Đề tài Phương pháp phân tích chuyên dùng trong công nghiệp dầu béo

1 ml dung dịch KOH 0,5N Trường hợp màu dầu thẫm thì dùng chất chỉ thị như trong khi xác định chỉ số axit. Xác định chỉ số iốt (iod value-IV) Chỉ số iốt :là số gam iốt cần thiết bão hòa hết số liên kết đôi của axit béo có trong 1g dầu mỡ, nó biểu thị mức độ không no của dầu mỡ, chỉ số iốt càng cao thì mức độ không no càng lớn và ngược lại. Dựa vào chỉ số iốt người ta có thể phân dầu mỡ làm 3 loại: Dầu khô : I > 130 Dầu bán khô : 85 < I < 130 Dầu không khô : I < 85 Các dầu mỡ thực phẩm thường nằm trong phạm vi nhóm dầu không khô và bán khô (tính khô của dầu mỡ thường biểu hiện khi tiếp xúc với không khí chúng có khả năng tạo thành màng khô có tính đàn hồi, dầu mỡ chứa càng nhiều axit béo không no càng dễ hoá khô. Tính khô của dầu mỡ được ứng dụng nhiều trong kỹ nghệ sơn dầu.) Nguyên tắc : Phương pháp này dựa trên nguyên tắc iôt kết hợp với axit béo ở các vị trí nối đôi. Ở nhiệt độ thường, iôt phản ứng với các axit béo có trong thành phần của chất béo chậm, khi đun nóng thì iôt kết hợp với các nối đôi không đồng đều, không làm no được hoàn toàn các nối đôi. Các halogen khác (Cl2, Br2) phản ứng với axit béo rất mạnh, nên thay iôt bằng các hợp chất của nó với các halogen khác. C = C + I2 C_C hay C_C (Br2) I I Br Br Dùng KI để chuyển hóa Brôm dư thành iôt. 2KI + Br2 2KBr + I2 Dùng Na2S2O3 để định phân iôt dư. Hóa chất : +dung dịch Hanus (10g IBrhòa tan trong 500ml axit axetic đặc). +dung dịch KI 10%. +dung dịch Na2S2O3 0,1N. +dung dịch tinh bột 1%. +clorofom. Dụng cụ, máy móc : +pipet 10ml. +2 bình cầu dung tích 200-300ml có nút nhám. +2 cốc nhỏ đường kính 1-2 cm. Tiến hành: Cân vào lọ nhỏ 0,2g dầu hoặc 4g bơ hoặc mỡ. Chuyển sang bình cầu dung tích 200-300ml có nút nhám. Bình kiểm tra thay chất béo bằng 0,2ml nước cất. Cho thêm 10ml clorofom vào mỗi bình, lắc nhẹ để hòa tan hết chất béo. Cho thêm 15ml dung dịch Hanus, đậy kín bình ngay bằng nút nhám. Lắc cẩn thận bình. Để yên chỗ tối 15 phút (dầu có nhiều axit béo không no thì dđể lâu hơn). Thêm 15ml dung dịch KI 10%, 50ml nước cất. Chuẩn độ iôt giải phóng ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến màu vàng rơm. Thêm 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, 3ml clorofom. Chuẩn độ tiếp cho đến khi dung dịch bị mất màu hoàn toàn. Cho thêm clorofom vào để giải phóng iôt bị hấp thụ trên chất béo (khi chuẩn độ phải lắc mạnh) đồng thời làm thí nghiệm kiểm tra. Tính kết quả: a-số ml dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. b- số ml dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm. c-lượng chất béo (g). f-hệ số điều chỉnh nồng độ Na2S2O3 100-hệ số qui chuẩn cho 100g chất béo. 0,01269-số g iôt tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,1N. Xác đinh chỉ số peroxyt (PoV) Chỉ số peoxyt là số gam iôt được giải phóng ra khi dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác dụng của peroxyt có trong chất béo. PoV là chỉ số chất lượng đặc trưng cho mức độ ôi hóa bằng oxi hóa. Nguyên lý: Ở môi trường axit, peoxyt giải phóng iôt từ muối kali iođua, ở nhiệt độ nóng hoặc