20 :3:1) (20 : 20 :1) min (7 : 2 :1) CHCl MeOH CHCl axeton MeOH NH CHCl ETOAC MeOH Benzen ETOAC Dietyla − − − − − − − − Hơi I2 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 17 Saponin SiO2G 2 4 3 2 2 3 Butanol (4 :1: 5) Butanol (7 : 2 :5) (61:32 : 7) (100 :17 :13) (9 :1) n ACOH H O n EtOH NH OH CHCl MeOH H O EtOAC MeOH H O CHCl MeOH Genin − − − − − − − − − − − Vanillin | H3PO4 SbCl3 | CHCl3 H2SO4 Caroten SiO2G Ete dầu hỏa – toluen – axeton (45: 1: 5) Hơi I2 Tinh dầu SiO2G (95 :5) (95 : 5) Benzen EtOAC Benzen MeOH − − 2 2 4 3 4 ,I H SO H PO Tanin SiO2G 2 (100 :17 :13) (4 :3:1) EtOAC MeOH H O Toluen EtOAC MeOH − − − − FeCl3 Flavonit SiO2G Toluen – Etyl fomiat – axit formol (5:4:1) MeOH 10%(H2O) 1.5.3. Sắc kí cột [2],[3],[4]. − Sắc kí cột là một phương pháp hiện ñại, tinh vi ñể tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp của chúng. Nếu lựa chọn ñúng các ñiều kiện người ta có thể tách hầu hết các chất bất kì một hỗn hợp nào. Nhưng phương pháp mất nhiều thời gian nên chỉ sử dụng khi tách các chất trong hỗn hợp mà các phương pháp khác không làm ñược − Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng tách ra gồm: + Lựa chọn chất hấp thụ + Sự lựa chọn dung môi giải li PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 18 + Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp thụ, lượng mẫu ñược dùng + Vận tốc giải li − Trong sắc kí cột sự tách xảy ra ở ranh giới rắn – lỏng, trong ñó pha ñộng là chất lỏng, pha tĩnh là các chất rắn ở trạng thái xốp, mịn. Thông thường các hợp chất phân cực bị hấp phụ mạnh hơn các chất không phân cực bởi các chất hấp phụ phân cực. Sự hấp phụ các chất phân cực trong môi trường không phân cực mạnh hơn trong môi trường phân cực do sự cạnh tranh giữa chất tan và các phân tử của dung môi. − Lực hấp thụ bao gồm các loại sau ñây: + Lực Vande Van + Lực cảm ứng + Hấp phụ hóa học + Liên kết hiñro 1.5.3.1. Nguyên tắc [1] − Cột ñược rửa sạch sấy khô. Cột là một ống thủy tinh dưới ñáy có một robinet khóa, cột ñược bắt vào giá ở vị trí thẳng ñứng dưới có một bình hứng, dưới ñáy cột ñược lót một lớp bông gòn dày 2 – 3 mm. Sau ñó tiến hành nhồi cột, có hai cách nhồi, nhồi sệt hoặc nhồi khô. Khi ñã cho chất hấp phụ hết vào cột theo một trong hai phương pháp trên tiếp tục cho dung môi chảy ngang qua chất hấp phụ liên tục trong một thời gian ñể giúp cho việc nạp cột ñược chặt chẽ, trong quá trình này không ñược ñể cột khô. ðể ổn ñịnh sau khoảng 5 – 10 giờ mới sử dụng. − Sau khi cột ñã ổn ñịnh cho mẫu chất cần phân tích vào cột, nếu mẫu chất là chất lỏng cần làm bay hơi ñến khô rồi hòa tan trở lại trong dung môi, nếu mẫu là chất rắn hòa tan mẫu vào dung môi lượng dung môi là tối thiểu. Mở khóa cột hạ mực dung môi ñến sát mực chất hấp phụ ñang có trong cột, dùng một ống nhỏ giọt cho mẫu vào ñầu PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 19 cột mở khóa cho dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp thụ tiến hành như vậy ñến khi cho hết mẫu vào cột. Tiến hành thêm dung môi vào rửa cột sau khi cho một lớp bông gòn ñặt nhẹ lên mặt thoáng của chất hấp phụ. Tiến hành quá trình giải li. 1.5.3.2. Các chất hấp phụ và dung môi trong sắc kí cột[2] Bảng 1.3: Các dung môi và chất hấp phụ dùng trong sắc kí cột Hợp chất phân tích Dung môi Chất hấp phụ Gluxit Nước, ancol Isopropylic, ancol