Đề tài Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam

a 10 gen kháng chính (major gene) và một số gen kháng phụ khác (minor gene hay QTL) dựa vào sự phản ứng của các giống lúa đối với các biotyp rầy nâu cũng như các thí nghiệm phân tích di truyền (Sidu và Khush, 1978; Ikeda, 1985; Ishii, 1994; Bùi Chí Bửu và cs, 1997). Ngoài ra còn tồn tại nguồn gen kháng có bản chất tế bào chất (Rao, 1993). Biến động quan trọng và đáng lo ngại nhất của quá trình kháng rầy nâu là sự hình thành các biotyp mới có khả năng bẻ gãy tính kháng của các giống lúa. Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định được ít nhất 4 biotyp rầy nâu có mặt ở các vùng trồng lúa trên thế giới. Đặc tính kháng nhiễm rầy của các giống lúa tròng phổ biến tại Đồng bằng Bắc Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long đối với quần thể rày nâu thuộc các biotyp 1,2,3 dã được các cán bộ nghiên cứu ở viện Bảo vệ thực vật và viện lúa ĐBSCL khảo nghiệm trong nhiều năm (Nguyễn Công Thuật và cs, 1991 ; Lương Minh Châu và Nguyễn Văn Luật, 1998) Giống lúa CR203 được Nguyễn Công Thuật chọn lọc từ dòng IR8423-132-622 (một dòng lúa thuộc Viện lúa Quốc tế) và được đưa ra sản xuất từ những năm 80. CR203 mang gen kháng lặn bph2. Trong nhiều năm, các giống lúa mang gen bph2 như CR203, IR36, IR42, CN2 vẫn thể hiện tính kháng tốt với quần thể rày nâu ở Đồng bằng Bắc Bộ (Nguyễn Công Thuật và cs, 1996). 4. Nghiên cứu đa dạng ADN qua giải trình tự các nucleotit 4.1. Các phương pháp xác định trình tự nucleotit Việc giải trình tự các nucleotit đã được xác định từ những năm 70 nhờ sự ra đời của hai phương pháp khác nhau: phương pháp hoá học và phương pháp enzym. a) Phương pháp hoá học (Maxam- Gilrbert, 1977) Nguyên tắc : Dùng nhiệt độ biến tính phân tử ADN thành các mạch đơn không thể tự xoắn lại với nhau đồng thời đánh dấu đầu 5’ của các mạch bằng đồng vị phóng xạ P32. Tiếp theo, xử lý hoá học đặc hiệu phân huỷ đặc trưng một loại nucleotit của các mạch ADN đã đánh dấu phóng xạ tạo thành các đoạn oligonucleotit có chiều dài hơn kém nhau một nucleotit được phát hiện bằng điện di. Kết quả của 4 nhóm phản ứng hoá học xử lý mạch ADN được phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamit, dựa vào đó ta có thể xác định trình tự các mạch đơn. b) Phương pháp dideoxy (Sanger, 1977) Nguyên tắc: Dựa vào sự hoạt động của enzym ADN polymeraza trong quá trình tổng hợp ADN (enzym ADN polymeraza xúc tác gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3’OH, khi gặp nucleotit không có nhóm 3’OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại), người ta sử dụng dideoxynucleotit (là những phân tử đường bị mất hai nguyên tử oxy ở vị trí C2 và C3) để làm ngừng các mạch đơn đang được tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn oligonucleotit dài ngắn hơn nhau một nucleotit, có thể nhận biết được bằng phương pháp điện di. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động : Máy hoạt động dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy, chùm tia laser trên máy đánh dấu vị trí và thời gian đi qua của các nucleotit, từ đó cho biết kết quả trình tự gen. Ngoài ra, máy còn đọc trình tự trên cả hai mạch đơn, do đó có thể phát hiện và làm giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Do giải trình tự gen bằng máy tự động có nhiều ưu điểm như: cho kết quả nhanh, độ chính xác cao, ít công đoạn chuẩn bị nên chúng tôi đã dùng công cụ này trong nghiên cứu đề tài. 4.2. ứng dụng của nghiên cứu đa dạng trình tự nucleotit: Ngày nay, việc áp dụng đọc trình tự nucleotit đã mang lại những thành tựu to lớn trong các lĩnh vực như nông, lâm, ngư nghiệp và đặc biệt là con người. Nhờ sự ra đời của kỹ thuật di truyền, trong điện di trọng trường (pulse fiesld electrophoresis) cho phép tách các đoạn ADN dài cả triệu nucleotit. Cuối năm 1989 ở Mỹ, chương trình xác định trình tự nucleotit của bộ gen người (Human Genome Project) với chi phí 3 tỉ USD đã được bắt đầu và đến năm 2003 đã cơ bản được hoàn thành. Hiện nay, trên thế giới có tổng cộng hơn 80 phòng thí nghiệm lớn tham gia vào chương trình bộ gen người. Tuy đã đạt được những kết quả quan trọng như tạo dòng 2375 gen của bộ não người vào năm 1992, nhưng vẫn còn nhiều khó khăn lớn. Sự can thiệp của tin học đã giúp rút ngắn đáng kể thời gian của một số phân đoạn trong đọc trình tự gen (Phạm Thành Hổ, Nxb Giáo dục, 1998) Một trong những bước tiến dài trong xác định trình tự nucleotit của bộ gen người là việc sử dụng các EST (Expressed Sequence Tags) để chuyển mRNA thành các đoạn cDNA bằng khuếch đại nhờ kỹ thuật PCR. Nhờ kỹ thuật này, sự biểu hiện của các gen ở các mô đặc hiệu được ghi nhận. Ưu thế của xác định trình tự nucleotit bằng EST là chỉ các gen biểu hiện ở một loại mô chuyên biệt được phát hiện (nhờ xác định mRNA trưởng thành và phiên mã ngược thành cDNA), Trình tự cDNA được gắn vào các véctơ plasmit để tách dòng. Sự lựa chọn các dòng để xác định trình tự nucleotit và sự so sánh tiếp theo cho phép đánh giá mức độ biểu hiện của gen ở các mô khác nhau. Sự dò theo các EST giúp xác định sự phân bố các gen mã lên các nhiễm sắc thể, xây dựng bản đồ di truyền và vật lý của bộ gen người, cũng như thực vật và xác định rõ các gen gây bệnh (Adams và cs, 1992). Lần đầu tiên, việc áp dụng EST được sử dụng vào lúa vào năm 1992 (Uchimiya và cs, 1992). Sau đó chúng được áp dụng rỗng rãi cho việc đọc trình tự của lúa (Sasaki và cs, 1994; Yamamoro, 1997). Cho tới nay có khoảng 12000 ESTs một vùng dữ liệu trong ngân hàng gen (Tarchini 2002). 4.3. Đọc trình tự genome Trình tự genom đã đưa ra đầy đủ các thông tin về kích thước cũng như sự liên kết các genome lúa. Đó là một sự thành công trong việc khám phá ra các gen lúa, các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống, lập bản đồ gen và tính trạng điều khiển của các gen liên kết. Chúng có thể giúp ta so sánh về mối quan hệ giữa genome của lúa và các giống cây trồng khác. Vào tháng 4 năm 2002, hai bên phác thảo về trình tự genome của lúa ở hai nhóm Japonica và Indica ở hai nhóm đã được đọc trình tự (Goff và cs, 2002; Yu và cs, 2002). Trong kết quả này, họ đã thấy rằng nhóm Japonica, Nipponhare chứa 93% của 420Mb genome (Goff và cs, 2002). ở đây, họ đã phân biệt được chúng có kháng 32000-150000 gen khác nhau và hầu hết là protein (98%) và chúng có sự tương đồng so với một số loại cùng ngũ cốc khác như ngô, lúa mì và lúa mạch. Xét về nhóm Indica, chúng có khác một chút so với nhóm Japonica, có khoảng 466 Mb trình tự genome và khoảng xấp xỉ từ 45022-55615 gen khác nhau (Yu và cs, 2002; Sasaki và cs, 2002; Feng và cs, 2002). Chương 2. vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu này gồm 35 giống lúa ở Việt Nam được lấy từ Viện Di truyền Nông nghiệp. Bảng 1. Tên các giống lúa dùng trong nghiên cứu Stt Tên giống Loài Khỏng đạo ụn 1 Nếp cái mùa Japonica Chưa biết 2 Xuân Dài Tám Thơm Japonica Nhiễm 3 Dự đột biến Japonica Kháng 4 ST7 Indica Chưa biết 5 AC Indica Chưa biết 6 R527 Indica Kháng 7 DT5 Indica Chưa biết 8 DT10 Indica Chưa biết 9 DT11 Indica Kháng 10 DT12 Indica Chưa biết 11 DT13 Indica Chưa biết 12 DT14 Indica Chưa biết 13 DT15 Indica Chưa biết 14 DT17 Indica Chưa biết 15 A20 Indica Chưa biết 16 Dự Indica Chưa biết 17 DT23 Japonica Nhiễm Stt Tên Loài Kháng đạo ôn 18 Sóc Trăng Indica Kháng 19 CR203 Indica Kháng 20 Tám Thơm đột biến Japonica Nhiễm 21 ST4 Indica Kháng 22 C71 Indica Chưa biết 23 Nàng Thơm Japonica Kháng 24 DV2 Japonica Chưa biết 25 DT25 Indica Chưa biết 26 375 Japonica Chưa biết 27 Chân Hải Phòng Japonica Kháng 28 Soan Hà Bắc Japonica Kháng 29 Q5 Indica Chưa biết 30 Khang Dân Indica Kháng 31 DT22 Japonica Chưa biết 32 346 Japonica Chưa biết 33 Nếp Hoa Vàng Japonica Chưa biết 34 CL8 Indica Chưa biết 35 DT2001 Indica Chưa biết Hoá chất : Đệm chiết ADN 0,1M Tris-HCl (pH=8) 0,05M EDTA 0,5M NaCl 0,7% b-Mercaptol Ethanol Đệm CTAB 0,2M Tris-HCl (pH=7,5) 0,05M EDTA 2M NaCl 2% (w/v) CTAB Dung dịch10% SDS Isopropanol Ethanol tuyệt đối Ethanol 100% và Ethanol 70% Chloroform: Isoamylalcohol = 24 : 1 RNase (10mg/ àl) Dịch TE ( Trộn dung dịch 1M Tris pH=8 với dung dịch 0,5M EDTA với tỉ lệ 10 : 1) TAE 1X 2.2. nội dung nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số Kiểm tra chất lượng và độ tinh sạch ADN tổng số Tiến hành phản ứng PCR. Phân tích sự tương đồng gen kháng sau khi sử dụng đọc trình tự nucleotit của các giống lúa Việt Nam. 2.3. phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Tách ADN của lúa Chúng tôi đã sử dụng phương pháp CTAB (Sagha- Marool, 1984) có cải tiến để tách chiết ADN từ lúa. Phương pháp này có ưu điểm là giữu được ADN khá nguyên vẹn do dùng CTAB để liên kết với ADN loại bỏ protein. Qui trình tách chiết như sau : - Nghiền 2g lá lúa (thu lúc 2-3 tuần tuổi) với nitơ lỏng trong ống Eppendof 2ml thành dạng bột mịn với cối và chày chuyên dụng. - Thêm 1ml dung dịch đệm chiết và 50 àl 10% SDS, trộn đều cho dung dịch ngấm vào mẫu. Nếu tách nhiều mẫu thì sau khi nghiền mẫu và dung dịch đệm chiết ta cắm vào đá, chờ nghiền đủ mẫu mới chuyển sang bước sau. - ủ mẫu ở nhiệt độ 650C trong 30 phút.Trong quá trình ủ thường xuyên lắc trộn (5 phút một lần) để quá trình chiết xảy ra hoàn toàn. - Ly tâm mẫu ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C sau đó chuyển dịch trong ở phía trên sang ống Eppendof mới. - Thêm vào ống một thể tích tương ứng isopropanol lạnh để kết tủa axitnucleic, lắc nhẹ nhàng và giữ lạnh trong 10-15 phút. - Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch trong và thu tủa, hoà tan tủa trong 400 àl TE. - Xử lý ARN bằng cách thêm 1àl RNAse 10mg/ml và ủ ở 370C 30 phút. - Thêm 400àl đệm CTAB, trộn đều và ủ ở 650C trong 15 phút, trong quá trình ủ lắc trộn nhẹ nhàng để để phản ứng xảy ra triệt để. - Thêm 800 àl Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1) và lắc trộn nhẹ nhàng để tinh sạch ADN. - Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút, chuyển phần dịch trong phía trên sang ống Ependof mới. - Thêm một lương Ethanol tuyệt đối bằng 2 lần thể tích dịch trong ống Eppendof, lắc trộn nhẹ nhàng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10-15phút - Ly tâm ở 40C với tốc độ 12000 vòng/ phút, loại bỏ phần dịch giữ lại tủa. - Thêm 400àl Ethanol 70% để rửa tủa, lắc nhẹ nhàng. - Ly tâm 12000 v/p, loại cồn lấy tủa, làm khô tủa (bằng máy hoặc ở nhiệt độ phòng). - Hoà tan tủa trong 200àl nước cất khử trùng (để làm ngay) hoặc trong 50-100àl dung dịch 1xTE (giữ để làm sau). 