lạnh. Chuẩn độ iôt được giải phóng ra thể tự do bằng một dung dịch natri tiosunfat. H H ç ç R1_C_C_R2 + KI +2CH3COOH R1_CH_CH_R2 + 2CH3COOK + H2O + I2 ç ç \ / O_O O 2 Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6 Thuốc thử: +Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay). +Chỉ thị hồ tinh bột 1%. +Dung dịch Na2S2O3 O,01N (pha trước khi dùng từ dung dịch Na2S2O3 0.1N bằng nước cất đun sôi để nguội không chứa CO2). Cách xác định: Lấy 2 bình nón dung tích 250ml. Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2g dầu, bình 2 (bình kiểm tra) 2ml nước cất. Cho thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch hỗn hợp axit axetic và clorofom (tỉ lệ 2:1), 1ml dung dịch KI mới pha (hoặc một ít tinh thể KI), đậy nút. Lắc hỗn hợp cẩn thận và đặt vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm 25ml nước cất. Cho thêm 0,5ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iôt tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu xanh. Tính kết quả : a-số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình thí nghiệm. b-số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình kiểm tra. c-khối lượng chất béo. 0,01269-số gam iôt tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG QUÁT PHÂN TÍCH LIPID Phương pháp để xác định tổng lipid trong thực phẩm: Chất béo tổng được biểu diễn là số gram chất béo trên 100 gram một khẩu phần nhỏ thực phẩm hay trên một muỗng xúp. Những số liệu này thì được xác định bằng cách thủy phân mẫu và phân tích những acid béo riêng lẻ (xem bên dưới). Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định chất béo tổng được chấp nhận bởi các cơ quan có thẩm quyền ở hầu hết các nước (Bảng 5.2). Các phương pháp cũ dùng dung môi để trích ly và đo tổng khối lượng bã lipid còn lại. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời trích ly nhiều mẫu trong cùng một trụ chiết. Để xác định chất béo tổng, ethyl ether (diethyl ether) là những dung môi được lựa chọn vì nó không phân cực và trích ly được hầu hết các chất béo không phân cực: triacylglycerol, sterol, tocopherol,…; trong khí đó lại trích ly kém hiệu quả những chất béo phân cực: glycolipid và phospholipid… Nguyên tắc của định lượng lipid tổng bằng phương pháp Soxhlet: dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được sấy khô, nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi … tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất phần trích ly gọi là lipid tổng hay dầu thô. Một số phương pháp khác được phát triển, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn để trích ly và xác định chất béo tổng. So với phương pháp trích ly bằng dung môi, trong hầu hết trường hợp, số liệu ở cả hai phương pháp thì gần giống như nhau. Phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân cũng được phát triển để định lượng chất béo tổng của một số thực phẩm. Ngoài ra, phương pháp quang phổ cận hồng ngoại cũng được sử dụng như là một phương pháp không phá vỡ cấu trúc để định lượng chất béo tổng. Cả hai phương pháp này được dùng để xác định chính xác hàm lượng vì vậy đòi hỏi dụng cụ và thiết bị phải được đo đạc