Đề tài Phân tích sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn rễ cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l.) harms) trồng tại An Giang

hóa học. Việc xác định này được gọi là “Phân tích thành phần hóa thực vật”. Trong phân tích thành phần hóa thực vật, người ta thường sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng cho một nhóm hợp chất để xác định sự có mặt của nhóm hợp chất này trong nguyên liệu thực vật. Việc phân tích này được tiến hành theo 2 bước: Phân tích sơ bộ: Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành một vài phân đoạn đơn giản bằng cách sử dụng các quy trình chiết đơn giản, trong những điều kiện nhất định (dung môi, pH môi trường v.v). Định tính nhanh các hợp chất trong các phân đoạn bằng một số thuốc thử chung. Định tính xác định: Dùng các quy trình chiết đặc hiệu hơn, nhiều phản ứng đặc hiệu hơn để xác nhận sự có mặt của nhóm hợp chất. Không phải tất cả các nhóm hợp chất trong dược liệu đều có thể được định tính. Phân tích thành phần hóa thực vật chỉ có thể xác định một số nhóm hợp chất phổ biến trong thực vật. Ở mức độ cao hơn, việc định tính các nhóm hợp chất bằng các phương pháp khác nhau như: Các phương pháp sắc ký kết hợp với định tính hóa học, kết hợp với phân tích quang phổ cũng có thể được sử dụng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học (thường được gọi là phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật) dựa trên nguyên tắc: 29 Phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành những phân đoạn đơn giản. Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (thường là các phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết. Kết quả của các phản ứng đặc trưng, đặc biệt là các phản ứng màu, phụ thuộc nhiều vào mức độ “tinh khiết” của nhóm chất đó trong môi trường phản ứng. Phản ứng của một hợp chất hay một nhóm hợp chất “tinh khiết” có thể khác biệt nhiều hay ít, đôi khi khác biệt hoàn toàn với phản ứng của nó trong một hỗn hợp. Trong hỗn hợp, các nhóm hợp chất ảnh hưởng đến kết quả phản ứng của một nhóm hợp chất khác thường được xem là các “tạp chất”. Các “tạp chất” này có thể ảnh hưởng đến kết quả định tính theo hai hướng: - Cản trở phản ứng, làm cho phản ứng khó xảy ra hay không thể xảy ra. - Cản trở việc nhận định kết quả phản ứng do bản thân chúng che lắp kết quả phản ứng hay chúng cũng phản ứng với thuốc thử và tạo ra sản phẩm che lắp kết quả. Vì thế, việc tách các chất có trong nguyên liệu thực vật thành các phân đoạn có các thành phần đơn giản trước khi tiến hành định tính là cần thiết để có thể thu được một kết quả tốt. Trong phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vât, tách các phân đoạn đơn giản chủ yếu dựa vào tính tan của các nhóm hợp chất trong các môi trường (dung môi, pH) khác nhau. Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành các nhóm theo độ phân cực của chúng. Thông thường chúng được phân thành 3 nhóm: - Nhóm các chất không hoặc kém phân cực. - Nhóm các chất có độ phân cực trung bình. - Nhóm các chất có độ phân cực mạnh. Trong một số trường hợp, sự thay đổi mức độ ion hóa của phân tử (dẫn tới thay đổi tính tan) của một nhóm chất trong môi trường acid hay base cũng được dùng để tách các phân nhóm. Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính một hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện. Chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. Có một số quy trình khác nhau để định tính các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật. Các quy trình khác nhau chủ yếu ở việc sử dụng dung môi để chiết tách hỗn hợp và số lượng các nhóm hợp chất được định tính. Một số quy trình phân tích được sử dụng trong sàng lọc các chất vô cơ và hữu cơ đã được sử dụng từ lâu trong các phòng thí nghiệm là quy trình phân tích của Stas - Otto. 30 Quy trình này sử dụng chủ yếu cho các hỗn hợp các chất tổng hợp. Các quy trình phân tích được sử dụng trong phân tích thành phần hóa học của các thực vật có thể kể là quy trình phân tích của Puri (Hungari), của Schreiber (Đức) và quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) v.v Trong các quy trình trên, quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) thường được dùng vì những ưu điểm của nó so với các quy trình khác. Nó xác định được nhiều nhóm hợp chất trong nguyên liệu thực vật, cách thực hiện không quá phức tạp và có thể tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn, với một lượng nguyên liệu nhỏ (khoảng 5 - 25 g). Kết quả có thể cho một khái niệm về thành phần hóa thực vật của một dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). 2.3. Một số phương pháp chiết tách Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên. Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem những chất này có hoạt tính sinh học. Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết > 95 % mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp quang phổ hiện đại. Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem xét có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn. Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh vật. Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: Thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi có điều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự nhiên và những chất này có cùng hàm lượng hay không. Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít 31 hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng. Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: Dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm của quá trình chiết mà người ta phân ra: - Chiết lỏng - lỏng (phân bố lỏng - lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố. - Chiết rắn - lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi. Trong chiết rắn - lỏng, chất tan có thể đi vào dịch chiết bằng sự hòa tan đơn giản, nhưng cũng có thể chịu sự tác động bởi nhiều các quá trình khác như khi chiết các chất tan từ một Dược liệu. Trong quá trình chiết thông thường, các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi trong điều kiện như nhau. Các chất tan hòa tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên dịch chiết, sự hòa tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan. Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (các mô tế bào động, thực vật và vi sinh vật), các chất nằm bên trong các tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất tan sau khi hòa tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi các mô để đi vào dịch chiết. Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được gọi là quá trình “chiết xuất” (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ eter dầu hỏa) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo), dung môi phân cực trung bình (thí dụ như dietyleter, chloroform) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter - O -, aldehyd - CH = 32 O, ceton - CO -,) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ metanol) hòa tan các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức - OH, - COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K. K = 𝐶𝑎 𝐶𝑏 Ca= Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng. Cb= Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ, tinh chế hóa một hợp chất nào đó. Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân bố tương đối lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác thì có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó. Hằng số của chất tan tương đối ít thay đổi theo nhiệt độ hoặc nồng độ của chất tan đó có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên hằng số này thay đổi nhiều tùy thuộc vào dung môi (độ phân cực, đặc tính ái nước của dung môi) và dung dịch nước. Riêng với dung dịch nước, pH của dung dịch có những ảnh hưởng rất quan trọng, nhất là ở pH acid yếu và ở pH base yếu. Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước. Sử dụng các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau. Và còn tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hay ở lớp dưới so với pha nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực hơn thí dụ như: Ether dầu hỏa hoặc hexan, ether etyl, chloroform, ethyl acetat, n-butanol Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến không còn chất hòa tan vào dung môi thì chuyển sang chiết với dung môi có độ phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan với nước như: Na2SO4, MgSO4, CaSO4,, loại dung môi (bằng cách cô thu hồi dung môi) và cuối cùng là thu được cao chiết. Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn ở lại trong pha nước.thì ta có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM); 33 trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Song song đó, chúng ta cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên một tấm kiếng sạch, sau khi đuổi bay hết dung môi, thì giọt dung dịch lần thứ n đó không còn để lại vết nào trên tấm kiếng đó. Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng - lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi cũng sẽ tăng lên và những nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều sự thay đổi. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng sẽ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa acetonitril và nước, một lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) sẽ làm dung dịch này tách thành 2 lớp; độ hòa tan của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng Một số phương pháp chiết rắn - lỏng: - Kỹ thuật chiết ngấm kiệt. - Kỹ thuật chiết ngâm dầm. - Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet. - Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Kumagawa. - Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước. - Chiết các nguyên liệu tươi. - Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt. Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. 34 Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn. Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt v.v có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết. Quá trình ngấm kiệt được thực hiện trong bình chiết được gọi là bình ngấm kiệt. Hình dạng, cấu tạo và kích thước của bình ngấm kiệt có thể thay đổi tùy theo mục đích sử dụng nhưng thông thường phần thân chính của bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưu lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu. Quá trình ngấm kiệt có thể được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. Chú ý: Khi ngấm kiệt ở nhiệt độ cao có thể làm tăng tốc độ chiết nhưng có thể dẫn đến phân hủy chất dễ chuyển hóa bởi nhiệt. Có thể thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết trên từng bình ngấm kiệt riêng lẻ hay kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với nhau (ngấm kiệt ngược dòng). Trong ngấm