2.3.2. Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của ADN Để xác định độ tinh sạch của ADN chúng tôi đo chỉ số OD của ADN ở 2 bước sóng 260nm và 280 nm và tính kết quả tỉ số OD260/ OD280. Để xác định nồng độ axit nucleic thu được ta điện di mẫu trong gel agaroza 0,8% cùng với những mẫu lADN chuẩn đã biết trước nồng độ, các mẫu lADN chuẩn được pha với các nồng độ khác nhau. Sau đó ta so sánh mẫu ADN tổng số với các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ, từ đó suy ra một cách tương đối nồng độ của các mẫu tách chiết. Để xác định một cách chính xác ta đo chỉ số OD của ADN tổng số bằng máy quang phổ ở bước sóng 260nm. Kết quả được tính toán dựa trên phần mềm Spectrophomoter Hitachi U2000. 2.3.3. Tiến hành phản ứng PCR. Bảng 2.Thành phần của một phản ứng PCR TT Thành phần Nồng độ Thể tích (àl) 1 H20 10,5 2 MgCl2 25mM 5,0 3 Đệm PCR 10X 2,5 4 Mồi I 33ng/àl 2,0 5 Mồi II 33ng/àl 2,0 6 dNTP 5mM 1,0 7 Enzym Taq 2 đơn vị 1,0 8 ADN khuôn 50ng/àl 1,0 9 Tổng số 25,0 Bảng 3: Các bước chạy PCR Các bước Nhiệt độ ( 0C) Thời gian ( phút) Số chu kỳ I 94 5 1 94 1 II 45 1 34 72 2 1 III 72 10 IV 4 2.3.4. Điện di: Chuẩn bị gel Agaroza0,8%: - Cân 0.8g agaroza vào bình đựng 100ml dung dịch 1XTAE - Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất - Để nguội đến 50- 600C, thêm 5àl Ethidium Bromide và lắc đều - Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agaroza vào khay đã được chuẩn bị trước sao cho không để lại bọt khí. - Chờ đến khi gel đông cứng rồi tra vào mỗi giếng 5àl mẫu (gồm 2à AND và 3àl Ethidium Bromide). Chạy điện di 120 V trong khoảng 4h. Lấy gel ra soi gel bằng đèn tử ngoại và chụp ảnh. 2.3.5. Phân lập các mảnh ADN từ sản phẩm PCR Sau khi phản ứng PCR, những băng ADN muốn tách được cắt bằng dao chuyên dụng sạch thành nhiều mảnh nhỏ và được đưa vào ống ly tâm nhỏ vô trùng. Thêm vào đó một lượng dung dịch đệm (Gene- Spin 1.4.3 DNA extraction Protect), tuỳ thuộc vào trọng lượng của gel mà cho dung dịch đệm tương ứng (100àl binding buffer với 100mg gel) và đun cho nóng chảy ở 600C trong 5 phút đến 15 phút hoặc lâu hơn cho đến khi hỗn hợp hoà tan hoàn toàn. Tiếp theo đưa những ống chuyên dụng (spin column) đựng hỗn hợp vào trong máy ly tâm và ly tâm khoảng 12000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển ống ra ngoài, loại bỏ phần lọc. Thêm 500àl dung dịch (binding solution) vào mỗi ống, ly tâm 12000vòng/phút trong 1 phút, sau đó chuyển ống (column) sang một ống mới. Thêm 700àl dung dịch rửa (washing solution) vào mỗi ống và ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần lọc và ly tâm tiếp 12000vòng/phút trong 3 phút để loại bỏ phần sót lại của ethanol, ủ ống ở 37-600C trong 5 phút để làm khô ethanol trước khi làm sạch ADN. Chuyển ống (column) sang một ống ependof mới, thêm 30 àl dịch hoà tan (Elution buffer với pH>7) hoặc đệm TE, ly tâm 12000vòng/phút trong 1 phút, lượng ADN hoà tan để đọc trình tự. 2.3.6. Tách dòng và đọc trình tự ADN