Đề tài Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng)

MỞ ĐẦU 5 CHƯƠNG1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 1.1. Giới thiệu về cây lạc 7 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố 7 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc 9 1.1.4. Một số phương pháp chọn tạo giống cây lạc 11 1.2. Giới thiệu về cây vừng 13 1.2.1. Nguồn gốc, Phân loại và phân bố 13 1.2.2. Tình hình sản xuất vừng 14 1.3. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân tích đa hình kiểu gen 15 1.3.1. Phương pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic DNA) 16 1.3.2. Phương pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats) 22 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 25 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 25 2.1.2. Thiết bị và hóa chất 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Tách chiết ADN từ lá 25 2.2.2. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN 27 2.2.4. Phương pháp PCR-SSR 30 2.2.5. Phân tích số liệu 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Kết quả Tách ADN tổng số 33 3.1.1. Cải tiến quy trình tách ADN tổng số 33 3.1.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số 35 3.2. Đánh giá tính đa hình ADN tập đoàn giống lạc/vừng 36 3.2.1. Phân tích tính đa hình ADN lạc bằng phương pháp SSR 36 3.2.2. Phân tích tính đa hình ADN vừng bằng phương pháp RAPD 44 3.3. Xác định mức độ sai khác của các dòng lạc/vừng đột biến bằng phương pháp phân tử 53 3.3.1. Xác định mức sai khác của các dòng lạc đột biến bằng phương pháp SSR 53 3.3.2. Xác định mức sai khác của các dòng vừng đột biến bằng phương pháp RAPD 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 1. Kết luận 71 2. Đề nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 72 Tài liệu tiếng Việt: 72 Tài liệu tiếng Anh 73 MỞ ĐẦU Lạc, vừng là những cây lấy dầu quan trọng ở Việt Nam. Trong đó cây lạc được Bộ công nghiệp đề ra mục tiêu quy hoạch phát triển quy mô rộng từ năm 2001 đến 2010. Riêng cây vừng mặc dù có hàm lượng dầu rất cao chiếm hơn 50%, nhưng do năng suất thấp, hay bị rủi ro nên hiện chưa được đầu tư thích đáng [15]. Trong những năn gần đây, hạn hán ngày càng trở nên khắc nghiệt. Vì vậy, trồng nhóm cây đậu đỗ sẽ kinh tế hơn so với trồng lúa nước. Đặc biệt đối với những vùng đất bạc màu có khó khăn về tưới nước thì trồng vừng được xem như là có hiệu quả kinh tế hơn cả. Cho nên, một số tỉnh bị hạn hán không có điều kiện tưới đã và đang tăng dần diện tích trồng các loại cây này. Việc cải thiện giống bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo, đột biến đã làm năng suất tăng đáng kể đối với cây lạc, vừng. Chọn tạo giống cổ điển thường mất rất nhiều thời gian và công sức.. Hơn nữa, vệc lựa chọn các giống làm bố mẹ thường chỉ dựa vào kiểu hình để đánh giá kiểu gen, vì thế nên hiệu quả tạo giống chưa cao.. Với sự hỗ trợ của sinh học phân tử đã giúp đẩy nhanh quá trình chọn tạo giống mà không bị chi phối bởi môi trường. Hàng loạt các chỉ thị phân tử dựa trên các kĩ thuật như: AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat)… đã được nghiên cứu và từng bước áp dụng vào chọn giống cây trồng trong