butylic, ñioxan, ete dầu hỏa, benzen, clorofom Than hoạt tính, nhôm oxit, silicagen Vitamin Ete dầu hỏa, benzen, nước… Nhôm oxit, Ca(OH)2, MgO Tecpen Cacbon tetraclorua, ete dầu hỏa,n-hexan, benzen, ete etylic, axeton, ancol metylic, etyl axetat, clorofom Nhôm oxit Ancaloit Nước, benzen, clorofom.. Nhôm oxit, silicagen PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 20 CHƯƠNG 2: TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 2.1. Thu mẫu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín: Cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ñược thu mua tại chợ Tân Tịch vào lúc sáng sớm. Cà chua lựa loại quả chín ñỏ, ñặc ruột, ít hạt. Cà rốt lựa củ căng bóng, tươi màu da cam. ðu ñủ loại quả chín to trái. 2.2. Tiến hành tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín 2.2.1. Hóa chất và dụng cụ: Hóa chất Dụng cụ − Etanol 960 − Tinh thể iot − Toluen − Axeton − Ete dầu hỏa − Al2O3 − Phễu thủy tinh − Ống ñong; Cốc; Ống nghiệm − Phễu chiết; Giấy lọc; bông gòn − Bình hút ẩm; Bình lọc chân không − Mao quản ñường kính 1,5-1,6 mm − Lọ penicilin − Cột sắc kí kích thước 50cm, ñường kính15cm 2.2.2. Tóm tắt quá trình tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín: Thời gian Công việc 28/10 Thu mẫu và xử lý mẫu cà chua chín bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể bay hơi 12 giờ 29/10 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu cà chua thu ñược 30/10 Thu mẫu và xử lý mẫu cà rốt bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể bay hơi 12 giờ 31/10 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu cà rốt thu ñược 1/11 Thu mẫu và xử lý mẫu ñu ñủ chín bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể bay hơi 12 giờ 3/11 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu ñu ñủ chín thu ñược PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 21 Kết quả chạy sắc kí bản mỏng thu ñược chúng tôi thấy rằng vết không tròn, vết còn có ñuôi chúng tôi kết luận rằng dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chưa tinh khiết vì vậy chúng tôi tiến hành tách licopen và β-caroten bằng sắc kí cột và kiểm tra lại bằng sắc kí bản mỏng Thời gian Công việc 4/11 Nhồi cột 5-8/11 Cho ete dầu hỏa chạy qua cột làm cho cột mịn, ñể ổn ñịnh trước 10 giờ 10/11 Chuẩn bị dịch cà chua chín lần 1 11-13/11 Nạp mẫu cà chua chín, thu các phân ñoạn. Rửa cột và cho bay hơi dung môi các phân ñoạn 12 giờ 14/11 Chạy bản mỏng các phân ñoạn 15-19/11 Tiến hành như trên ñối với mẫu cà chua lần 2 21/11 Chuẩn bị dịch cà rốt lần 1 22-25/11 Nạp mẫu cà rốt, thu các phân ñoạn. Rửa cột và cho bay hơi dung môi các phân ñoạn 12 giờ 26/11 Chạy bản mỏng các phân ñoạn của dịch cà rốt thu ñược 27-3/12 Tiến hành như trên ñối với mẫu cà rốt lần 2 4/12 Chuẩn bị dịch ñu ñủ chín lần 1 5-8/12 Nạp mẫu ñu ñủ chín, thu các phân ñoạn. Rửa cột và cho bay hơi dung môi các phân ñoạn 12 giờ 9/12 Chạy bản mỏng các phân ñoạn của dịch ñu ñủ chín thu ñược 2-6/3 Tiến hành như trên ñối với mẫu ñu ñủ chín lần 2 2.2.3. Chuẩn bị dịch các chất màu [4] - Chuẩn bị dịch cà chua chín: Quả cà chua chín bổ ra chỉ bỏ hạt, nghiền nhỏ thu ñược dịch cà chua. Lấy 30 g dịch cà chua thêm 45 ml etanol 960 khuấy mạnh trong 4-5 phút. Lọc lấy bã cà chua trên giấy lọc cho vào cốc thêm 30 ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 22 ete dầu hỏa. Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không. Chuyển dịch lọc sang cốc cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ ñược chất màu caroten của cà chua chín -Chuẩn bị dịch cà rốt: Cà rốt bỏ vỏ, xay nhuyễn thu ñược dịch cà rốt. Lấy 30 g dịch cà rốt thêm 45 ml etanol 960 khuấy mạnh trong 4-5 phút. Lọc lấy bã cà rốt trên giấy lọc cho vào cốc thêm 30 ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào ete dầu hỏa. Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không. Chuyển dịch lọc sang cốc cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ ñược chất màu caroten của cà rốt - Chuẩn bị dịch ñu ñủ chín: ðu ñủ chín bổ ra bỏ vỏ và hạt, nghiền nhỏ thu ñược dịch ñu ñủ chín. Lấy 30 g dịch ñu ñủ chín thêm 45 ml etanol 960 khuấy mạnh trong 4-5 phút. Lọc lấy bã ñu ñủ chín trên giấy lọc cho vào cốc thêm 30 ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào ete dầu hỏa. Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không. Chuyển dịch lọc sang cốc cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ ñược chất màu caroten của ñu ñủ chín 2.2.4. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chưa tinh khiết [1],[4]. 2.2.4.1. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của cà chua chín. -Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng mua trên thị trường ñã ñược tráng silicagel có kích thước 20x20 cm. Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 2 x 8 cm ñể phân tích nhanh. Dùng bút chì vót nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm mức tiền tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 1cm. - Lựa chọn dung môi: Mẫu cần phân tách ñã biết có thành phần chủ yếu là licopen và β-caroten.Theo [4] thì chúng tôi chọn hệ dung môi là ete dầu hỏa: toluen: axeton và chọn thêm một số hệ dung môi ñược trình bày ở bảng 2.1 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 23 Bảng 2.1 : Một số hệ dung môi chạy bản mỏng với dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín (dịch chưa tinh khiết) Dung môi hòa tan mẫu Hệ dung môi chạy sắc kí bản mỏng Tỉ lệ Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:1:5 Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:5:1 Toluen: axeton 45:5 Ete dầu hỏa: : axeton 45:5 Ete dầu hỏa Ete dầu hỏa : Toluen 45:5 -Chuẩn bị mao quản: Mao quản có chiều dài 7cm, ñường kính 1,5-1,6 mm, mao quản dùng ñể hút dung dịch chấm lên bản mỏng yêu cầu mao quản phải có ñường kính bé hơn, với kích thứơc này quá lớn ñể lấy mẫu cà chua chạy bản mỏng các vết mẫu sẽ rất to làm cho kết quả không chính xác. ðể có ñầu mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách: Hai tay cầm hai ñầu ống, ñặt phần giữa ống lên ngọn lửa ñèn cồn, vừa hơ vừa xoay tròn ñều ống ñến khi ñoạn giữa mao quản trở nên mềm dẻo, ñưa ống ra khỏi ngọn lửa, dùng hai tay kéo hai ñầu ống dang ra hai phía. Khi ñó phần ống mao quản ở giữa trở nên nhỏ và hẹp hơn. Ống mao quản cứng lại, bẻ ống ra làm ñôi ở chỗ ñã ñược kéo nhỏ. - ðưa mẫu lên bản mỏng: Hòa tan hết lượng dịch chất màu của cà chua bằng 1 ml ete dầu hỏa. Dùng mao quản ñã vuốt nhọn nhúng nhẹ phần ñầu nhọn vào dung dịch mẫu cà chua chín, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch cà chua chín vào mao quản, khi dung dịch lên khoảng 6mm thì lấy ra. Cẩn thận nhẹ nhàng chấm phần ñầu nhọn