Các đoạn ADN đã tách dòng được đọc trình tự bằng phương pháp chuỗi kết thúc Big Dye deoxy trên phần mềm ABIRPISM 3100 Gennetic Analyzer. Cặp mồi được sử dụng là: T7 : (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’) và M13 : (5’-TGTAAAAACGGGCCGAT-3’) 2.3.7. Kết quả phân tích trình tự và cấu trúc sơ đồ hình cây Dữ liệu trình tự được phân tích bằng phần mềm DNA Star (Hitachi, Clifornia, USA). Những ADN tương đồng được biểu diễn với thuật toán BLAST của NCBI (2003). Trình tự nucleotit được liên kết bằng việc sử dụng CLUSTALX.1 (8.1). Ma trận khoảng cách gen được tính toán từ MeGalig của phần mềm DNA Star và sơ đồ hình cây sử dụng TREEVIEW trong Mega2. Chương 3. kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ảnh 1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của 35 giống lúa M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001). Kết quả điện di cho thấy, ADN tổng số ở các giống lúa đều có nồng độ cao, ít bị gãy và có thể sử dụng vào phản ứng PCR. 3.2. Nhân bản PCR vùng tương đồng gen kháng ở lúa với các mồi vùng NBS- LRR Sử dụng 4 cặp mồi khác nhau ta có thể nhân bản 35 đoạn gen có chứa vùng NBS – LRR của 35 giống lúa khác nhau từ ADN tổng số bởi phương pháp PCR. Với 2 cặp mồi F11&R16 (ảnh 2) và F11&R18 (ảnh 3), xuất hiện một băng chính có kích thước khoảng 200 bp và vài băng mờ xấp xỉ khoảng 400- 2500 bp có thể quan sát được. Với hai cặp mồi khác là F11&R11 (ảnh 4) và LM637 & LM638 (ảnh 5) cho kết quả trên băng chính cỡ 500 bp. Trong cặp mồi F11&R11 có một băng chính khác cỡ 1000 bp cũng được nhân bản (ảnh 4). Với những băng có kích thước xấp xỉ 500 bp thì trình tự của chúng tương đồng với trình tự của các gen N của cây thuốc lá (Nicotin), L6 của cây lanh (Flax) và RPS2 của cây Arabidopsis. Tất cả chúng đều chứa vị trí liên kết nucleotit và các vùng giàu leucin (NBS - LRR). Dựa trên kết quả đó chúng tôi nhận thấy rằng, với hai cặp mồi F11&R11 và LM637 & LM638, chúng mang các băng chính có kích thước từ 502-517 bp sau phản ứng PCR, chính vì vậy mà các băng này sẽ được sử dụng để tách dòng và đọc trình tự. Tuy nhiên, với hai cặp mồi F11&R16 và LM637 & LM638, cặp mồi F11&R16 không tương đồng với trình tự NBS- LRR sau khi đọc trình tự và đem so sánh trên BLAST. Trình tự của chúng giả thiết như là trình tự mã hoá protein hoặc không phải protein. Chỉ duy nhất đoạn băng có trọng lượng phân tử 500 bp của cặp mồi LM637 & LM638 xuất hiện trình tự tương đồng với trình tự NBS- LRR, vì vậy mà nó được sử dụng để nghiên cứu trong đề tài này. ảnh2. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi F11&R16 M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001). ảnh 3. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi F11&R18 M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23- Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001). ảnh 4. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi F11&R11 M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001). ảnh 5. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi LM637 & LM638 M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001). Sequences producing significant alignments: Score Value (bits) gi|7248825|gb|AAF43678.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 342 2e-93 gi|7489508|pir||T02224 NBS-LRR type resistance protein - ri... 337 6e-92 gi|21635120|gb|AAM69498.