đó có mục đích để bảo tồn giống và đánh giá đa dạng kiểu gen. Chỉ thị phân tử đã khắc phục được những thiếu sót, hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây, đặc biệt là xác định khoảng cách di truyền. Chỉ thị RAPD và SSR hiện đang được áp dụng rất có hiệu quả ngay ở Việt Nam trong chọn tạo các giống lúa mới kháng rày nâu, đạo ôn (Nguyễn Thị Lang và CS, 2002). Tuy nhiên ở nước ta, việc cải tạo các giống cây lạc/vừng bằng ứng dụng các chỉ thị phân tử mới bắt đầu được nghiên cứu. Nhằm bước đầu cung cấp các thông tin di truyền, góp phần lưu giữ, duy trì nguồn gen đa dạng của tập đoàn giống lạc và vừng ở phía Nam, đồng thời làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn bố mẹ sử dụng trong các tổ hợp lai phù hợp theo mục đích của người tạo giống, công trình nghiên cứu này là sử dụng hai loại chỉ thị RAPD và SSR để “ Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo được”. Tæng quan tµi liÖu Giíi thiÖu vÒ c©y l¹c ( ng¾n gän vµ gép nh÷ng c¸ci g× gi÷a võng vµ l¹c) Nguån gèc, ph©n lo¹i, vµ ph©n bè Nguån gèc C©y l¹c cã nguån gèc Nam Mü. N¨m 1977, E.G.Squier t×m thÊy nh÷ng qu¶ l¹c ®­îc ch«n trong c¸c ng«i mé cña nh÷ng ng­êi Inca cæ x­a däc bê biÓn phÝa t©y cña Nam Mü. L¹c ®­îc ®ùng trong c¸c v¹i cïng mét sè thùc phÈm kh¸c. Niªn ®¹i cña c¸c ng«i mé cæ nµy cã tõ n¨m 1500 – 1200 tr­íc c«ng nguyªn [12], [38]. Theo Gregory (1979, 1980) vµ mét sè t¸c gi¶, l¹c cã nguån gèc ë Nam Mü: ph©n bè tõ ®«ng b¾c Braxin ®Õn t©y nam Achentina vµ vïng ®Êt dèc d·y Andes cña Braxin vµ Peru [12], [45]. Ph©n lo¹i L¹c lµ c©y hä ®Ëu (Fabaceae), chi Arachis loµi Arachis hypogaea.L. §­îc chia lµm 2 loµi phô chÝnh kh¸c nhau vÒ d¹ng ph©n cµnh: loµi phô hypogaea cã d¹ng ph©n cµnh xen kÏ vµ loµi phô fastigiata víi d¹ng ph©n cµnh liªn tôc + Loµi phô hypogaea ®­îc chia thµnh 2 gièng thùc vËt häc: gièng hypogaea (virginia) vµ gièng hirsute + Loµi phô fastigiata ®­îc chia thµnh c¸c gièng nh­: gièng fastigiata (valencia), gièng vulgaris (spanish), gièng peruviana vµ gièng acequafurian Trªn thùc tÕ, ngoµi hai loµi phô ®­îc nh¾c ®Õn cßn cã loµi phô thø 3 d¹ng bß còng ®­îc c«ng nhËn [18], [23]. Sù ph©n bè cña l¹c Cã lÏ c©y l¹c ®Çu tiªn ®­îc ®­a tõ Nam Mü tíi ch©u ¢u vµo n¨m 1574 theo b¸o c¸o cña Nicolas Monardes. Krapovickas (1986) cho r»ng l¹c ®­îc ®­a tõ bê biÓn phÝa t©y Peru tíi Mehico vµ sau ®ã ngang qua Th¸i B×nh D­¬ng theo c¸c th­¬ng thuyÒn T©y Ban Nha tíi Philippine vµ c¸c vïng kh¸c thuéc ch©u ¸ - Th¸i B×nh D­¬ng Tãm l¹i, tõ vïng nguyªn s¶n ë Nam Mü, b»ng nhiÒu con ®­êng – l¹c ®· ®­îc ®­a ®i kh¾p thÕ giíi vµ nã nhanh chãng thÝch øng víi c¸c vïng nhiÖt ®íi, ¸ nhiÖt ®íi vµ c¸c vïng cã khÝ hËu Èm. §Æc biÖt l¹c ®· t×m ®­îc m¶nh ®Êt ph¸t triÓn thuËn lîi ë ch©u Phi vµ vïng nhiÖt ®íi ch©u ¸. L¹c ®­îc trång réng r·i ë ch©u Phi råi tõ ®©y, theo c¸c thuyÒn bu«n n« lÖ, l¹c l¹i ®­îc ®­a trë l¹i ch©u Mü vµ c¶ ch©u ¢u. ChÝnh sù giao l­u chÐo réng r·i nµy ®· h×nh thµnh nªn nhiÒu vïng gen thø cÊp vµ lµm phong phó thªm hÖ gen cña l¹c [12]. HiÖn nay, l¹c ®­îc trång ë h¬n 100 n­íc trªn thÕ giíi, víi tæng diÖn tÝch trªn 21 triÖu ha. Ch©u ¸ chiÕm 63.4% diÖn tÝch, s¶n l­îng chiÕm 71.7%; ch©u Mü chiÕm 31.3% diÖn