và chuẩn bị chính xác. Phương pháp để trích ly lipid tổng trong thực phẩm: Quá trình trích ly lipid tổng trong thực phẩm khá đơn giản. Tuy nhiên, do sự đa dạng của các cấu trúc sinh học, thực phẩm và lipid, đạt được sự trích ly chính xác là một việc khá khó khăn. Phương pháp trích ly được mô tả ở trên (dùng dung môi hữu cơ và CO2 siêu tới hạn) tỏ ra hữu hiệu trong việc trích ly triacylglycerol và những lipid không phân cực khác từ thực phẩm có hàm ẩm thấp. Để trích ly lipid tổng (phân cực và không phân cưc), những dung môi phân cực được sử dụng làm chất trích ly (Bảng 5.3). Phương pháp để trích ly lipid tổng phổ biến nhất là phương pháp Folch (Bảng 5.3). Lipid được trích ly từ mẫu (1g) với 20ml chloroform-methanol (2:1 theo thể tích). Sau khi trích ly, 1/5 thế tích nước hay dung dịch muối (0.29%) được thêm vào, hỗn hợp được khuấy và cân bằng. Sau khi cân bằng, hai pha sẽ hình thành, lớp ở đáy bao gồm chloroform-methanol-nước, 86:14:1, và gần như tất cả lipid. Lớp ở trên bao gồm những dung môi giống như vậy theo tỉ lệ 3:48:47 và chứa hầu hết những chất không phải là lipid. Phương pháp này thể hiện tốt nhất nếu tỉ lệ cuối cùng của 3 dung môi, chloroform-methanol-nước, là 8:4:3. Phương pháp Bligh và Dyer được phát triển để trích ly lipid tổng từ cá nhưng nó được tận dụng để trích ly lipid từ mô của nhiều động, thực vật. Phương pháp này được tiến hành bằng cách lấy mô và mô được trích ly theo tỉ lệ 1:2:0.8, chloroform-methanol-nước nội sinh. Sau khi trích ly hỗn hợp một pha, một phần chloroform và nước (0.08% KCl) được thêm vào và khuấy trộn, và sau khi cân bằng, lipid được lấy trong pha ít hơn. Bởi vì một vài mô thực vật chứa những enzyme phân giải lipid hoạt động, sự giảm sút lipid có thể giải quyết bằng cách ngâm mô thực vật trong isopropanol nóng trước khi trích ly bằng chloroform methanol.Gần đây, sự đa dạng của phương pháp này được phát triển, dùng để trích ly lượng mẫu lá lớn để phân tích lipid bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Bởi vì sự quan tâm về sức khoẻ, làm việc với chloroform, phương pháp được phát triển để sử dụng những dung môi ít độc hại hơn như hexane-isopropanol. Phương pháp để phân tách và phân tích định lượng lipid: Phân tách lipid bắt buộc khi chuẩn bị mẫu cho phân tích chất béo. Nó cũng cung cấp thông tin định lượng về thành phần cấu tạo của các lipid khác nhau. Một vài phương pháp đơn giản được phát triển để tách lipid từ lipid tổng, sử dụng sắc kí cột (áp suất thấp). Christie mô tả phương pháp để tách những lipid không phân cực (hydrocarbons, cholesterol esters, triacylglycerols, cholesterol, diacylglycerols và monoacylglycerols) từ lipid trích ly bằng cách sử dụng cột silicic acid và tách rửa bằng dung môi haxane và diethyl ether từ 0 – 100% (bảng 5.4). Bảng bao gồm những chất béo tự do và hydroxyl và được phân tách bằng sắc kí cột áp suất thấp (LC), trích ly pha rắn (SE), sắc kí lớp mỏng (TLC) và sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Những phương pháp tương tự để phân tách chất béo phân cực và không phân cực có thể sử dụng chất hấp phụ như là Florisil hay DEAE cellulose. CE, cholesterol esters FS, free sterol PG, phosphatidylglycerol Ch, cholesterol HC, hydrocarbons PL, phospholipids CSE, cinnamic acid steryl esters MAG, monoacylglycerols SE, sterol esters DAG, diacylglycerols MGDG, monogalactosyldiacylglycerol SG, sterol glycosides DGDG, digalactosyldiacylglycerol PE, phosphatidylethanolamine TAG, triacylglycerols FAMEs, fatty acid methyl esters PC, phosphatidylcholine FFA, free fatty acids PI, phosphatidylinositol Sắc kí lớp mỏng là một kỹ thuật phổ biến để tách các lipid khác nhau. Hiện nay, hầu hết các nhà phân tích sử dụng dĩa TLC được mạ lót vì sự thuận tiện và để tái sử dụng dễ dàng. Mặc dù, trong tương lai, HPLC sẽ thay thế TLC, vài ưu điểm quan trọng của TLC bao gồm: thiết bị đơn giản và rẻ tiền; thuốc thử dạng phun được lựa chọn cung cấp thông tin về cấu trúc rất chính xác. Phương pháp TLC thường dùng để tách những lipid phân cực và không phân cực được nêu ra ở bảng 5.4. Mặc dù hầu hết các nhà phân tích sử dụng TLC một chiều nhưng đôi khi cũng cần thiết để sử dụng TLC hai chiều ( với hỗn hợp dung môi khác nhau cho mỗi chiều) để việc tách lipid hiệu quả hơn. Tuy nhiên, ở một vài trường hợp, chúng ta cũng có thể tách cả lipid phân cực và không phân cực ở cùng một chiều bằng cách sử dụng hai bước kế nhau trong cùng một hướng, với hỗn hợp hai dung môi khác nhau. Phương pháp HPLC :dùng tia UV (bước sóng từ 205 – 210 nm) có thể phát hiện những chất béo chưa bão hoà một cách hiệu quả. Tuy nhiên, định lượng bằng đầu dò UV thì rất khó khăn vì tín hiệu đáp lại của đầu dò thì tỉ lệ với tổng số liên kết đôi carbon-carbon trong lipid. Tương tự, đầu dò UV không thể phát hiện ra những chất béo bão hòa. Trong những năm giữa thập niên 80 của thế kỉ XX, hai loại khác nhau của “máy dò khối lượng” được phát minh, máy dò ion hóa ngọn lửa (FID) và máy dò ánh sáng tán xạ có khả năng làm bay hơi (ELSD). FID thì chỉ được sử dụng trong khoảng thời gian ngắn, các nhà sản xuất hiện tại đang tiếp tục hoàn thiện ELSDs và chúng đã trở thành một công cụ rất hữu hiệu trong việc phân tích lipid. Một vài phương pháp HPLC_ELSD đã phát triển để phân tích định lượng lipid không phân cực (hình 5.3) và lipid phân cực (hình 5.4). Mặc dù sắc kí khí (GC) thì không được sử dụng nhiều để phân tích các loại lipid, một vài phương pháp GC được phát triển để tách những lipid không phân cực (bảng 5.5). Hầu hết các phương pháp này sử dụng nhiệt độ rất cao, và một vài phương pháp đòi hỏi phải trimethyl hóa mẫu để giảm điểm sôi của lipid. Vì hầu hết những phương pháp này thực hiện ở nhiệt độ rất cao, việc tiến hành phải cẩn thận để chắc chắn rằng lipid không bị giảm trong suốt quá trình phân tích. Phương pháp để thủy phân lipid mạch thẳng và phân tích định lượng acid béo và sterol: Những chất béo phức tạp thường được phân tích bằng cách thủy phân liên kết ester với acid béo, và sau đó định lượng chúng với GC. Việc thủy phân được tiến hành trong môi trường kiềm nhẹ (0.5 – 1.5 KOH trong methanol). Sau khi thủy phân, hỗn hợp được acid hóa để tạo thành acid béo. Sau đó chúng được trích ly (được tách từ glycerol, muối, và những chất không lipid khác) bằng