có chứa mẫu cà chua chín lên bản mỏng tại vạch xuất phát. Chạm vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thật nhanh ñể dung dịch mẫu cà chua chín thấm vào bản mỏng tạo thành một ñiểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu ñiểm này sẽ lan to. ðể khô dung môi ete dầu hỏa ngoài không khí PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 24 khoảng 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua chín dùng ñể chạy sắc kí - Chuẩn bị bình chạy sắc kí: Bình hút ẩm ñã rửa sạch, phơi khô. ðặt cốc 250 ml vào giữa bình. Cho dung môi giải li vào cốc, dung môi ete dầu hỏa: Toluen: axeton trộn theo tỉ lệ 45:1:5, sau ñó dùng pipet hút 30 ml cho vào cốc, ñể yên 5-10 phút ñể bão hòa dung môi trong bình. Bản mỏng ñược cầm thẳng ñứng và ñược nhúng vào cốc chứa dung môi trong bình, khi nhúng phải cẩn thận ñể hai cạnh của bản mỏng không chạm vào thành cốc, sau ñó nhẹ nhàng ñể bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng một góc khoảng 15 ñộ. Vị trí vết chấm dịch cà chua nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5 cm ðậy nắp bình thật kín trên nắp có thoa vazơlin ñể ñảm bảo không khí không lọt vào và khi mở nắp cũng dễ dàng, theo dõi quá trình chạy sắc kí, khi dung môi lên cách tuyến dung môi 1cm thì lấy bản mỏng ra, ñể bay hơi dung môi ngoài không khí 10 phút - Hiện hình các vết chấm sau khi triển khai: Cho một ít tinh thể iot vào 1 cái lọ nhỏ và ñặt vào bình hút ẩm khác. ðưa bản mỏng ñã khô dung môi vào miệng lọ ñậy kín nắp, hơi iot tỏa ra chiếm hết lọ và các vết sẽ hiện hình rõ trên bản mỏng. Lấy bản mỏng ra, ñậy nắp bình hút ẩm lại, dùng bút chì ñánh dấu tâm vệt. Xác ñịnh Rf , quan sát vệt chúng tôi thấy vệt có màu da cam, vệt không tròn là do dịch chưa tinh khiết, nên muốn vệt chạy sắc kí bản mỏng tròn sắc nét thì dịch phải tinh khiết vì vậy chúng tôi phải tách dịch cà chua chín bằng cột sắc kí Tiến hành chạy sắc kí bản mỏng với các hệ dung môi còn lại ñã ñược trình bày trong bảng 2.1. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua dùng ñể chạy sắc kí. 2.2.4.2. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của cà rốt. Tiến hành chạy bản mỏng với dịch cà rốt như ñã tiến hành với dịch cà chua cũng qua các bước như ñã trình bày. Kết quả chạy bản mỏng tương tự vệt cũng có màu da cam, vệt không tròn. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 25 2.2.4.3. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của ñu ñủ chín. Tiến hành chạy bản mỏng với dịch ñu ñủ chín như ñã tiến hành với dịch cà chua cũng qua các buớc như ñã trình bày. Kết quả chạy bản mỏng tương tự vệt cũng có màu da cam, vệt không tròn. 2.2.5. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten [1],[4]. 2.2.5.1. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch cà chua chín. - Chất hấp phụ: Al2O3 - Dung môi chạy sắc kí cột: do chất cần tách là licopen và β-caroten nên chúng tôi dùng ete dầu hỏa ñể chạy cột - Cách nhồi cột: nhồi khô Cột có kích thước 50cm ñược rửa sạch bằng hỗn hợp nước rửa sunfocromic, tráng và làm khô nước, sấy thật khô cột, khóa cột, thoa vazơlin vào khóa cột cho ñều, cho một ít bông vào ñáy cột, cột ñược ñổ ñầy ete dầu hỏa, vừa cho ete dầu hỏa chảy ra chầm chậm bên dưới vừa cho từng ít một của 20 g bột Al2O3 ở dạng khô vào ñầu cột, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột, cho