tÝch, s¶n l­îng chiÕm 18.6% vµ B¾c Trung Mü chiÕm 3.7% vÒ diÖn tÝch, s¶n l­îng 7.5% (h×nh 1). DiÖn tÝch S¶n l­îng DiÖn tÝch, s¶n l­îng trång l¹c cña c¸c n­íc trªn thÕ giíi Nh÷ng n­íc s¶n xuÊt l¹c quan träng ë ch©u ¸ lµ Trung Quèc, Ên §é , Th¸i Lan, ViÖt Nam vµ Indonesia. Trong ®ã, Ên §é cã diÖn tÝch trång lín nhÊt trªn 8 triÖu ha. ë ViÖt Nam, tæng diÖn tÝch trång l¹c kho¶ng 270000 ha (sè liÖu n¨m 2000) vµ ph©n bè trªn tÊt c¶ c¸c vïng sinh th¸i n«ng nghiÖp cña ViÖt Nam [10]. Di truyÒn häc c©y l¹c Kawakami (1930) ®· x¸c ®Þnh sè l­îng nhiÔm s¾c thÓ cña l¹c A. hypogaea lµ 2n=4x=40. Husted (1931, 1933) ®· x¸c ®Þnh ®­îc 40 nhiÔm s¾c thÓ soma cña 6 gièng l¹c th­¬ng phÈm vµ 16 dßng cña nh÷ng gièng l¹c trång trät. X¸c nhËn sè ®¬n béi cña l¹c n=2x=20 ë mét sè d¹ng Valencia ®øng vµ hai d¹ng th©n bß. Patel vµ Narayana (1937) còng th«ng b¸o n=2x=20 nhiÔm s¾c thÓ ®¬n béi vµ 40 nhiÔm s¾c thÓ soma ë hai gièng l¹c ®øng “small japan” vµ “Gudiyaham Bunch”. Nh­ vËy, sè nhiÔm s¾c thÓ ®Æc tr­ng cho c¸c gièng kh¸c nhau cña loµi A. hypogaea lµ 2n=4x=40 [37], [18]. T×nh h×nh s¶n xuÊt l¹c T×nh h×nh s¶n xuÊt l¹c trªn thÕ giíi L¹c lµ c©y lÊy dÇu vµ cung cÊp thùc phÈm quan träng. Nã lµ c©y cung cÊp dÇu chÝnh thø 3 cña thÕ giíi bªn c¹nh c©y ®Ëu t­¬ng vµ c©y b«ng (FAO Food Outlok, 1990) [24]. HiÖn nay, diÖn tÝch ®Êt trång l¹c trªn thÕ giíi lµ 21 triÖu ha, ®­îc trång trªn 100 n­íc vµ s¶n l­îng ®¹t 29,14 triÖu tÊn. Trong khi n¨ng suÊt l¹c trung b×nh trªn thÕ giíi míi ®¹t xÊp xØ 1,3 tÊn/ha th× ë Trung Quèc thö nghiÖm trªn diÖn hÑp ®· thu ®­îc n¨ng suÊt kho¶ng 12 tÊn/ha, cao h¬n 9 lÇn so víi n¨ng suÊt b×nh qu©n cña thÕ giíi. §iÒu ®ã chøng tá tiÒm n¨ng n¨ng suÊt l¹c cßn rÊt lín ®Ó khai th¸c. Ên §é lµ n­íc ®øng ®Çu thÕ giíi vÒ diÖn tÝch trång l¹c (6-7 triÖu ha) nh­ng n¨ng suÊt cßn thÊp (0,8-1,2 tÊn/ha). Nãi chung, n¨ng suÊt l¹c ë Ên §é kh«ng ®ång ®Òu, cã vïng chØ ®¹t 0,5 tÊn/ha, cã vïng l¹i ®¹t tíi 3 tÊn/ha [42]. Trung Quèc lµ n­íc ®øng thø 2 vÒ diÖn tÝch trång l¹c. DiÖn tÝch trång l¹c ë Trung Quèc cã xu h­íng t¨ng (n¨m 1993 tæng diÖn tÝch lµ 3379,0 ngh×n ha, ®Õn n¨m 2002 tæng diÖn tÝch lµ 4920,7 ngh×n ha). N¨ng suÊt l¹c ë Trung Quèc kh¸ ®ång ®Òu ë c¸c vïng [42]. NhiÒu n¨m nay, s¶n phÈm l¹c Trung Quèc lµ mét trong c¸c mÆt hµng n«ng s¶n xuÊt khÈu næi tiÕng trªn thÞ tr­êng quèc tÕ. Trung Quèc còng lµ mét n­íc gÆt h¸i nhiÒu thµnh tùu nhÊt trong ph¸t triÓn s¶n xuÊt l¹c, ®Æc biÖt trong thËp kû 90 võa qua. Vµo nh÷ng n¨m 1960, n¨ng suÊt l¹c Trung Quèc míi chØ ®¹t 1,14 tÊn/ha; n¨m 1970 lµ 1,21 tÊn/ha; n¨m1980 lµ 1,78 tÊn/ha; ®Õn n¨m 1990 lµ 2,5 tÊn/ha. N¨m 1994 n¨ng suÊt l¹c trung b×nh cña Trung Quèc ®· ®¹t 2,69 tÊn/ha vµ n¨m 2000 ®­a n¨ng suÊt l¹c toµn quèc lªn 3,0 tÊn/ha. §Ó ®¹t ®­îc nh÷ng thµnh tùu nh­ vËy, Trung Quèc ®· thùc hiÖn chiÕn l­îc ®Èy m¹nh nghiªn cøu vµ chuyÓn giao tiÕn bé kü thuËt, trong ®ã kü thuËt che phñ nilon lµm t¨ng n¨ng suÊt tõ 20-50% [42]. Mü lµ n­íc cã diÖn tÝch trång l¹c kh«ng lín (0,59 triÖu ha), nh­ng n¨ng suÊt ®¹t cao nhÊt thÕ giíi (3,1 tÊn/ha), s¶n l­îng ®¹t 1,8 triÖu tÊn (sè liÖu n¨m 2003) [38]. §iÒu ®ã chøng tá Mü lµ n­íc ®øng ®Çu vÒ ¸p dông c¸c tiÕn bé khoa häc kü thuËt. T×nh h×nh s¶n xuÊt l¹c