cách thêm hexane hay sử dụng những phương pháp trích ly lipid khác (ví dụ như trích ly theo phương pháp Bligh và Dyer). Phương pháp GC để phân tích chất béo thường bắt buộc phải chuyển acid béo tự do thành FAMEs. Nhiều phương pháp GC để phân tích FAMEs được trình bày trong bảng 5.5. Hỗn hợp đơn giản của FAMEs sẽ được tách trên cột không phân cực. Hỗn hợp FAMEs chứa hỗn hợp đa dạng những acid béo (bao gồm hỗn hợp FAMEs mạch ngắn, mạch rất dài hay chưa bão hòa) đòi hỏi phải sử dụng cột phân cực (ví dụ như CP-Sil 88, BPX 70, SP-2340) để tách tốt nhất. Một vài cột GC phân cực cũng có thể tách đồng phân cis và trans. Phương pháp HPLC được phát triển thêm để tách (sử dụng dectetor UV) và phân tích định lượng (sử dụng dectector ELSD) acid béo tự do và FAMEs, nhưng hầu hết nhà phân tích thì nhận định rằng phương pháp GC thì tối ưu hơn. Ngươc lại, phân tích FAMEs của acid béo hydrosy và epoxy thì phương pháp HPLC tỏ ra tốt hơn. Cholesterol và sterol thực vật có thể định lượng bằng GC. Sterol esters được thủy phân trong điều kiện kiềm nhẹ (giống như thủy phân ester của acid béo ở trên), trong khi sterol glycosides phải được thủy phân trong điều kiện acid (4 – 6 M HCl trong methanol) để giải phóng sterol tự do. Những sterol tự do sẽ được trích ly. Chúng có thể định lượng bằng GC (bảng 5.5). Một vài nhà phân tích không dùng phương pháp GC mà những sterol tự do sẽ được acetyl hóa hay TMS để hạ nhiệt độ cột sử dụng. Vì vậy sự phân hủy sterol sẽ được giảm đến mức tối đa trong suốt quá trình phân tích sắc kí. Phương pháp để phân tích định luợng loại phân tử của những lớp lipid khác nhau: Một vài phương pháp HPLC pha đảo (bảng 5.6) được phát triển để phân tách những loại phân tử của triacylglycerols. Trước khi bơm mẫu vào hệ thống HPLC, triacylglycerol tinh khiết (TAGs) phải được chuẩn bị bằng phương pháp phân tích lớp lipid TLC hay HPLC. Nếu hỗn hợp lipid rất phức tạp (ví dụ như dầu cá), TAGs được phân tách trước thành nhiều phần bằng sắc kí ion Ag và những phần nhỏ đó được bơm vào hệ thống HPLC để tạo thành những sắc phổ loại phân tử đơn giản hơn. Một vài phương pháp dùng để tách những loại phân tử của những lớp phospholipids khác nhau. Sau khi tinh sạch những lớp phospholipid riêng rẽ (ví dụ như phosphatidylcholine), những phân tử này được tách với HPLC pha đảo. Những phương pháp này cũng được áp dụng để phân tách những loại phân tử của những lớp lipid khác như sterol esters, galactolipids thực vật và sterol glycosides thực vật. IV.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ 1.Nguyên tắc của phương pháp phân tích Khaùi nieäm: Saéc kyù laø phöông phaùp phaân tích caùc caáu töû coù trong hoãn hôïp döïa vaøo khaû naêng haáp phuï hay phaân boá khaùc nhau cuûa caùc caáu töû giöõa 2 pha: pha ñoäng vaø pha tónh. Saéc kyù khí (Gas Chromatography – GC) laø moät boä phaän cuûa kyõ thuaät phaân tích saéc kyù neân nguyeân taéc cuûa noù cuõng töông töï nhö caùc phöông phaùp phaân tích saéc kyù khaùc nhöng coù moät soá ñieåm khaùc bieät sau: Maãu phaân tích ôû traïng thaùi khí. Pha ñoäng: chaát khí hoaëc ôû daïng hôi. Pha tónh: coù theå goàm 2 