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 333 7e-91 gi|21635148|gb|AAM69504.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 333 9e-91 gi|21635156|gb|AAM69507.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 323 5e-88 gi|21635150|gb|AAM69505.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 279 9e-86 gi|21635144|gb|AAM69503.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 270 2e-85 gi|21635169|gb|AAM69510.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 291 1e-80 gi|21635112|gb|AAM69496.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 275 2e-73 gi|21635117|gb|AAM69497.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 241 3e-70 gi|29837761|gb|AAP05797.1| putative disease resistance comp... 189 1e-47 gi|7489510|pir||T02227 NBS-LRR type resistance protein - ri... 139 2e-32 gi|7489511|pir||T02228 NBS-LRR type resistance protein - ri... 137 6e-32 gi|20146399|dbj|BAB89180.1| disease resistance protein -lik... 125 4e-28 gi|28371840|gb|AAO38218.1| RCa7 [Manihot esculenta] 122 2e-27 gi|7248755|gb|AAF43652.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 120 1e-26 gi|22947589|gb|AAN08158.1| putative citrus disease resistan... 119 2e-26 gi|7248746|gb|AAF43648.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 119 3e-26 gi|30408013|gb|AAP30051.1| RCa6.1 NBS type resistance prote... 119 3e-26 gi|22652524|gb|AAN03738.1|AF456243_1 NBS-LRR-like protein [... 119 3e-26 gi|15487848|gb|AAL00974.1|AF402698_1 NBS/LRR resistance pro... 119 3e-26 gi|28371838|gb|AAO38217.1| RCa6 [Manihot esculenta]… 118 3e-26 gi|15487967|gb|AAL01029.1|AF402762_1 NBS/LRR resistance pro... 117 6e-26 gi|7489501|pir||T02213 NBS-LRR type resistance protein - ri... 117 6e-26 gi|15487913|gb|AAL01003.1|AF402734_1 NBS/LRR resistance pro... 117 3e-26 gi|7248773|gb|AAF43661.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 117 e-26 gi|15487852|gb|AAL00976.1|AF402700_1 NBS/LRR resistance pro... 117 8e-26 gi|15487973|gb|AAL01032.1|AF402765_1 NBS/LRR resistance pro... 117 8e-26 gi|22652532|gb|AAN03742.1|AF456247_1 NBS-LRR-like protein [... 117 8e-26 gi|7489401|pir||T04394 NBS-LRR type resistance protein - ba... 115 2e-25 gi|7248781|gb|AAF43665.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 115 2e-25 gi|27463527|gb|AAO15846.1| resistance protein KR4 [Glycine ... 115 2e-25 gi|16933577|gb|AAL30114.1| resistance gene analog [Solanum ... 115 2e-25 gi|28300299|gb|AAO37645.1| NBS-LRR resistance protein RGH1 ... 115 3e-25 Hình 4: Trình tự sau khi so sánh trên chương trình BLAST 3.3. Mối quan hệ giữa các nhóm gen kháng sử dụng trình tự nucleotit. Có tổng cộng 35 gen NBS-LRR được phân tích bởi trình tự ncleotit và được chia làm 3 nhóm theo sơ đồ hình cây (ảnh 6). Tỉ lệ phần trăm của mỗi nhóm là : Nhóm I – 37%, nhóm II – 34%, nhóm III – 28%. Nhóm I có 12 tiểu nhóm khác nhau được gọi là nhóm A, bao gồm A1 (DT 14); A2 (Nàng Thơm); A3 (DT5); A4 (Khang dân); A5 (Dự); A6 (ST4); A7 (IRAQ); A8 (A20); A9 (Soan Hà Bắc); A10 (Chân Hải Phòng); A11 (AC); A12 (CT71 và 346). Nhóm này liên kết gần nhau từ 99% tới 100% tương đồng giữa các tiểu nhóm. (Bảng 4) Nhóm II được chia thành 2 tiểu nhóm, tiểu nhóm B (R527 và Xuân Dài Tám Thơm) và tiểu nhóm C (DT11, Q5, CL8, DT17, DT12, Nếp hoa vàng, DT13, Tám Thơm đột biến, Dự đột biến, 375). Tiểu nhóm C lại được chia làm hai nhóm nhỏ hơn là Ca (DT11) và Cb (Q5, CL8, DT17, DT12, DT13, Nếp hoa vàng, Tám Thơm đột biến, Dự đột biến, 375). Trong nhóm Cb có hai nhóm nhỏ chính bao gồm Cb1( DT17, DT12, với Q5 và CL8 trong cùng một nhóm có tỉ lệ tương đồng là 99,8%) và Cb2 (Nếp hoa vàng, DT 13, Tám Thơm đột biến, Dự đột biến và 375). Trong nhóm II tỉ lệ phần trăm tương đồng của các tiểu nhóm khác nhau là từ 80% tới 100%.