ë ViÖt Nam ë n­íc ta, l¹c ®­îc trång réng r·i trªn nhiÒu lo¹i ®Êt vµ ®Þa h×nh kh¸c nhau. DiÖn tÝch trång l¹c cã xu h­íng t¨ng m¹nh nh÷ng n¨m tr­íc ®©y vµ nay cã xu h­íng æn ®Þnh diÖn tÝch 245- 247 triÖu ha (b¶ng 1) DiÔn biÕn s¶n xuÊt l¹c ë n­íc ta N¨m  DiÖn tÝch (1000ha)  N¨ng suÊt (t¹/ha)  S¶n l­îng (tÊn)   1939  4,6  7,4  3,4   1955  17,7  8,3  14,5   1965  85,9  9,42  80,9   1973  81,5  9,66  78,7   1985  231,0  9,5  202,4   1993  217,1  11,9  259,3   1994  248,2  11,9  294,4   1995  259,9  12,9  334,6   1998  269,4  14,3  386,0   1999  247,6  12,8  318,1   2001  244,6  14,8  363,1   2002  246,7  16,2  400,4   Tõ n¨m 1990 ®Õn nay, c«ng t¸c nghiªn cøu vµ chuyÓn giao tiÕn bé kü thuËt trång l¹c ë n­íc ta ®· ®­îc quan t©m h¬n tr­íc. C¸c ®Ò tµi nghiªn cøu cÊp Nhµ n­íc, cÊp Ngµnh, c¸c dù ¸n trong n­íc vµ Quèc tÕ vÒ nghiªn cøu, chuyÓn giao tiÕn bé kü thuËt trªn c©y l¹c ®· ®­îc triÓn khai, thu hót sù tham gia cña mét ®éi ngò ®«ng ®¶o c¸c c¸n bé ngiªn cøu vµ khuyÕn n«ng trong c¶ n­íc. Bé N«ng nghiÖp & Ph¸t triÓn N«ng th«n x¸c ®Þnh ph¸t triÓn c©y lÊy dÇu trong ®ã c©y l¹c lµ mét trong nh÷ng vÊn ®Ò träng ®iÓm trong ch­¬ng tr×nh ph¸t triÓn n«ng nghiÖp vµ n«ng th«n n­íc ta. Hîp t¸c quèc tÕ trong lÜnh vùc nghiªn cøu vµ ph¸t triÓn c©y l¹c ®· ®­îc t¨ng c­êng. Th«ng qua ch­¬ng tr×nh hîp t¸c víi ICRISAT, m¹ng l­íi ®Ëu ®ç vµ C©y cèc ch©u ¸ (CLAN), ViÖt Nam ®· häc hái vµ tiÕp cËn ®­îc nhiÒu thµnh tùu míi [10]. TriÓn väng ph¸t triÓn c©y l¹c ë ViÖt Nam: ë n­íc ta, l¹c ®­îc coi lµ c©y trång cã hiÖu qu¶ kinh tÕ cao vµ cã gi¸ trÞ rÊt ®a d¹ng. Tr­íc hÕt, víi gi¸ trÞ dinh d­ìng cao nªn l¹c lµ c©y thùc phÈm quan träng cña nh©n d©n ta. Trong dÇu l¹c chøa hµm l­îng axÝt bÐo ch­a no cao (80% trong thµnh phÇn axÝt bÐo cña dÇu l¹c), ®©y chÝnh lµ lo¹i dÇu thùc phÈm tèt. Ngoµi gi¸ trÞ dinh d­ìng, l¹c cßn lµ c©y c¶i t¹o ®Êt rÊt tèt. L¹c lµ c©y trång nhiÖt ®íi vµ ¸ nhiÖt ®íi nªn phï hîp víi ®iÒu kiÖn nhiÖt ®íi cña n­íc ta. Bªn c¹nh ®ã, yªu cÇu vÒ ®Êt ®ai ®èi víi c©y l¹c kh«ng kh¾t khe l¾m. §Êt ®ai n«ng nghiÖp cña ta bÞ röa tr«i vµ phong ho¸ nhanh, hµm l­îng mïn vµ dinh d­ìng thÊp (nhÊt lµ ®Êt b¹c mµu, ®Êt phï sa cæ, ®Êt dèc tô…). V× vËy, trång l¹c lµ mét trong nh÷ng biÖn ph¸p c¶i t¹o ®Êt, t¹o nÒn n«ng nghiÖp bÒn v÷ng. L¹c lµ c©y trång c¶i t¹o ®Êt quan träng trong hÖ thèng canh t¸c ®a canh ë n­íc ta [10], [12]. Vµi n¨m trë l¹i ®©y, t×nh tr¹ng h¹n h¸n kÐo dµi, §¶ng vµ Nhµ n­íc cã chñ tr­¬ng chuyÓn ®æi c©y trång sang c©y trång c¹n, trong ®ã l¹c lµ mét trong nh÷ng c©y trång chñ ®¹o. Mét sè ph­¬ng ph¸p chän t¹o gièng c©y l¹c vµ võng X©y dùng tËp ®oµn gièng vµ c¶I tiÕn quÇn thÓ B­íc ®Çu tiªn trong c«ng t¸c chän t¹o gièng lµ x©y dùng tËp ®oµn gièng nh»m thu nhËp nguån gen lµm vËt liÖu khëi ®Çu cho c«ng t¸c chän t¹o sau nµy. TËp ®oµn gièng gåm c¸c gièng cã nguån gèc kh¸c nhau: c¸c gièng cã thÓ thu thËp tõ c¸c ®Þa ph­¬ng hay nhËp néi… Tõ tËp ®oµn gièng, ta tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm so s¸nh, kh¶o nghiÖm ®Ó x¸c ®Þnh gièng tèt cho s¶n xuÊt, mét sè gièng kh¸c l¹i ®­îc dïng lµm nguyªn liÖu cho lai t¹o hoÆc xö lý ®ét biÕn. Tõ n¨m 1991 – 1995, b»ng ph­¬ng ph¸p chän läc c¸ thÓ, dßng l¹c VD1 ®­îc