loaïi: Pha tónh laø maøng moûng chaát loûng treân beà maët chaát haáp phuï raén: saéc kyù phaân boá hay coøn goïi laø saéc kyù khí – loûng. Pha tónh laø chaát haáp phuï raén: saéc kyù haáp phuï. Hieän nay saéc kyù khí söû duïng pha tónh laø chaát loûng ñöôïc aùp duïng nhieàu trong phaân tích thöïc phaåm. Ñeå phaân tích thaønh phaàn acid beùo thöôøng duøng phöông phaùp saéc kí khí. Hoãn hôïp acid beùo ñöôïc taïo thaønh daãn xuaát methylester tröôùc khi ñöa vaøo phaân tích vì methylester coù nhieät ñoä hoaù hôi thaáp hôn raát nhieàu so vôùi acid beùo töï do. Cuõng coù theå chuyeån acid beùo thaønh etylester nhöng nhieät ñoä hoaù hôi seõ cao hôn. Phaûn öùng chuyeån ester hoaù cuûa glycerid coù theå ñöôïc xuùc taùc baèng acid hay kieàm trong khi phaûn öùng ester hoaù chæ coù theå xuùc taùc baèng acid 2.Thiết bị-Phương tiện: Hệ thống sắc ký khí Cấu tạo của thiết bị: Boä phaän cung caáp khí mang (pha ñoäng): Boä phaän cung caáp khí mang laøm nhieäm vuï cung caáp khí mang cho heä thoáng. Boä phaän tieâm maãu Boä phaän tieâm maãu duøng ñeå ñöa maãu caàn phaân tích vaøo coät saéc kí. Hình: Boä phaän tieâm maãu coù chia doøng Coät saéc kyù :coät saéc kí laø nôi xaûy ra qua trình taùch caùc caáu töû trong hoãn hôïp. Trong kỹ thuật phân tích sắc ký, người ta sử dụng 2 loại cột: Coät nhoài: Laøm baèng kim loaïi. Thöôøng coù ñöôøng kính coät lôùn nhöng chieàu daøi ngaén (0,15 – 0,6mm * 3 – 20ft). Chaát nhoài coät coù theå laø phaân cöïc hoaëc khoâng phaân cöïc. Pha tónh thöôøng ñöôïc gaén treân beà maët trong cuûa oáng nhôø moät phaûn öùng hoùa hoïc. Tính chaát cuûa pha tónh seõ quyeát ñònh tôùi thöù töï phaân tích cuûa caùc acid beùo. Coät mao quaûn: Laø moät oáng silic nung chaûy boïc ngoaøi baèng moät phim polimid chòu nhieät ñeán 370 – 400oC, hoaëc baèng moät lôùp nhoâm chòu nhieät ñeán 480oC. Khoâng coù chaát raén mang. Thaønh coät ñöôïc cheá taïo sao cho pha tónh coù theå traùng moät lôùp moûng ngay treân thaønh coät. Coù daïng hình xoaén. Ñöôøng kính nhoû nhöng chieàu daøi lôùn (0,1 – 0,4mm * 25 – 500ft) Hieän nay, ngöôøi ta hay söû duïng coät mao quaûn thay cho coät nhoài. Boä phaän loø: Boä phaän loø coù chöùc naêng ñieàu nhieät cho caùc boä phaän sau trong heä thoáng saéc kí khí: Boä phaän bôm maãu. Coät saéc kí. Detector. Detector: Coù raát nhieàu loaïi detector ñöôïc söû duïng trong phaân tích saéc kí khí. Tuøy vaøo ñoái töôïng phaân tích maø ta choïn loaïi detector söû duïng cho phuø hôïp. Maùy ghi: Maùy ghi laø nôi nhaän tín hieäu töø ñaàu doø, xöû lyù soá lieäu chuyeån thaønh daïng ñoà thò. Treân ñoà thò coù peak, moãi peak ñöôïc xaùc ñònh baèng thôøi gian löu. 3.Tiến hành thí nghiệm: Chuaån bò metylester baèng xuùc taùc keát hôïp: Nguyeân lyù: Triglycerid ñöôïc chuyeån ester hoaù vôùi metanol trong moâi tröôøng CH3ONa. Acid beùo töï do coøn laïi sau phaûn öùng ñöôïc metylester hoaù baèng moâi tröôøng acid. Saûn phaåm metylester cuûa acid beùo ñöôïc trích ly ra khoûi hoãn hôïp baèng hexan. Duïng cuï, hoaù chaát: Hexan. Dung dòch metanolat natri: Caân 7,5 mg phenolphtalein vaø 1,15 mg Na, hoaø tan vaøo 30 ml methanol vaø 20 ml benzen. Xuaát