(Bảng 4) Nhóm cuối cùng (III) được chia làm 9 tiểu nhóm khác nhau, bao gồm D1 (CR203); D2 (DV2); D3 (DT2001); D4 (DT10); D5 (DT22); D6 (DT15); D7 (Nếp cái mùa); D9 (DT25 và Sóc Trăng) và tỉ lệ tương đồng từ 70,1% đến 100% (Bảng 4). ảnh 6. Sơ đồ hình cây dựa trên sự so sánh trình tự nucleotit của 35 gen NBS-LRR của 35 giống lúa. A, B, C, D là các nhóm phụ khác nhau. Bảng 4. Tỉ lệ phần trăm sự giống nhau của 35 gen NBS-LRR sử dụng trình tự nucleotit 3.4. Mối quan hệ giữa các giống kháng và nhiễm sử dụng trình tự nucleotit. Sự so sánh giữa các giống kháng và nhiễm với nấm đạo ôn (Pyricularia grisea) bằng sử dụng trình tự nucleotit cho thấy rằng chúng có thể chia làm hai nhóm chính, các giống nhiễm được được sắp xếp trong nhóm I và nhóm III. Trong nhóm I có 5 giống nhiễm được chia làm 4 nhóm nhỏ khác nhau, bao gồm: A2 (Nàng Thơm); A4 (Khang dân); A6 (ST4); A9 (Soan Hà Bắc); A10 (Chân Hải Phòng). Có 4 giống nhiễm khác được sắp xếp khác nhau trong các tiểu nhóm của nhóm III gồm: D1 (CR203); D5 (DT22); D8 (DT23) và D9 (Sóc Trăng). Tỉ lệ tương đồng giữa các tiểu nhóm rất cao: từ 99%- 100% ở nhóm I và 70,1%- 100% ở nhóm III (Bảng 4). Các giống kháng chỉ được sắp xếp trong nhóm II và chia thàmh 4 tiểu nhóm. Những tiểu nhóm này bao gồm: B (R527 và Xuân Dài Tám Thơm); Ca (DT11); Cb2 (Tám Thơm đột biến và Dự đột biến). Trong nhóm này tỉ lệ các tiểu nhóm tương đồng xấp xỉ từ 81,1% đến 99,8% (Bảng 4). Phần lớn các giống lúa khác nhau ở Việt Nam được phân loại qua việc sử dụng chỉ thị hình thái (Trịnh, 1995). Do vậy các cây lúa có kiểu gen khác nhau có thể được so sánh khác nhau khi mà chỉ thị hình thái có thể sử dụng được. Mặt khác, sự cùng khác nhau có thể được đặt cho những tên khác nhau. Trong bài khoá luận này, việc sử dụng trình tự nucleotit với các cặp mồi giúp ta tìm được một số giống lúa có tên khác nhau nhưng khoảng tỉ lệ phần trăm tương đồng là cao, điều đó chỉ ra khả năng của mối quan hệ gần gũi giữa chúng. Kết luận và đề nghị Kết luận 1) Khi sử dụng 4 cặp mồi F11&R11, F11&R16, F11&R18, LM637&LM638 để nhân bản các vùng NBS-LRR của 35 giống lúa ta thấy chỉ có cặp mồi LM637&LM638 tạo các băng ADN khỏng 500bp có trình tự tương đồng với vùng NBS-LRR, điều đó cho thấy chỉ có cặp mồi LM637&LM638 phù hợp trong việc nhân bản PCR các vùng tương đồng gen kháng. 2) Sự tương đồng trong 3 nhóm sản phẩm PCR thu được là rất cao: nhóm I (99%-100%), nhóm II (80%-100%), nhóm III (70%-100%), điều đó cho thấy mỗi nhóm đều có chung một vùng trình tự NBS-LRR điều khiển kháng một bệnh riêng. 3) Nhóm giống kháng và nhiễm đều có tỉ lệ tương đồng trong nhóm rất cao chứng tỏ các giống trong mỗi nhóm có quan hệ rất gần gũi. 4) Qua nghiên cứu chúng tôi đã xác định được các giống nhiễm là Nàng Thơm, Khang Dân, ST4, Soan Hà Bắc, Chân Hải Phòng, CR203, DT22, DT23, Sóc Trăng và các giống kháng là Dự đột biến, Tám Thơm đột biến, R527 và Xuân Dài Tám Thơm. Đề nghị Tiếp tục sử dụng trình tự nucleotit