chän t¹o tõ gièng ®Þa ph­¬ng Lú. Qua ®¸nh gi¸ gièng VD1 cho n¨ng suÊt cao h¬n gièng ®èi chøng ®Þa ph­¬ng Lú 19%, hµm l­îng dÇu cao h¬n 3%... HiÖn t¹i, VD1 ®· ®­îc Bé N«ng nghiÖp & PTNT cho phÐp khu vùc hãa phÝa Nam. HiÖn nay, th«ng qua c¸c b­íc ®¸nh gi¸, tuyÓn chän tõ c¸c gièng nhËp néi chóng ta ®· tuyÓn chän ®­îc nhiÒu gièng l¹c cho n¨ng suÊt cao, thÝch hîp víi c¸c ®iÒu kiÖn sinh th¸i kh¸c nhau. C¸c gièng hiÖn ®­îc trång phæ biÕn réng r·i ë phÝa B¾c lµ L14, L18… §Òu lµ nh÷ng gièng cã nguån gèc nhËp néi tõ Trung Quèc ®­îc Trung t©m NC & TN §Ëu ®ç – ViÖn KHNN ViÖt Nam chän t¹o [10] [12]. Ngµy nay, ngoµi viÖc ®¸nh gi¸ tËp ®oµn gièng b»ng c¸c chØ thÞ h×nh th¸i, ng­êi ta cßn ®¸nh gi¸ tËp ®oµn gièng b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p chÞ thÞ ph©n tö (RAPD, SSR, RFLP, AFLP…). Nhê c¸c chØ thÞ nµy mµ chóng ta biÕt ®­îc kho¶ng c¸ch di truyÒn gi÷a c¸c gièng, t¹o viÖc lùa chän bè mÑ cÆp lai phï hîp. Chän t¹o gièng l¹c b»ng ph­¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh Lai gièng lµ ph­¬ng ph¸p c¬ b¶n ®Ó t¹o ra biÕn dÞ tæ hîp phôc vô cho chän läc. Nhê lai gièng mµ cã thÓ phèi hîp ®­îc c¸c ®Æc tÝnh vµ tÝnh tr¹ng cã lîi cña c¸c d¹ng bè mÑ vµ con lai. Tuy nhiªn, bè mÑ truyÒn cho con c¸i bé gen cña chóng vµ kÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp mµ nhiÒu kiÓu gen míi ®­îc t¹o ra, sau khi t­¬ng t¸c víi m«i tr­êng ®· t¹o ra c¸c kiÓu h×nh míi rÊt cã Ých cho chän gièng. §ã lµ c©y kiÓu th©m canh, kiÓu c©y lý t­ëng ë lóa, hµm l­îng dÇu siªu cao ë h­íng d­¬ng... Mét hiÖu øng ®Æc biÖt nhËn ®­îc trong lai gièng lµ hiÖu øng ­u thÕ lai biÓu hiÖn ë ®êi F1. Nhê hiÖu øng nµy mµ ph­¬ng ph¸p t¹o gièng ­u thÕ lai ®· ra ®êi vµ nhiÒu gièng c©y trång n¨ng suÊt siªu cao ®· ®­îc t¹o ra nh­ ng«, lóa, mÝa, hµnh... Lai h÷u tÝnh kÕt hîp víi chän läc ®óng kü thuËt lµ ph­¬ng ph¸p chän t¹o gièng l¹c nhanh vµ cã hiÖu qu¶ cao. B­íc ®Çu tiªn vµ cã tÝnh quyÕt ®Þnh trong c«ng t¸c lai t¹o lµ chän bè mÑ cÆp lai. Tiªu chuÈn chän bè mÑ tïy theo môc ®Ých lai: cã thÓ lai ®Ó c¶i tiÕn mét ®Æc ®iÓm nµo ®ã (vá qu¶, tÝnh chèng chÞu…); hoÆc sö dông trong nghiªn cøu di truyÒn ta chän bè mÑ cÆp lai cã nhiÒu tÝnh tr¹ng t­¬ng ph¶n, cã quan hÖ di truyÒn xa [12]. Tõ ph­¬ng ph¸p l¹i h÷u tÝnh, Trung t©m NC & TN §Ëu ®ç ®· chän t¹o ®­îc gièng L12, L03 lµ nh÷ng gièng triÓn väng, phï hîp víi vïng n­íc trêi. Xö lý ®ét biÕn §ét biÕn lµ sù thay ®æi ®ét ngét vÒ vËt chÊt di truyÒn cña tÕ bµo. §ét biÕn cã thÓ x¶y ra ë gen (mÊt hay thay ®æi cÊu tróc) hoÆc ë nhiÓm s¾c thÓ. §ét biÕn lµ qu¸ tr×nh hoµn toµn ngÉu nhiªn vµ ®a sè chóng g©y h¹i cho c¬ thÓ sinh vËt. Tuy nhiªn, trong chän t¹o gièng, ®ét biÕn nh©n t¹o cã tÇn sè biÕn dÞ cã lîi lµ rÊt thÊp nh­ng ­u ®iÓm lµ thêi gian t¹o gièng nhanh chãng v× phÇn lín c¸c biÕn dÞ ®Òu di truyÒn. - Ph­¬ng ph¸p xö lý §èi víi c©y l¹c, xö lý ®ét biÕn b»ng t¸c nh©n vËt lý hay hãa häc ®Òu cã t¸c dông g©y ®ét biÕn. C¸c t¸c nh©n hãa häc nh­: H2O2, nång ®é 1-10% vµ NMU (Nitro – methyl ure) nång ®é 0,01 – 0,025%. T¸c nh©n vËt lý: th­êng dïng tia gamma Co60 liÒu l­îng 5kr – 25 kr. Xö lÝ hãa chÊt th­êng lµ dïng ph­¬ng ph¸p ng©m h¹t, thêi gian ng©m 5-30 phót. Xö lý phãng x¹ b»ng ph­¬ng