hieän dung dòch metanolat Natri maøu hoàng coù noàng ñoä 1 mol/l. Dung dòch metanolic HCl: Cho vaøo bình hai coå 30 ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Laép pheãu trích ly coù chöùa 15 ml HCl ñaäm ñaëc vaøo moät coå bình qua nuùt cao su. Ñaàu kia cuûa bình ñöôïc daãn vaøo dung dòch 60ml metanol. Töø töø nhoû HCl vaøo H2SO4 ñaäm ñaëc seõ giaûi phoùng ra khí HCl ñöôïc haáp thuï vaøo metanol. Dung dòch thu ñöôïc coù noàng ñoä khoaûng 10%. Phöông phaùp taïo metylester: Caân chính 20,5 mg lipid, cho vaøo trong oáng nghieäm. Sau ñoù cho vaøo 1 ml hexan vaøo 0,15 ml dung dòch metanolat natri, laéc thaät kyõ trong khoaûng 1 phuùt roài ñeå yeân ôû nhieät ñoä thöôøng trong 30 phuùt. Tieáp theo, cho vaøo 1,5 ml metanolic HCl, laéc thaät kyõ roài ñeå cho phaûn öùng xaûy ra trong 45 phuùt. Sau ñoù ly taâm trong oáng nghieäm 3000 voøng/phuùt. Dung dòch trong oáng nghieäm seõ bò taùch laøm ba pha. Duøng pipet töï ñoäng huùt laáy pha treân cuøng coù chöùa metylester cuûa acid beùo ñem phaân tích treân maùy saéc kí. Chuaån bò metylester baèng xuùc taùc acid: Nguyeân lyù: Triglicerid vaø acid beùo töï do ñöôïc chuyeån ester hoaù (hoaëc ester hoaù) vôùi metanol trong moâi tröôøng HCl. Saûn phaåm metylester cuûa acid beùo ñöôïc trích ly ra khoûi hoãn hôïp baèng hexan. Duïng cuï, hoaù chaát: Hexan Dung dòch metanolic HCl: Cho vaøo bình 2 coå 30 ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Laép pheãu trích ly coù chöùa 15 ml HCl ñaäm ñaëc vaøo moät coå bình qua nuùt cao su. Ñaàu kia cuûa bình ñöôïc daãn vaøo 60 ml metanol. Töø töø nhoû HCl vaøo H2SO4 ñaäm ñaëc seõ giaûi phoùng ra khí HCl ñöôïc haáp thu vaøo metanol. Dung dòch thu ñöôïc coù noàng ñoä khoaûng 10%. Phöông phaùp taïo metylester: Caân 20 mg lipid, cho vaøo trong oáng nghieäm. Sau ñoù cho vaøo 1 ml CH2Cl2 vaø 2 ml metanolic HCl, ñaäy naép oáng nghieäm, laéc thaät kyõ ñeå cho phaûn öùng xaûy ra ôû 500C trong 3 giôø. Sau ñoù cho vaøo oáng nghieäm 1 ml nöôùc caát vaø trích ly metylester taïo thaønh baèng 2 ml hexan. Chuaån bò metylester baèng loø vi soùng: Nguyeân lyù: Vi soùng coù khaû naêng ñaåy nhanh phaûn öùng metylester. Duïng cuï, hoaù chaát: Hexan Dung dòch metaolic HCl Phöông phaùp taïo metylester: Caân 19,8 mg lipid, cho vaøo oáng nghieäm (20*150 mm). sau ñoù cho vaøo 0,5 ml metaolic HCl, ñaäy naép laéc thaät kyõ roài ñeå cho phaûn öùng xaûy ra trong loø vi soùng trong 1 phuùt. Sau phaûn öùng laøm nguoäi oáng nghieäm trong loø vi soùng. Sau ñoù cho vaøo oáng nghieäm 0,5 ml nöôùc caát vaø trích ly metylester taïo thaønh baèng 1 ml hexan. Dung dòch thu ñöôïc ñem phaân tích treân maùy saéc kí. Phaân tích maãu treân maùy: Acid beùo sau khi ñöôïc methyl ester hoùa seõ ñöôïc bôm tröïc tieáp vaøo maùy saéc kyù khí. Söû duïng kim 10µl ñeå bôm maãu vaøo maùy. Löôïng maãu bôm vaøo khoaûng 2 µl. Trình töï phaân tích maãu treân maùy: Khôûi ñoäng maùy. Cho pha ñoäng chaïy. Caøi ñaët chöông trình chaïy saéc kí. Bôm maãu. Tieán haønh chaïy saéc kí. Phaân tích vaø xöû lyù soá lieäu thu ñöôïc. Chöông trình chaïy saéc kí: Coät mao quaûn DB-5 (ID = 0,25nm, l=30m), laø loaïi coät