ñến hết 20 g bột Al2O3 và dừng lại.Tiếp tục cho ete dầu hỏa vào cột, dung môi ete dầu hỏa ñược lấy ra ở phía dưới cột với tốc ñộ 10 giọt/phút chứa vào cốc và dung môi này tiếp tục ñược dùng ñể rót trở lại lên ñầu cột vài ba lần ñể giúp cho việc nạp cột ñược chặt chẽ và ñảm bảo không có bọt khí trong cột. Không ñược ñể cho ñầu cột bị khô, cho lớp bông gòn lên trên bề mặt lớp bột Al2O3 ñể khi cho ete dầu hỏa chạy qua cột bề mặt cột không bị xáo trộn. Cho ete dầu hỏa chảy qua cột ñến khi cột mịn. ðể ổn ñịnh trước 10 giờ. - Cách cho dịch cà chua chín vào ñầu cột: Dịch chất màu của cà chua chín ñược hòa tan vào 1 ml ete dầu hỏa. Mở khóa cột ñể hạ mực ete dầu hỏa bằng với mực chất hấp phụ ñang có trong cột, khóa cột lại, dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch mẫu cà chua chín cho vào ñầu cột. Từ từ mở khóa cột ñể cho dung dịch mẫu cà chua chín thấm xuống bề mặt lớp Al2O3 trên ñầu cột, lúc thấy PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 26 dung dịch ñã xuống gần lớp Al2O3 thì khóa cột lại, dung dịch không chảy ra nữa, tiếp tục nạp cho hết lượng chất màu dịch cà chua vào ñầu cột. Mở khóa ñể hạ mực dung dịch màu cà chua chín xuống sát mặt thoáng chất hấp phụ Al2O3, dùng ống nhỏ giọt cho một lượng nhỏ 5-10 ml ete dầu hỏa vào ñầu cột lại mở khóa ñể dịch màu cà chua chảy ra sao cho mặt thoáng chất hấp phụ Al2O3 vừa vặn khô.Tiếp tục khóa lại cho thêm 2 ml ete dầu hỏa nữa, làm như thế ñến khi thấy dịch chất màu cà chua chín ñã gắn chặt vào chất hấp phụ Al2O3 ở phần ñầu cột. Cho thêm ete dầu hỏa ñầy cột và theo dõi quá trình tách các phân ñoạn - Theo dõi quá trình tách các phân ñoạn: Chất màu cà chua nạp vào cột quan sát chúng tôi thấy trong cột có hai màu: màu vàng da cam bên dưới cột và màu ñỏ bên trên. Cho ete dầu hỏa chảy qua cột, 15 phân ñoạn ñược tách ra với tốc ñộ 7-10 giọt/phút. Mỗi phân ñoạn lấy từ 15-20 giọt ñựng vào các lọ penicilin ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 15. Các phân ñoạn có màu không khác nhau nhiều có 2 màu chủ yếu là màu da cam và màu ñỏ. Khi dịch chất màu trên cột ñã chảy xuống hết ñóng khóa lại. Kiểm tra các phân ñoạn bằng sắc kí bản mỏng ñể xác ñịnh các phân ñoạn này ñã sạch chưa. 2.2.5.2. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch cà rốt Tiến hành tách licopen và β-caroten trong dịch chất màu của cà rốt bằng sắc kí cột cũng qua các bước chuẩn bị mẫu, cho mẫu vào cột, theo dõi quá trình tách các phân ñoạn như ñã tiến hành ñối với dịch cà chua chín. Sau ñó tiến hành kiểm tra các phân ñoạn bằng sắc kí bản mỏng ñể xác ñịnh các phân ñoạn này ñã sạch chưa. 2.2.5.3. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch ñu ñủ chín Tiến hành tách licopen và β-caroten trong dịch chất màu của ñu ñủ chín bằng sắc kí cột cũng qua các bước chuẩn bị mẫu, cho mẫu vào cột, theo dõi quá trình tách các phân ñoạn như ñã tiến hành ñối với dịch cà chua chín. Sau ñó tiến hành kiểm tra các phân ñoạn bằng sắc kí bản mỏng ñể xác ñịnh các phân ñoạn này ñã sạch chưa PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 27 2.2.6. Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà chua, cà rốt, ñu ñủ chín bằng sắc kí bản mỏng [1],[4] 2.2.6.1. Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà chua chín bằng sắc kí bản mỏng - Chuẩn bị bản mỏng: thao tác tiến hành như cách trình bày ở trên - Chọn dung môi: Ban ñầu chạy sắc kí bản mỏng với dịch chưa tinh khiết của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chúng tôi thấy rằng hệ dung môi toluen:axeton cho hình dạng vệt không tròn sắc nét, vệt có ñuôi dài lan rộng nên hệ dung môi này không phù hợp do ñó mà chúng tôi chỉ chọn các dung môi trình bày trong bảng 2.2 ñể chạy sắc kí bản mỏng kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột Bảng 2.2: Dung môi chạy sắc kí bản mỏng với dịch tinh khiết Dung môi hòa tan mẫu Hệ dung môi chạysắc kí bản mỏng Tỉ lệ Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:1:5 Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:5:1 Ete dầu hỏa: : axeton 45:5 Ete dầu hỏa Ete dầu hỏa : Toluen 45:5 - Chuẩn bị mao quản: giống như cách ñã trình bày ở trên - ðưa mẫu cà chua chín lên bản mỏng: Lấy các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột ñể bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ chúng tôi thu ñược các dạng tinh thể có màu vàng da cam và ñỏ. Hòa tan hết tinh thể trong lọ thu ñược ở phân ñoạn 1 của cà chua chín vào 1 ml ete dầu hỏa dùng mao quản ñã ñược vuốt nhọn nhúng nhẹ phần ñầu nhọn vào dung dịch mẫu của cà chua chín. Chấm mẫu dịch của cà chua chín lên bản mỏng. ðể khô dung môi ngoài không khí 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua chín dùng ñể chạy sắc kí - Chuẩn bị bình chạy sắc kí: Tiến hành giống như các bước ñã trình bày phần sắc kí bản mỏng ñối với mẫu là các dịch màu của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 28 - Hiện hình vết chấm sau khi triển khai: ðưa bản mỏng ñã khô dung môi ete dầu hỏa: Toluen: axeton vào miệng bình ñựng một ít tinh thể iốt, ñậy nắp bình lại lấy bản mỏng ra ñánh dấu tâm của vệt. Xác ñịnh Rf và màu sắc vệt. Tiếp tục chạy sắc ký bản mỏng của dịch màu cà chua chín với các dung môi còn lại và các phân ñoạn còn lại. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua chín dùng ñể chạy sắc kí với hệ dung môi xác ñịnh nêu ở trên. 2.2.6.2. Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà rốt bằng sắc kí bản mỏng Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng lần lượt ở các phân ñoạn của dịch cà rốt tinh khiết với các hệ dung môi trình bày ở bảng 2.2. Chuẩn bị tương tự như thao tác với mẫu là dịch cà chua chín tinh khiết. 2.2.6.3. Kiểm tra các phân ñoạn của sắc kí cột của dịch ñu ñủ chín bằng sắc kí bản mỏng − Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng lần lượt các phân ñoạn của ñu ñủ chín với các hệ dung môi trình bày ở bảng 2.2 giống như ñối với dịch cà chua chín và dịch cà rốt. − Sau khi tiến hành việc phân tách sắc tố các mẫu bằng phương pháp sắc kí cột, chúng tôi tiến hành thử lại với phương pháp sắc kí bản mỏng, các bước tiến hành ñã ñược nêu ở trên. Kết quả quan sát ban ñầu giúp chúng tôi có cơ sở ñể kết luận rằng: các phương pháp sử dụng ở trên ñối với các mẫu khảo sát là cà chua chín, cà rốt và ñủ chín ñã thu ñược những sắc tố màu tương ñối sạch. Các kết quả thực nghiệm thu ñược qua các giai ñoạn và kết quả thảo luận ñược trình bày ở chương sau. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 29 CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chạy sắc ký bản mỏng với dịch chưa tinh khiết 3.1.1. Chạy sắc ký bản mỏng với dịch cà chua chín Quả cà chua chín sau k