ph¸p xö lý h¹t kh«. - Chän läc sau xö lý Chän läc c¸ thÓ tõ M1-M4, chän c¸c dßng æn ®Þnh ®Ó tiÕn hµnh chän läc quÇn thÓ. QuÇn thÓ ®ét biÕn æn ®Þnh tõ M8 vµ sau ®ã cã thÓ tiÕn hµnh nh©n gièng [13]. Gièng l¹c V79 lµ gièng l¹c quèc gia ®­îc ViÖn KHNN ViÖt Nam chän t¹o b»ng ph­¬ng ph¸p xö lý ®ét biÕn tia gamma Co60 liÒu l­îng 5kr…[10]. Giíi thiÖu vÒ c©y võng Nguån gèc, Ph©n lo¹i vµ ph©n bè C©y võng (Sesamum indicum L.) lµ c©y c«ng nghiÖp ng¾n ngµy vµ lµ c©y lÊy dÇu quan träng. C©y võng thuéc hä võng (Pedaliaceae) gåm 16 chi víi 60 loµi. Cã kho¶ng 37 loµi thuéc chi Sesamum nh­ng chØ Sesamum indicum lµ loµi duy nhÊt ®­îc con ng­êi sö dông trong trång trät. VÒ di truyÒn häc, võng lµ c©y l­ìng béi 2n = 2x = 26 [46]. Võng lµ c©y lÊy dÇu cæ x­a nhÊt, cã nguån gèc tõ Nam Phi. T¹i ®©y cßn rÊt nhiÒu võng hoang d¹i cho h¹t, nh­ng cã vÞ ®¾ng. ë Babylon vµ Assyria võng ®· ®­îc ®¸nh gi¸ lµ c©y lÊy dÇu cã gi¸ trÞ cao c¸ch ®©y 4000 n¨m [39]. Theo nhiÒu con ®­êng kh¸c nhau, võng ®· lan táa ra kh¾p Ch©u Phi, Trung Mü, Nam Mü, miÒn Trung ¸, Ên §é, Trung Quèc, c¸c n­íc §«ng Nam ¸ trong ®ã cã ViÖt Nam. Võng cã mÆt ë c¸c vïng nhiÖt ®íi, ¸ nhiÖt ®íi vµ mét phÇn «n ®íi vµo lóc thêi tiÕt ch­a b¾t ®Çu l¹nh gi¸. Võng chØ cã thÓ n¶y mÇm khi nhiÖt ®é ®Êt trªn 200C vµ ph¸t triÓn ë nhiÖt ®é d­íi 300C. S¶n phÈm chÝnh cña võng lµ h¹t, h¹t võng chøa b×nh qu©n 50% dÇu thùc vËt, 25% protein, 5% chÊt kho¸ng…[14], [46], [40]. Theo t¹p chÝ “DÇu thùc vËt thÕ giíi” th× cã kho¶ng 30 n­íc trªn thÕ giíi cã gieo trång võng quy m« tèi thiÓu trªn 10 ngh×n ha. Ai CËp lµ n­íc cã n¨ng suÊt b×nh qu©n cao nhÊt (11,5 t¹/ha) nh­ng s¶n l­îng kh«ng nhiÒu (kho¶ng 20 ngh×n tÊn). Ên §é, Trung Quèc lµ nh÷ng n­íc s¶n l­îng lín nhÊt thÕ giíi, tiÕp theo lµ Mianmar, Sudan, Mehico, Nigeria, Venezuela, Thæ NhØ Kú, Uganda and Ethiopia. S¶n l­îng dao ®éng do nÒn kinh tÕ ®Þa ph­¬ng vµ ®iÒu kiÖn thêi tiÕt. S¶n l­îng võng trªn toµn thÕ giíi 2-5 triÖu tÊn ®­îc trång ë 5-16,3 triÖu ha. Theo tæ chøc FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) (2002), th× s¶n l­îng võng ®­îc xÕp vÞ trÝ thø 6 trong sè h¹t c©y lÊy dÇu ¨n ®­îc (2.893,114 triÖu tÊn), vµ xÕp vÞ trÝ 12 ®èi víi s¶n l­îng dÇu thùc vËt trªn toµn thÕ giíi (754.159 triÖu tÊn) [39]. ë ViÖt Nam, viÖc gieo trång võng ®· cã tõ l©u. Trong s¸ch “V©n ®µi lo¹i ng÷”, nhµ b¸c häc Lª Quý §«n ®· tõng tæng kÕt: “phÐp lµm ruéng tèt th× nªn trång ®ç xanh tr­íc, sau ®ã ®Õn c¸c lo¹i ®Ëu nhá vµ võng..”. S¶n l­îng võng hiÖn nay cña n­íc ta kho¶ng 30 ngh×n tÊn/n¨m, n¨ng suÊt b×nh qu©n 4,8 t¹/ha. T×nh h×nh s¶n xuÊt võng Trªn thÕ giíi, diÖn tÝch trång võng kh¸ hÑp (5-16,3 triÖu ha), n¨ng suÊt b×nh qu©n kho¶ng 3,5 t¹/ha, s¶n l­îng 2,2 triÖu tÊn. L­îng võng s¶n xuÊt ®­îc chñ yÕu dïng trong tiªu thô néi ®Þa. Trung Quèc vµ Ên ®é lµ hai n­íc cã s¶n l­îng võng lín nhÊt (trªn 500 tÊn). Nhãm c¸c n­íc cã s¶n l­îng ®øng thø hai (trªn100 ngh×n tÊn) lµ: Myanma, Sudan, Uganda. Nhãm c¸c n­íc cã s¶n l­îng võng d­íi 100 ngh×n tÊn: Guatemala, Mehico, Th¸i Lan, Thæ NhÜ K×...