phaân cöïc yeáu. Pha tónh : 100% dimetylpolysiloxane. Pha ñoäng : khí N2. Detector: FID. Tröôùc khi bôm maãu vaøo maùy, thieát laäp ñieàu kieän phaân tích cho maùy: Cheá ñoä bôm maãu : coù chia doøng vôùi split ratio = 1/25. Nhieät ñoä injector : 250oC. Nhieät ñoä detector : 250oC. Löu löôïng H2: 40ml/phuùt. H2 ñöôïc taïo thaønh nhôø maùy taïo H2. Löu löôïng khoâng khí: 400ml/phuùt. Nhieät ñoä coät: 180oC trong 2 phuùt, taêng 2,5oC/phuùt tôùi 205oC, taêng 3,5oC/phuùt tôùi 230oC, döøng 2 phuùt, taêng 5oC/phuùt tôùi 275oC. Cheá ñoä nhieät ñoä quyeát ñònh thôøi gian phaân tích maãu (khoaûng 30 phuùt). Cheá ñoä nhieät ñoä cuûa coät coù theå thay ñoåi nhaèm laøm giaûm nhöõng ñoaïn khoâng xuaát hieän peak treân saéc kyù ñoà, giaûm thôøi gian phaân tích. Trong quaù trình phaân tích phaûi ñaûm baûo vaän toác truyeàn thaúng cuûa khí trong coät laø khoâng ñoåi ñeå peak nhoïn vaø ñoái xöùng. AÙp suaát ñaàu vaøo cuûa khí mang :14psi. 4.Xử lý kết quả thí nghiệm: Thaønh phaàn acid beùo trong daàu ñaäu naønh tinh luyeän (Theo taøi lieäu tham khaûo) Acid beùo Haøm löôïng, % (Tính treân toång löôïng acid beùo) < C14 Caùc acid beùo no coù ñoä daøi maïch cacbon nhoû hôn C14 £ 0,1% 14:0 Acid myristic £ 0,2% 16:0 Acid palmitic 9% ¸ 13% 16:1 Acid palmitoleic £ 0,3% 18:0 Acid stearic 3,0% ¸ 5,0% 18:1 Acid oleic 17,0% ¸ 30,0% 18:2 Acid linoleic 48,0% ¸ 58,0% 18:3 Acid linolenic 5,0% ¸ 11,0% 20:0 Acid arachidic £ 1,0% 20:1 Acid eicosenoic £ 1,0% 22:0 Acid behenic £ 1,0% Töø ñaây ta coù baûng toùm taét sau: Maïch C Haøm löôïng, % < C14 £ 0,1% C14 £ 0,2% C16 9% ¸ 13,3% C18 83,4% ¸ 91% C20 £ 2% C22 £ 1% Nhö chuùng ta ñaõ bieát, khaû naêng taùch cuûa caùc caáu töû trong saéc kí khí phuï thuoäc vaøo: Khaû naêng töông taùc cuûa chuùng vôùi pha tónh vaø pha ñoäng: Neáu coät saéc kí söû duïng laø loaïi coù tính phaân cöïc, thì caáu töû naøo caøng phaân cöïc seõ töông taùc vôùi pha tónh caøng maïnh, caáu töû ñoù seõ bò giöõ laïi laâu hôn trong coät. Ngöôïc laïi neáu coät saéc kí söû duïng laø loaïi coù tính khoâng phaân cöïc, thì caáu töû naøo caøng ít phaân cöïc seõ töông taùc vôùi pha tónh caøng maïnh, caáu töû ñoù seõ bò giöõ laïi laâu hôn trong coät. Nhieät ñoä Do chuùng ta xaây döïng chöông trình nhieät ñoä töø thaáp ñeán cao neân khaû naêng taùch cuûa caùc caáu töû trong hoãn hôïp coøn phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä bay hôi cuûa caáu töû. Caáu töû naøo coù nhieät ñoä bay hôi thaáp hôn seõ bay hôi tröôùc vaø theo pha ñoäng ra ngoaøi tröôùc. Maët khaùc, chuùng ta laïi bieát raèng: Caùc acid beùo coù cuøng soá C, acid beùo naøo coù caøng nhieàu noái ñoâi hôn seõ caøng phaân cöïc. Caùc acid beùo khoâng coù cuøng soá C, acid naøo coù soá C nhoû hôn seõ coù nhieät ñoä bay hôi nhoû hôn, seõ ñi ra tröôùc theo pha ñoäng. Nhö vaäy, döïa vaøo soá C vaø soá noái ñoâi cuûa caùc acid beùo, ñoä phaân cöïc cuûa coät saéc kí, ta cuõng coù theå döï ñoaùn ñöôïc thöù töï cuûa caùc acid beùo treân saéc kí ñoà. Neáu chæ döïa vaøo saéc kí ñoà thu ñöôïc maø khoâng coù saéc kí ñoà cuûa chaát chuaån, ta khoâng theå ñònh tính vaø ñònh löôïng ñöôïc caùc acid be