[46] trong ®ã cã ViÖt Nam (b¶ng 2). S¶n l­îng võng mét sè n­íc trªn thÕ giíi TT  N­íc  s¶n l­îng (tÊn)   1  Ên §é  800,000   2  Trung Quèc  650,000   3  Myanmar  380,000   4  Sudan  325,000   5  Uganda  110,000   6  Nigeria  75,000   7  Pakistan  68,000   8  Bangladesh  50,000   9  Céng hßa Trung Phi  42,800   10  Liªn minh Céng hßa Tanzania  41,000   11  Th¸i Lan  40,000   12  Ethiopia  39,000   13  Ai CËp  37,000   14  Guatemala  35,049   15  Iran (Islamic Republic of)  33,000   16  ViÖt Nam  30,000   17  Paraguay  30,000   18  Burkina Faso  29,000   19  Somalia  28,400   20  Mehico  22,593   HiÖn nay, c¸c nghiªn cøu vÒ c©y võng ë n­íc ta cßn rÊt h¹n chÕ, n¨ng suÊt võng cßn thÊp. C¸c gièng võng hiÖn trång chñ yÕu lµ c¸c gièng nhËp néi nh­ V6, V36... T¹i trung t©m NC & TN ®Ëu ®ç, n¨m 2001 ®· chän t¹o ®­îc gièng võng ®en V§10 cã nguån gèc tõ Minh Léc – HËu Léc – Thanh Hãa. Qua mét sè nghiªn cøu kh¶o nghiÖm ë mét sè ®Þa ph­¬ng th× V§10 cho n¨ng suÊt cao h¬n c¶ V6 vµ V36 [17]. øng dông kü thuËt sinh häc ph©n tö trong viÖc ph©n tÝch ®a h×nh kiÓu gen Trong nh÷ng n¨m qua, víi sù ra ®êi cña sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ gen, mét ngµnh khoa häc míi ®· xuÊt hiÖn: Ph©n lo¹i häc ph©n tö (molecular taxonomy), chñ yÕu dùa trªn c¸c kü thuËt ph©n tÝch ADN. C¸c kü thuËt “®iÓm chØ ADN” ph©n tÝch vµ so s¸nh tr×nh tù nucleotide cña c¸c ®o¹n ADN ®· gióp cho viÖc ph¸t hiÖn c¸c loµi míi, gi¶i quyÕt c¸c mèi nghi ngê vÒ vÞ trÝ ph©n lo¹i, ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ vÒ tÝnh ®a d¹ng di truyÒn, quan hÖ chñng lo¹i vµ tiÕn ho¸ cña nhiÒu loµi ®éng, thùc vËt vµ vi sinh vËt [59]. C¸c kü thuËt ®­îc sö dông trong ph©n lo¹i ph©n tö bao gåm: kü thuËt isozym (®ång enzym), c¸c kü thuËt ph©n tÝch ®o¹n ADN nh­ ph­¬ng ph¸p ®a h×nh chiÒu dµi c¸c ®o¹n c¾t giíi h¹n (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), c¸c kü thuËt trªn c¬ së cña ph¶n øng PCR nh­ ADN tiÓu vÖ tinh (Simple Sequence Repeats - SSR), ®a h×nh c¸c ®o¹n ADN nh©n b¶n ngÉu nhiªn (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), ®a h×nh chiÒu dµi c¸c ®o¹n ADN nh©n b¶n (Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP), kü thuËt ®iÓm chØ ADN ®a locus, lai ADN, ph©n tÝch tr×nh tù ADN... Ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch RAPD (Random Aplified Polymorphic DNA) Nguyªn lý - Kü thuËt RAPD lµ kü thuËt phèi hîp ph¶n øng sö dông polymerase cña ph¶n øng chuçi trïng hîp (PCR) víi c¸c måi ADN kh«ng ®Æc thï ®Ó nh©n c¸c ®o¹n ADN mét c¸ch ngÉu nhiªn. C¸c ®o¹n ADN nh©n ngÉu nhiªn cã thÓ ®a h×nh bëi c¸c ®o¹n nh©n cã thÓ cã trong mÉu ADN cña c¸ thÓ nµy nh­ng l¹i kh«ng cã trong mÉu ADN cña c¸ thÓ kh¸c [70]. N¨m 1990, William vµ céng sù ®· ph¸t triÓn kü thuËt RAPD dùa trªn c¬ së cña ph­¬ng ph¸p PCR.Måi th−êng gåm kho¶ng 10 nucleotide ®−îc s¾p xÕp theo mét tr×nh tù ngÉu nhiªn nµo ®ã, v× vËy x¸c suÊt b¾t cÆp mét ®o¹n nucleotide trong genome cã 10 gèc bæ trî sÏ vµo kho¶ng 1/410 ( 1/1010 = 1/1.000.000. Cã nghÜa cø kho¶ng 1 triÖu gèc nucleotide sÏ cã 1 vÞ trÝ gåm 10 gèc bæ trî cho 10 gèc cña måi RAPD víi tr×nh tù x¸c ®Þnh nµo ®ã. Do kü thuËt nµy chØ sö dông mét lo¹i måi ®ång nhÊt cho c¶ hai ®Çu cña ®o¹n ADN cÇn nh©n b¶n, ngoµi ra 2 ®o¹n måi nµy ph¶i ®−îc kÕt cÆp trªn hai sîi ®¬n kh¸c nhau cña chuçi ADN vµ ph¶i ®i theo chiÒu h­íng vµo nhau, nªn x¸c suÊt trªn ph¶i nhá ®i nhiÒu. Trªn thùc tÕ x¸c suÊt b¾t cÆp cña c¸c måi cßn nhá h¬n nhiÒu lÇn n÷a, bëi trong ®iÒu kiÖn PCR th«ng th−êng chØ tæng hîp ®−îc mét ®o¹n ADN kh«ng dµi qu¸ n¨m ngh×n nucleotide. §èi víi ADN thùc vËt, c¸c måi RAPD th−êng cho s¶n phÈm PCR tõ mét vµi b¨ng ®Õn vµi chôc b¨ng cã chiÒu dµi tõ 100-5000 nucleotide [3],[16]. Víi ®Æc ®iÓm lµ ng¾n, nªn kh¶ n¨ng ®o¹n måi t×m ra ®­îc ®iÓm g¾n trªn DNA khu«n kh«ng qu¸ khã kh¨n. Tuú vµo tõng lo¹i thùc vËt hay vi sinh vËt mµ c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn ®­îc thiÕt kÕ. Theo lý thuyÕt, sè l­îng cña c¸c ®o¹n DNA ®­îc nh©n b¶n phô thuéc vµo ®é dµi vµ vÞ trÝ cña c¸c ®o¹n måi, kÝch th­íc vµ møc ®é phøc t¹p cña cÊu tróc DNA geneome. KÕt qu¶ lµ sau khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD sÏ ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a h×nh dùa trªn c¸c ph©n ®o¹n DNA ®­îc nh©n b¶n. Sù ®a h×nh cña s¶n phÈm RAPD lµ do kÕt qu¶ thay ®æi c¸c ®iÓm g¾n cña måi (vÝ dô: ®ét biÕn ®iÓm) hoÆc do thay ®æi nhiÔm s¾c thÓ trong c¸c vïng ®­îc nh©n b¶n (vÝ dô: thªm ®o¹n, mÊt ®o¹n hay ®¶o ®o¹n) sÏ g©y ra sù thay ®æi vÒ kÝch th­íc hay ng¨n c¶n sù nh©n b¶n DNA. S¶n phÈm khuyÕch ®¹i ®­îc ph©n t¸ch b»ng ®iÖn di trªn gel agarose hoÆc polyacrylamide vµ cã thÓ quan s¸t ®­îc sau khi gel ®­îc nhuém b»ng ho¸ chÊt ®Æc tr­ng. TÝnh ®a h×nh ®­îc nhËn ra do sù cã mÆt hoÆc v¾ng mÆt cña mét s¶n phÈm nh©n b¶n. ­u nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p RAPD Kü thuËt RAPD cho phÐp ®¸nh gi¸ toµn bé hÖ gen cña sinh vËt, ®em l¹i tÝnh ®a h×nh cao, trong lËp b¶n ®å th× chØ thÞ RAPD chñ yÕu lµ chØ thÞ tréi. Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh ®¬n gi¶n, Ýt tèn kÐm. ­u ®iÓm n÷a cña kü thuËt nµy lµ nhanh, rÎ vµ cho phÐp tiÕn hµnh víi sè l­îng mÉu lín. Kü thuËt RADP kh«ng yªu cÇu mÉu dß ADN, kh«ng cÇn biÕt th«ng tin vÒ tr×nh tù ®o¹n ADN cÇn nghiªn cøu, quy tr×nh tiÕn hµnh nhanh, chØ cÇn mét l­îng nhá ADN khu«n vµ cã thÓ thùc hiÖn tù ®éng [33]. Víi mét bé måi ta cã thÓ sö dông ®­îc víi c¸c loµi kh¸c nhau trong khi c¸c mÉu dß RFLP chØ cã thÓ dïng ®­îc cho c¸c loµi cã quan hÖ gÇn gòi. TÝnh ®a d¹ng thu ®­îc tõ c¸c chØ thÞ RAPD ®­îc ®¸nh gi¸ cao h¬n so víi kü thuËt RFLP trong tr­êng hîp thùc hiÖn trªn cïng mét vËt liÖu vµ cho phÐp ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a d¹ng ngay c¶ trong c¸c ®o¹n chøa c¸c trËt tù nucleotide lÆp l¹i [21], [33]. Bªn c¹nh ®ã, RAPD cßn lµ mét kü thuËt lÊy dÊu ADN cã ®é nh¹y cao, cã hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c ®Þnh kiÓu gen, lËp b¶n ®å di truyÒn, lËp b¶n ®å gen liªn kÕt vµ ph©n tÝch con lai F1. B»ng ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ x¸c ®Þnh ®­îc ngay c¸c gen liªn kÕt cña quÇn thÓ F1 mµ kh«ng cÇn chê c¸c tÝnh tr¹ng cña thÕ hÖ F1 biÓu hiÖn khi trång vµ thu ho¹ch. Tuy nhiªn, RAPD còng cã nh÷ng nh­îc ®iÓm do måi kh«ng ®Æc hiÖu nªn cã rÊt nhiÒu b¨ng khã ph©n tÝch, dÉn ®Õn khi ph©n tÝch kÕt qu¶ rÊt dÔ sai lÇm do c¸ch ®¸nh gi¸ chñ quan cña tõng ng­êi. Nh­ng v× nã dÔ tiÕn hµnh nªn ph­¬ng ph¸p nµy hiÖn nay ®­îc øng dông kh¸ phæ biÕn ë nh÷ng n­íc cã ®iÒu kiÖn nh­ n­íc ta. HiÖn nay, ph­¬ng ph¸p RAPD ®­îc